Name: Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Naucz się stereotaktycznych zastrzyków wewnątrzmózgowych do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy. Ta metoda umożliwia badanie funkcjonalnej łączności neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Bertrandowi Mathonowi, Mérie Nassar, Li-Wen Huang i Jean Simonnet za pomoc w rozwoju poprzednich wersji protokołu iniekcji stereotaktycznej oraz Marinowi Manuelowi i Patrice'owi Jegouzo za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez francuskie Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) oraz Agence Nationale de la Recherche Grant <span lang="FR" style="font-size: 11pt; wysokość linii: 115%; rodzina czcionek: Arial, bezszeryfowa; Kolor: RGB (41, 43, 49); obraz tła: inicjalny; pozycja-tła: początkowa; rozmiar tła: początkowy; background-repeat: początkowe; tło-przywiązanie: inicjał; background-origin: początkowe; klip tła: początkowy;" >ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

<ol><li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li>
<li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I%28h%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li>
<li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li>
<li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li>
<li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulating+neurons+with+light%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li>
<li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuBi-Glutamate%3A+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2(2009).</li>
<li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li>
<li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032(2017).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li>
<li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na%2B+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).</li>
<li>Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li>
<li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic. New York. (2013).</li>
<li>Huang, L. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus%2C+Thalamus%2C+or+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Wstrzyknięcie wirusa in vivo w celu ekspresji światłoczułych opsyn w określonym obszarze mózgu jest metodą wyboru do analizy optogenetycznej połączeń funkcjonalnych dalekiego zasięgu 10,11,17,18. Zastrzyki stereotaktyczne dają możliwość precyzyjnego celowania w określony obszar mózgu. Koekspresja opsyny z fluorescencyjnym reporterem umożliwia wygodną ocenę udanej ekspresji i potwierdzenie dokła...

Zdefiniowanie połączeń między regionami mózgu jest niezbędne do zrozumienia obwodów neuronowych. Klasyczne metody śledzenia anatomicznego pozwalają na ustalenie połączeń międzyregionalnych, a badania zmian chorobowych pomagają zrozumieć hierarchiczną organizację przepływu informacji. Na przykład obwody mózgowe służące do orientacji przestrzennej i sygnalizacji kierunku głowy obejmują kierunkowy przepływ informacji ze wzgórza do przedsionka. Wykazano to w badaniach zmian chorobowych jąder wzgórza przednio-grzbietowego (ADN), które degradują sygnał kierunku głowy w dolnym grzbietowym presubiculum, a także sygnał komórki siatki przyhipokampa1,2.
Funkcjonalna łączność między obszarami mózgu jest trudniejsza do ustanowienia na poziomie komórkowym i subkomórkowym. W hipokampie wysoce zorganizowana anatomia pozwala na badanie połączeń synaptycznych specyficznych dla szlaku za pomocą symulacji elektrycznej w przygotowaniu plastrów. Elektrody stymulacyjne umieszczone w warstwie promieniowej CA1 mogą być używane do specyficznej stymulacji wejścia pobocznego Schaffera z CA33. Elektrody stymulujące umieszczone w warstwie lacunosum moleculare CA1 aktywują wejście ścieżki perforantu do CA14,5. Stymulacja elektryczna aktywuje uwalnianie neuroprzekaźników z końców aksonów; Aktywuje jednak neurony z somatami w pobliżu miejsca stymulacji, a także aksony przejścia. W związku z tym ma ograniczone zastosowanie do badania aferentów z określonych obszarów mózgu, gdy włókna różnych regionów pochodzenia mieszają się w strukturze docelowej, jak to zwykle ma miejsce w korze nowej.
Neurony mogą być również stymulowane światłem. Metody optyczne obejmują fotoaktywację glutaminianu w klatce, która może być połączona z jedno- lub dwufotonowym skanowaniem laserowym. Wiele blisko rozmieszczonych miejsc może być stymulowanych sekwencyjnie, bez mechanicznego uszkodzenia tkanki6. Zostało to z powodzeniem wykorzystane do mapowania receptorów synaptycznych, a także do aktywacji poszczególnych neuronów7. Podczas gdy uncageing glutaminianu może być używany do analizy obwodów lokalnych, nie pozwala na specyficzną aktywację wejść dalekiego zasięgu.
Metodą z wyboru do badania połączeń dalekiego zasięgu w obwodach neuronalnych jest użycie ekspresji rodopsyny kanałowej za pośrednictwem wirusa. Stosując stereotaktyczne zastrzyki in vivo, jak opisano tutaj, ekspresja kanałów jonowych bramkowanych światłem może być ukierunkowana i przestrzennie ograniczona do pożądanego obszaru mózgu. W ten sposób rodopsyny kanałowe są skuteczne w mapowaniu pobudzającej lub hamującej łączności z jednego regionu do celu. Transfekowane zakończenia aksonów mogą być stymulowane światłem w preparacie wycinków mózgu, a zapisy patch-clamp jako odczyt pozwalają na badanie funkcji i siły określonych składników obwodu w brain8. Podejście optogenetyczne w połączeniu ze stereotaktycznym wstrzyknięciem wirusa oferuje niespotykaną swoistość i kontrolę genetyczną9. Stymulacja światłem dodatkowo pozwala na uzyskanie wysokiej precyzji zarówno czasowej, jak i przestrzennej10,11.
Presubiculum to sześciowarstwowa struktura korowa na skrzyżowaniu hipokampa i formacji para-hipokampowej12,13. Otrzymuje ważne dane synaptyczne z ADN11, ale także z kilku innych regionów korowych i podkorowych14. Tak więc selektywna stymulacja zakończeń aksonów wzgórza w wycinku przedsubicular nie jest możliwa przy stymulacji elektrycznej ani odklejaniu glutaminianu. W tym protokole opisano metody określania funkcjonalnej łączności między regionami mózgu (ADN i presubiculum) za pomocą precyzyjnych stereotaktycznych iniekcji wektorów wirusowych wyrażających kanały bramkowane światłem. Opisano również fotostymulację zakończeń aksonów neuronów projekcyjnych w ich regionie docelowym, w połączeniu z zapisami całokomórkowych neuronów postsynaptycznych w preparacji wycinka mózgu.

<table><tbody><tr><td>Wiertło 0,5 mm&nbsp;</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>724962</td><td></td></tr><tr><td>10 i mikro; L Strzykawka Hamilton</td><td></td><td>Hamilton 1701 RN - 7653-01</td><td></td></tr><tr><td>10X roztwór PBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9624</td><td>&nbsp; tekst</td></tr><tr><td>36% PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>470 nm LED&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>P1105/470/LED&nbsp; Zastosowanie DC/59022m</td><td>z dopasowanym filtrem wzbudzenia 470/40x&nbsp; i filtrem emisji do GFP&nbsp;</td></tr><tr><td>Zobacz materiał AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-5-PV3446</td><td>lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13&nbsp;</td></tr><tr><td>Wszystkie chemikalia</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bath regulator temperatury</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM7</td><td>Zestaw na 34& C&nbsp;</td></tr><tr><td>igła metalowa ze skosem</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>o rozmiarze 33, 13mm, końcówka 4-20&deg;</td></tr><tr><td>Nożyczki duże</td><td>Dahle Allround</td><td>50038</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td>final 1-3 mg/ml</td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe</td><td>Aparat Havarda</td><td>GC150-10</td><td>1,5 mm zewnętrzna, 0,86 średnica wewnętrzna</td></tr><tr><td>Brązowy Ściągacz do elektrod płomieniowych</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>BupH Pakiet soli fizjologicznej buforowany fosforanem</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td>Igła motylkowa do perfuzji</td><td>Braun&nbsp;</td><td>Kamera CCD Venofix A</td><td>24G</td></tr><tr><td>Andor</td><td>&nbsp;</td>Mikroskop konfokalny <td>DL-604M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kleszczyki zakrzywione Zeiss</td><td>LSM710</td><td>20X</td></tr><tr><td></td><td>FST&nbsp;</td><td>11011-17</td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja CY5 (konfokalna)</td><td></td><td></td><td>Laser helowo-neonowy 633nm (5,0 mW); Lustro: MBS 488/561/633&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfiguracja CY5 (epifluo)</td><td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>Światło fluorescencyjne (Intensilight); Filtr wzbudzenia: BP645/30; Lustro dichroiczne: 89100 BS ; Filtr emisyjny: BP705/72</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>konfiguracja DAPI (epifluo)</td><td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>Światło fluorescencyjne (Intensilight); Kostka: Zestaw Semrock DAPI-5060C-000-ZERO (wzbudzenie: BP 377/50; Lustro: BS 409; Emisja: BP 447/60)</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy ręczny miernik optyczny</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>Parametryzowany na 475 nm</td></tr><tr><td>Podwójne żyletki ze stali nierdzewnej</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72000</td><td>Użyj połowy ostrza w krajalnicy</td></tr><tr><td>Podwójna latarka fluorescencyjna do białek</td><td>Nightsea</td><td>DFP-1</td><td>wzbudzenie, 440-460 nm; Filtr emisyjny w okularach, 500 nm longpass.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4368</td><td>final 0,2 mM</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE-2000E</td><td>10 lub 20X</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Ruby 10%</td> <td>Millipore</td><td>AG335</td><td>rozpuszcza 10 mg w 100 &mikro; l wody destylowanej; wstrzyknąć konfigurację GFP od 150 do 300 nl</td></tr><tr><td>(epifluo)</td>Światło fluorescencyjne <td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>(Intensilight); Kostka: Zestaw filtrów Nikon B-2E/C FITC (WZBUDZENIE: BP 465-495; Lustro: BS 505; Emisja: BP 515-555)</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Physitemp</td><td>HP4M</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna choay 5000 U.I./ml</td><td>Sanofi</td><td></td><td>5 ml fiolka</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>final 10 mM</td></tr><tr><td>Zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>maksymalna prędkość wiercenia 38 000 obr./min</td></tr> <tr><td>< mocny> Wewnętrzne związki roztworu: < / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izolowany stymulator impulsów</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>final 1,2 mM</td></tr><tr><td>Ketamina 1000</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketofen 10%</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml : rozcieńczony 1 &mikro; l w 1 ml łącznie (0,1%)</td></tr><tr><td>Laokaina (lidokaina)</td><td>MSD</td><td></td><td>16,22 mg/ml : rozcieńczyć 1 ml w 4 ml łącznie (około 4%)</td></tr><tr><td>Reflektor LED hi power do operacji</td><td>Fotoniczna (przez Phymep)</td><td>10044</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz LED</td><td>Cairn Research</td><td>OptoLED Manipulatory źródła</td><td></td>światła</tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-7</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP 2H20</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>final 4 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>63069</td><td>final 2 mM</td></tr><tr><td>Mikroregulator temperatury</td><td>Physitemp</td><td>MTC-1</td><td></td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Goździk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na Fosfokreatyna</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>final 10 mM</td></tr><tr><td>Na3-GTP 2H20</td><td>Sigma</td><td>G9002</td><td>final 0,4 mM</td></tr><tr><td>uchwyt igły/hemostat</td><td>FST</td><td>13005-14</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do akwizycji pClamp</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>14-16 na wyświetlaczu dla 2-3 ml/min&nbsp;</td></tr><tr><td>Glukonian potasu (K-glukonian)</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>Final 135 mM</td></tr><tr><td>ProLong Gold anti blaknięcie medium montażowe</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36390</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2% (ksylazyna)</td><td></td>Małe nożyczki Bayer <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu 0,9%&nbsp;</td><td>Virbac</td><td></td><td>rozcieńczyć 8,5 ml w 10 ml łącznie</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy VISISCOPE SZT</td><td>VWR</td><td>630-1584</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna z wyświetlaczem cyfrowym</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt</td></tr><tr><td>Sprzęgany Streptawidyna-Cy3</td><td>Technologie życia&nbsp;</td><td></td><td></td>434315</tr><tr><td>Koniugat Streptawidyny-Cy5</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Superglue3 Loctite</td><td>Dutscher</td><td>999227</td><td>rurka 1g</td></tr><tr><td>Włókno do szwów Ethilon II 4-0 poliamid</td><td>Ethicon</td><td>F3210</td><td></td></tr><tr><td>Pompka strzykawkowa</td><td>kdScientific</td><td>Legato 130 - 788130</td><td>Użyj trybów Zaparzanie i</td></tr><tr><td>Pobieranie Krajalnica do tkanek</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>prędkość 0,07, amplituda 1.</td></tr><tr><td>rurka</td><td>Gilson</td><td>F117942, F117946</td><td>Żółty/, Fioletowy/</td></tr><tr><td>mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>Versi-dry papier absorpcyjny</td><td>stołowy Nalgene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Znajomość połączeń synaptycznych specyficznych dla typu komórki jest kluczowym warunkiem wstępnym do zrozumienia obwodów neuronalnych w całym mózgu. Funkcjonalne badanie połączeń dalekiego zasięgu wymaga ukierunkowanych zapisów pojedynczych neuronów w połączeniu ze specyficzną stymulacją zidentyfikowanych odległych sygnałów. Jest to często trudne do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnych i elektrycznych technik stymulacji, ponieważ aksony ze zbiegających się obszarów mózgu mogą mieszać się w regionie docelowym. Stereotaktyczne ukierunkowanie określonego regionu mózgu na ekspresję wrażliwych na światło kanałów jonowych za pośrednictwem wirusa umożliwia selektywną stymulację światłem aksonów pochodzących z tego regionu. Domózgowe zastrzyki stereotaktyczne mogą być stosowane w dobrze odgraniczonych strukturach, takich jak jądra przednie wzgórza, a także w innych obszarach podkorowych lub korowych w całym mózgu.
Tutaj opisano zestaw technik precyzyjnego stereotaktycznego wstrzykiwania wektorów wirusowych wyrażających rodopsynę kanałową w mózgu myszy, a następnie fotostymulacji zakończeń aksonów w preparacji wycinka mózgu. Protokoły te są proste i mają szerokie zastosowanie. W połączeniu z zapisem klamry krosowej całej komórki z neuronu połączonego postsynaptycznie, fotostymulacja aksonów pozwala na wykrycie funkcjonalnych połączeń synaptycznych, charakterystykę farmakologiczną i ocenę ich siły. Ponadto wypełnienie zarejestrowanego neuronu biocytyną może być wykorzystane do post-hoc morfologicznej identyfikacji neuronu postsynaptycznego.

Przedstawiona tutaj procedura została zastosowana do ekspresji czułego na światło niebieskie kanału rodopsyny (Chronos) połączonego z GFP w jądrze przednio-grzbietowym wzgórza (ADN), poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie antegradnego wirusa towarzyszącego adenowirusom. Współrzędne stereotaktyczne określono na podstawie atlasu mózgu myszy i zweryfikowano poprzez wstrzyknięcie 200 nL fluorescencyjnego znacznika fluoro-ruby. Zwierzę uśmiercono 10 min po wstrzyknięciu, a następnie wyextractorowano i utrwalono mózg przez noc....

Ten protokół opisuje zestaw metod do identyfikacji specyficznej dla typu komórki funkcjonalnej łączności sygnałów dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą stymulacji optogenetycznej w wycinkach mózgu ex vivo.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Celem tej metody jest zidentyfikowanie funkcjonalnej łączności sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą fotostymulacji w wycinkach mózgu. Stereotaktyczne ukierunkowanie określonego obszaru mózgu na różne pośredniczone ekspresje światłoczułych kanałów jonowych pozwala na selektywną stymulację światłem aksonów pochodzących z tego regionu. Procedurę zademonstruje Louis Richevaux, doktorant z mojej grupy.Przed zabiegiem sprawdź, czy zwierzę jest dobrze znieczulone za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Delikatnie wyciągnij język, aby ułatwić oddychanie. Następnie zgol włosy na czaszce.Wstrzyknij 20 mikrolitrów chlorowodorku lidokainy pod skórę głowy w celu znieczulenia miejscowego i odczekaj pięć minut. Aby odsłonić czaszkę, wykonaj nacięcie na skórze głowy. Następnie umieść zwierzę w stereotaktycznej ramce.Włóż nauszniki i oprzyj je na kościach lekko rostralnie do uszu i pociągnij skórę w dół, aby zapewnić dobry dostęp do czaszki. Dokręć nauszniki i załóż końcówkę nosową. Utrzymuj ciało zwierzęcia w poziomie i na poziomie głowy za pomocą podpory o regulowanej wysokości.Umieść poduszkę grzewczą pod zwierzęciem, aby utrzymać je w fizjologicznej temperat

in-vivo-intracerebral-stereotaxic-injections-for-optogenetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje protokół do badania interakcji synaptycznych i odpowiedzi neuronalnych w transfekowanym wycinku mózgu hipokampa myszy. Polega na oświetlaniu neuronów czuciowych dalekiego zasięgu w celu wyzwolenia potencjałów czynnościowych i rejestrowaniu powstałych pobudzających potencjałów postsynaptycznych w zarejestrowanym neuronie za pomocą techniki patch-clamp dla całej komórki.

Fotostymulacja i zapisy klamer całokomórkowych neuronów w wycinkach hipokampa myszy

Ten film demonstruje hamowanie pobudzających prądów synaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w wycinkach mózgu myszy w hipokampie. Neurony CA3 zostały zainfekowane rekombinowanym wektorem wirusowym zawierającym konstrukt do ekspresji fluorescencyjnego reportera, aktywowany światłem kanał błonowy i mikroRNA, który obniża ekspresję kanałów wapniowych bramkowanych napięciem. Po umieszczeniu wycinka w komorze rejestracyjnej i załataniu neuronu CA1 za pomocą pipety rejestrującej, impulsy świetlne...

Hamowanie pobudzających prądów postsynaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w mysich wycinkach hipokampa

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa w celu precyzyjnej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy. Protokół zapewnia dokładne dostarczanie wirusa do zakrętu zębatego, umożliwiając znakowanie fluorescencyjne i nokaut genów za pośrednictwem CRISPR w celu badania obwodów neuronalnych, funkcji genów i...

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Naucz się stereotaktycznych zastrzyków wewnątrzmózgowych do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy. Ta metoda umożliwia badanie funkcjonalnej łączności neuronów.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów