Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Celem tej metody jest zidentyfikowanie funkcjonalnej łączności sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą fotostymulacji w wycinkach mózgu. Stereotaktyczne ukierunkowanie określonego obszaru mózgu na różne pośredniczone ekspresje światłoczułych kanałów jonowych pozwala na selektywną stymulację światłem aksonów pochodzących z tego regionu. Procedurę zademonstruje Louis Richevaux, doktorant z mojej grupy.

Przed zabiegiem sprawdź, czy zwierzę jest dobrze znieczulone za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Delikatnie wyciągnij język, aby ułatwić oddychanie. Następnie zgol włosy na czaszce.

Wstrzyknij 20 mikrolitrów chlorowodorku lidokainy pod skórę głowy w celu znieczulenia miejscowego i odczekaj pięć minut. Aby odsłonić czaszkę, wykonaj nacięcie na skórze głowy. Następnie umieść zwierzę w stereotaktycznej ramce.

Włóż nauszniki i oprzyj je na kościach lekko rostralnie do uszu i pociągnij skórę w dół, aby zapewnić dobry dostęp do czaszki. Dokręć nauszniki i załóż końcówkę nosową. Utrzymuj ciało zwierzęcia w poziomie i na poziomie głowy za pomocą podpory o regulowanej wysokości.

Umieść poduszkę grzewczą pod zwierzęciem, aby utrzymać je w fizjologicznej temperaturze. Następnie oczyść czaszkę, nakładając 0,9% chlorek sodu za pomocą bawełnianego wacika, aby usunąć tkankę miękką. Wyreguluj czaszkę tak, aby dostęp do bregma lambda był wypoziomowany.

Następnie należy zlokalizować miejsce wstrzyknięcia na czaszce zgodnie ze współrzędnymi tylnymi i przyśrodkowymi i umieścić igłę do wstrzykiwań nad nim. Zaznacz czaszkę jednorazową igłą. Następnie przesunąć igłę do wstrzykiwań w górę o cztery centymetry.

Używając zadziorów o średnicy 0,5 milimetra, wykonaj kraniotomię o średnicy jednego milimetra na znaku przy połowie maksymalnej prędkości. Wymaz z chusteczką, jeśli wystąpi krwawienie. Następnie opróżnij wodę zawartą w strzykawce Hamilton do przechowywania, całkowicie ją wyrzucając za pomocą pompy.

Tylko igła jest wypełniona wodą. Rozmrozić roztwór wirusa, który ma być wstrzyknięty na lodzie, a następnie na krótko usunąć go z lodu i uzyskać 700 nanolitrów roztworu za pomocą mikropipety. Następnie nałóż kroplę na kawałek folii parafinowej.

Umieść folię parafinową na kraniotomii. Zanurz igłę w kropli roztworu wirusa bez zmiany pozycji przednio-tylnej i bocznej. Następnie użyj funkcji wycofania pompy, aby napełnić strzykawkę około 500 nanolitrami roztworu wirusowego na folii parafinowej.

Wykonaj tę procedurę pod stereoskopem, obserwuj, jak kropla znika i upewnij się, że nie zasysasz powietrza. Upewnij się, że strzykawka została prawidłowo napełniona. Przetestuj system wyrzutu, wciskając tłok w dół, aby przetestować wysunięcie małej kropli cieczy.

Następnie wbij igłę w mózg na wybraną głębokość. Nacisnąć przycisk uruchamiania w celu wstrzyknięcia. Następnie powoli wyjmuj igłę przez trzy do pięciu minut.

Natychmiast umyj igłę w czystej wodzie destylowanej, napełniając ją kilkakrotnie opróżniając, aby uniknąć zatkania. Następnie usuń zwierzę z ramki stereotaktycznej. Zszyj skórę i wykonaj trzy lub cztery szwy zawiązane standardowymi węzłami chirurgicznymi 2-1-1.

Aby wydobyć mózg, wykonaj nacięcie na skórze od szyi do nosa, a następnie przekrój ostatnie kręgi z czaszki nożyczkami. Cofnij skórę i przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej od kierunku ogonowego do rostralnego. Ostrożnie usuń kość ciemieniową i ogonową część kości czołowej.

Wyciągnij mózg za pomocą małej zaokrąglonej szpatułki, wkładając ją między mózg a dno czaszki, dzieląc opuszkę węchową, nerw wzrokowy i inne nerwy czaszkowe oraz móżdżek. Delikatnie zanurz mózg w roztworze do cięcia na zimno. Następnie przenieś mózg na bibułę filtracyjną i delikatnie osusz powierzchnię kory mózgowej.

Przyklej korę mózgową do uchwytu próbki wibratomu stroną ogonową skierowaną w stronę ostrza, aby wyciąć poziome plasterki mózgu. Następnie napełnij komorę tnącą lodowato natlenionym roztworem tnącym, aby mózg był całkowicie zanurzony. Przekroje plastrów o grubości 300 mikrometrów z wibratomem z prędkością 07 milimetrów na sekundę przy amplitudzie jednego milimetra.

Na tym etapie zaleca się krótkie sprawdzenie ekspresji Chronos-GFP we wzgórzu za pomocą latarki fluorescencyjnej i odpowiednich okularów filtrujących. Aby wykonać zapis patch-clamp całej komórki, delikatnie przenieś wycinek mózgu zawierający kompleks hipokampa do komory rejestrującej. Ciągle perfekować komorę nagraniową za pomocą ACSF o temperaturze 34 stopni Celsjusza bąbelkowanej karbogenem z prędkością od dwóch do trzech mililitrów na minutę.

Pokrótce zbadaj ekspresję Chronos-GFP w zakończeniach aksonów w obszarze zainteresowania z niebieskim podświetleniem LED przy 4-krotnym powiększeniu. Zmień obiektyw na 63-krotny zanurzenie i wyreguluj ostrość. Sprawdź, czy w aksonach występuje ekspresja Chronos-GFP i wybierz neuron piramidowy do rejestracji łaty.

Następnie napełnij pipetę wewnętrznym roztworem na bazie glukonianu potasu. Zamontuj go w uchwycie na pipety na stoliku pod głowicę. Załataj ogniwo w konfiguracji cęgów napięciowych.

Zbliż się do zidentyfikowanego neuronu i delikatnie dociśnij końcówkę pipety do somy. Nadciśnienie powinno wytworzyć wgłębienie na powierzchni membrany. Następnie zwolnij nacisk, aby utworzyć pieczęć gigoOm.

Po uszczelnieniu ustaw napięcie podtrzymania na minus 65 miliwoltów. Przerwij membranę ostrym impulsem podciśnienia. Rejestruj reakcje neuronu na hiperpolaryzujące i depolaryzujące kroki prądu w trybie cęgów prądowych całej komórki.

Zapis w cęgach prądowych lub napięciowych odpowiedzi postsynaptycznych na 475-nanometrową stymulację całego pola LED włókien doprowadzających wyrażających Chronos. Stymuluj ciągami dziesięciu stymulacji o czasie trwania dwóch milisekund przy 20 hercach. Aktywność neuronów przedsubikularnych w warstwie trzeciej w odpowiedzi na hiperpolaryzujące i depolaryzujące etapy prądu zarejestrowano w konfiguracji patch-clamp całej komórki.

Stymulacja zakończeń aksonów ADN eksprymujących Chronos-GFP wywołała pobudzające potencjały postsynaptyczne w trzech głównych komórkach warstwy przedsubikularnej w obecnym trybie klamry. W zależności od natężenia światła EPSP mogą osiągnąć próg potencjału reagowania. Odpowiedzi postsynaptyczne obserwowano również w trybie cęgowania napięcia, ponieważ wywoływano pobudzające prądy postsynaptyczne.

Pokazano tutaj neuron piramidalny warstwy trzeciej otoczony aksonami wzgórza wyrażającymi Chronos-GFP w powierzchownych warstwach przedsubicular z barwieniem DAPI zobrazowanym za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. A ten obraz został wykonany w większym powiększeniu za pomocą mikroskopu konfokalnego. Staranne wyrównanie bregmy wzdłuż osi podczas wykonywania eksperymentów pilotażowych ze znacznikiem fluorescencyjnym ma kluczowe znaczenie dla poprawy precyzji iniekcji stereotaktycznej.

Procedura ta może być również wykorzystana do zbadania zbieżnych projekcji z różnych obszarów poprzez wstrzykiwanie do dwóch scen generatywnych czułych na dwie różne długości fal. Rozwój tej techniki pozwolił na precyzyjną analizę obwodów anatomicznych i funkcjonalnych między odległymi obszarami mózgu w sposób specyficzny dla typu komórki.