Name: Uratowanie rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę ratowania rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu. Technika ta umożliwia badanie biologii wirusowej i rozwój strategii szczepionkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Carli Gómez za jej pomoc techniczną w generowaniu klonów cDNA BAC oraz Snezhanie Dimitrovej za pomoc w przygotowaniu filmu. Prace te były częściowo wspierane przez dotacje z hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności (MINECO, numer grantu BFU2016-79127-R) dla F.A.T. oraz National Institutes of Health (NIH, numer grantu 1R21AI120500) dla L.M.S. i F.A.T.

<ol><li>Friedrich, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Calls+Off+Global+Zika+Emergency%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">WHO Calls Off Global Zika Emergency.</a> JAMA. 317 (3), 246(2017).</li>
<li>Sirohi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3.8+%C3%85+resolution+cryo-EM+structure+of+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus.</a> Science. 352 (6284), 467-470 (2016).</li>
<li>Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindenbach%2C+BD+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer | Lippincott Williams & Wilkins. 712-748 (2013).</li>
<li>Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+threat+of+Zika+virus+to+pregnancy%3A+epidemiology%2C+clinical+perspectives%2C+mechanisms%2C+and+impact%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact.</a> BMC Medicine. 14 (1), 112(2016).</li>
<li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+The+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection in man.</a> Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li>
<li>Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Outbreak%2C+Bahia%2C+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).</li>
<li>Cao-Lormeau, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%2C+French+polynesia%2C+South+pacific%2C+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li>
<li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+the+Americas%3A+Early+epidemiological+and+genetic+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li>
<li>Costello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+syndrome+associated+with+congenital+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection.</a> Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).</li>
<li>Cugola, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brazilian+Zika+virus+strain+causes+birth+defects+in+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models.</a> Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).</li>
<li>do Rosario, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+Syndrome+After+Zika+Virus+Infection+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).</li>
<li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+during+Pregnancy+in+Mice+Causes+Placental+Damage+and+Fetal+Demise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).</li>
<li>Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cryptic+prokaryotic+promoter+within+the+cDNA+encoding+the+5%27+end+of+dengue+virus+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome.</a> PLOS ONE. 6 (3), e18197(2011).</li>
<li>Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavivirus+reverse+genetic+systems%2C+construction+techniques+and+applications%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective.</a> Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+propagation+of+flavivirus+infectious+cDNAs+by+a+novel+method+to+reduce+the+cryptic+bacterial+promoter+activity+of+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).</li>
<li>Ruggli, N., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cDNA+clones+of+the+Flaviviridae%3A+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications.</a> Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).</li>
<li>Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Approaches+for+the+Generation+of+Recombinant+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus.</a> Viruses. 10 (11), (2018).</li>
<li>Annamalai, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Encoding+Nonglycosylated+Envelope+Protein+Is+Attenuated+and+Defective+in+Neuroinvasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion.</a> Journal of Virology. 91 (23), (2017).</li>
<li>Shan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+to+Study+Viral+Virulence+Mosquito+Transmission%2C+and+Antiviral+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors.</a> Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).</li>
<li>Liu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cis-Acting+RNA+Elements+of+Zika+Virus+by+Using+a+Self-Splicing+Ribozyme-Dependent+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone.</a> Journal of Virology. 91 (21), (2017).</li>
<li>Schwarz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+1947+Zika+Virus+Prototype+Strain+with+a+Cytomegalovirus+Promoter-Driven+cDNA+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone.</a> mSphere. 1 (5), (2016).</li>
<li>Tsetsarkin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Full-Length+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+from+the+2015+Epidemic+in+Brazil+as+a+Genetic+Platform+for+Studies+of+Virus-Host+Interactions+and+Vaccine+Development%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
<li>Deng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+the+Zika+virus+through+an+in+vitro+ligation+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach.</a> Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).</li>
<li>Widman, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reverse+Genetics+Platform+That+Spans+the+Zika+Virus+Family+Tree%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li>
<li>Munster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reverse+Genetics+System+for+Zika+Virus+Based+on+a+Simple+Molecular+Cloning+Strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy.</a> Viruses. 10 (7), (2018).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negligible+contribution+of+M2634V+substitution+to+ZIKV+pathogenesis+in+AG6+mice+revealed+by+a+bacterial+promoter+activity+reduced+infectious+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10491(2018).</li>
<li>Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+reverse+genetics+systems+for+Asian+and+African+Zika+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses.</a> Scientific Reports. 6, 39384(2016).</li>
<li>Gadea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+the+rapid+generation+of+recombinant+Zika+virus+expressing+the+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene.</a> Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> Journal of Virology. 91 (1), (2017).</li>
<li>Setoh, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Generation+and+Characterization+of+New+Zika+Virus+Isolate+Using+Sequence+Data+from+a+Microcephaly+Case%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case.</a> mSphere. 2 (3), (2017).</li>
<li>Marquez-Jurado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Alanine-to-Valine+Substitution+in+the+Residue+175+of+Zika+Virus+NS2A+Protein+Affects+Viral+RNA+Synthesis+and+Attenuates+the+Virus+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li>
<li>Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Recombinant+Arenavirus+for+Vaccine+Development+in+FDA-Approved+Vero+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+nucleotide+sequence+of+two+generations+of+a+bacterial+artificial+chromosome+cloning+vector%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector.</a> BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).</li>
<li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li>
<li>Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+DNA-launched+dengue+virus+type+2+infectious+clone+assembled+in+a+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome.</a> Virus Research. 180, 12-22 (2014).</li>
<li>Almazan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+largest+RNA+virus+genome+as+an+infectious+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).</li>
<li>Balint, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+feline+infectious+peritonitis+virus+strain+DF-2+and+studies+of+the+role+of+ORF3abc+in+viral+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism.</a> Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).</li>
<li>St-Jean, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+a+neurovirulent+human+coronavirus+OC43+from+an+infectious+cDNA+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone.</a> Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).</li>
<li>Almazan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+infectious+cDNA+clone+and+a+replicon+to+study+coronavirus+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis.</a> Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).</li>
<li>Almazan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+replication-competent%2C+propagation-defective+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+as+a+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate.</a> mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).</li>
<li>Jamsai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+modification+of+a+human+beta-globin+locus+BAC+clone+using+GET+Recombination+and+an+I-Scei+counterselection+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette.</a> Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).</li>
<li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).</li>
<li>Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+red-mediated+recombination+for+versatile+high-efficiency+markerless+DNA+manipulation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli.</a> BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zakaźne klony cDNA stanowią niezbędne narzędzia molekularne do podstawowych badań nad wirusami RNA oraz opracowywania szczepionek i/lub identyfikacji strategii przeciwwirusowych. Jednak w przypadku wielu wirusów RNA o dodatniej nici, w tym flawiwirusów, generowanie zakaźnych klonów cDNA jest trudne ze względu na niestabilność sklonowanych cDNA podczas namnażania się w bakteriach przy użyciu standardowych plazmidów o wysokiej liczbie kopii. W przypadku ZIKV i innych flawiwirusów niestabilność ta wynika głównie z nieszczelnej ekspresji toksycznych białek wirusowych z tajemniczych promotorów bakteryjnych obecnych w genomie wirusa 14,15,16,17. Tutaj opisujemy alternatywny i potężny protokół generowania stabilnego zakaźnego klonu cDNA o pełnej długości ZIKV jako pojedynczego plazmidu, w oparciu o zastosowanie plazmidu BAC pBeloBAC1134 (Figura 2A) w celu przezwyciężenia problemu toksyczności, zastosowanie promotora CMV w celu umożliwienia ekspresji vRNA w jądrze transfekowanych komórek, oraz HDV RZ do generowania vRNA z dokładnymi końcami 3' (Rysunek 2B). Korzystając z tej metody, udało nam się wygenerować w pełni stabilny zakaźny klon szczepu ZIKV RGN, który umożliwia skuteczne i niezawodne odzyskiwanie zakaźnego rZIKV po bezpośredniej transfekcji podatnych komórek Vero (Figura 3 i Figura 4).
W ciągu ostatnich kilku lat podjęto ogromny wysiłek w celu przezwyciężenia problemów związanych z niestabilnością związanych z zakaźnymi klonami cDNA ZIKV i z powodzeniem wdrożono kilka podejść18, w tym ligację in vitro fragmentów cDNA24,25, plazmidy o niskiej kopii19,20, inaktywację tajemniczych promotorów bakteryjnych poprzez wprowadzenie cichych mutacji26, 27, insercja 21,22,23, metoda montażu Gibsona 30, metoda ISA28,29 oraz zastosowanie CPER31. Chociaż podejścia te rozwiązują problem toksyczności i są przydatne do generowania zakaźnych klonów cDNA ZIKV, niektóre z nich są pracochłonne i mają kilka wad, w tym potrzebę etapów ligacji i transkrypcji in vitro, które zmniejszają wydajność odzyskiwania wirusa lub wprowadzenie dużej liczby cichych mutacji w celu inaktywacji tajemniczego promotora bakteryjnego, który może wpływać na sprawność wirusa. między innymi. Podejście opisane w tym protokole ma następujące zalety. i) Plazmid BAC pBeloBAC1134 ma ściśle kontrolowaną replikację, utrzymując jedną lub dwie kopie plazmidu na komórkę, co minimalizuje toksyczność i umożliwia stabilne utrzymanie w bakteriach niestabilnych cDNA. ii) Propagacja i modyfikacja plazmidów BAC jest prawie podobna do tych w konwencjonalnych plazmidach, biorąc pod uwagę niewielkie modyfikacje opisane w tym protokole w celu manipulowania dużymi fragmentami BAC-DNA i plazmidami o niskiej kopii. Warto zauważyć, że klon cDNA BAC może być również modyfikowany do E. coli przez rekombinację homologiczną przy użyciu systemu rekombinacji czerwonej 42,43,44. iii) Zastosowanie promotora CMV umożliwia wewnątrzkomórkową ekspresję zamkniętego ZIKV vRNA i odzyskiwanie zakaźnych wirusów bez konieczności etapu transkrypcji in vitro. iv) Zakaźny rZIKV jest generowany po bezpośredniej transfekcji wrażliwych komórek (np. Vero) klonem cDNA BAC. Ponieważ transfekcja DNA w komórkach ssaków jest bardziej wydajna niż transfekcja RNA, skuteczność odzyskiwania wirusa przy użyciu podejścia BAC jest wyższa niż obserwowana przy użyciu transkryptów RNA, co zmniejsza liczbę pasaży w komórkach hodowlanych w celu wytworzenia stada wirusa, a w konsekwencji ogranicza wprowadzanie niepożądanych mutacji przez adaptację hodowli komórkowej.
Wreszcie, potencjał podejścia BAC jest wspierany przez udane zastosowanie tej metody (z niewielkimi modyfikacjami) do inżynierii zakaźnych klonów cDNA innych flawiwirusów, w tym wirusa dengi36 i kilku koronawirusów o dużym wpływie na zdrowie ludzi i zwierząt, takich jak koronawirus pasażalnego zapalenia żołądkai jelit 37 (TGEV), wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów38 (FIPV), ludzki koronawirus OC4339 (HCoV-OC43), koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej40 (SARS-CoV) i koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego41 (MERS-CoV).
W opisanym tutaj protokole istnieją dwa krytyczne kroki, które należy wziąć pod uwagę. Jedną z ważnych kwestii jest identyfikacja odpowiednich unikalnych miejsc restrykcyjnych w genomie wirusa, które są nieobecne w plazmidzie BAC. Jeśli nie są dostępne odpowiednie miejsca ograniczenia, nowe miejsca restrykcyjne mogą zostać wygenerowane podczas projektowania klonowania poprzez wprowadzenie cichych mutacji nukleotydowych. Inną ważną kwestią jest to, że plazmidy BAC są obecne tylko w jednej lub dwóch kopiach na komórkę, a zatem niską wydajność plazmidów BAC z wysokim zanieczyszczeniem bakteryjnego genomowego DNA uzyskuje się przy użyciu standardowych protokołów zaprojektowanych dla plazmidów o wysokiej i średniej liczbie kopii. Ten potencjalny problem można łatwo przezwyciężyć za pomocą dużych objętości hodowli i oczyszczania plazmidu BAC za pomocą komercyjnego zestawu opracowanego specjalnie do oczyszczania BAC.
Podsumowując, opracowaliśmy potężne podejście do odwróconej genetyki ZIKV oparte na wykorzystaniu BAC, które można dostosować do generowania stabilnych i w pełni funkcjonalnych zakaźnych klonów cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, aby ułatwić badanie biologii tych wirusów i opracowanie szczepionek i/lub ułatwić identyfikację leków przeciwwirusowych.

ZIKV to przenoszony przez komary przedstawiciel rodzaju Flavivirus z rodziny Flaviviridae, który obecnie stanowi globalny stan zagrożenia zdrowia publicznego1. Podobnie jak inne flawiwirusy, ZIKV jest wirusem otoczkowym RNA o strukturze podobnej do ikozaedrycznej, która zawiera jednoniciową cząsteczkę RNA o dodatnim znaczeniu około 10,8 kb (ryc. 1)2. Genom wirusa koduje dużą poliproteinę składającą się z około 3,423 aminokwasów, która jest przetwarzana przez proteazy wirusowe i komórkowe na trzy białka strukturalne (kapsyd [C], błona przedbłonowa/błonowa [prM/M] i otoczka [E]), które biorą udział w tworzeniu cząstek wirusa i siedmiu białek niestrukturalnych (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5), które uczestniczą w replikacji genomu, nagromadzenie wirusa i unikanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza (ryc. 1)3.
Historycznie rzecz biorąc, zakażenie ZIKV było związane z łagodną chorobą przebiegającą z gorączką4,5. Jednak wybuchowa niedawna pandemia zakażeń ZIKV w Ameryce Południowej i Środkowej, na Południowym Pacyfiku i na Karaibach6,7,8 i jej związek z występowaniem zespołu Guillaina-Barrégo i małogłowia9,10,11,12,13, zmieniły historyczne postrzeganie i wzmocniły znaczenie ZIKV jako ważnego ludzkiego patogenu. W tym sensie rozwój narzędzi molekularnych, takich jak zakaźne klony cDNA, ułatwi badanie patogenezy wirusa i opracowanie genetycznie zdefiniowanych szczepionek oraz identyfikację leków przeciwwirusowych do leczenia zakażenia ZIKV. Jak opisano w przypadku innych flawiwirusów, generowanie zakaźnych klonów ZIKV jest trudne ze względu na obecność tajemniczych promotorów bakteryjnych w genomie wirusa14, które umożliwiają nieszczelną ekspresję toksycznych białek wirusowych podczas namnażania klonów cDNA w bakteriach przy użyciu standardowych plazmidów o wysokiej liczbie kopii15,16,17. Aby przezwyciężyć ten problem toksyczności, w ciągu ostatnich dwóch lat z powodzeniem wdrożono kilka nietradycyjnych podejść18. Obejmują one użycie plazmidów o niskiej liczbie kopii19,20, wprowadzenie intronów w celu zakłócenia toksycznych regionów21,22,23, ligacja in vitro fragmentów cDNA24,25, mutacyjne wyciszanie tajemniczych promotorów bakteryjnych obecnych w genomie wirusa26,27, zakaźne subgenomiczne amplikony (ISA)28,29, metoda montażu Gibsona30, oraz zastosowanie reakcji rozszerzenia polimerazy kołowej (CPER)31.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół inżynierii pełnowymiarowego klonu cDNA szczepu ZIKV-RGN13, przy użyciu BAC w celu rozwiązania problemu toksyczności, oraz ratowania zakaźnego rZIKV poprzez bezpośrednią transfekcję klonu cDNA BAC do komórek Vero32, linii komórkowej zatwierdzonej przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do rozwoju szczepionek dla ludzi33. W tym systemie pełnowymiarowa kopia cDNA genomu wirusa jest składana w plazmid BAC pBeloBAC1134 (Figura 2A), plazmidzie o niskiej liczbie kopii (jedna do dwóch kopii na komórkę) pochodzącym z czynnika Escherichia coli F35, co minimalizuje toksyczność sekwencji flawiwirusa podczas jego namnażania się w bakteriach. cDNA genomu ZIKV jest składany w pBeloBAC11 pod kontrolą ludzkiego promotora CMV o natychmiastowym początku, aby umożliwić ekspresję wirusowego (v)RNA w jądrze transfekowanych komórek przez komórkową polimerazę RNA II i otoczony na końcu 3' rybozymem wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) (RZ), po którym następują sekwencje terminacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) i sygnały poliadenylacji w celu wytworzenia syntetycznych RNA z autentycznymi 5'- i 3'-końce genomu wirusa, odpowiednio, (Figura 2B). Ten system uruchamiany przez cDNA powoduje wewnątrzkomórkową ekspresję wirusowego RNA z czapeczką, umożliwiając odzyskanie zakaźnego ZIKV bez konieczności etapu transkrypcji in vitro. Podejście BAC zapewnia potężną metodologię mającą zastosowanie do konstruowania stabilnych i w pełni funkcjonalnych zakaźnych klonów cDNA dla innych flawiwirusów, a także innych wirusów RNA o dodatniej nici36,37,38,39,40,41.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Odczynniki do biologii molekularnej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Afe I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0652S</td><td>10 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA Polimeraza ThermoFisher</td><td>Scientific (Applied Biosystems)</td><td>N8080161</td><td>5 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>ApaL I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Asc I</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>R0558S</td><td>10 000 jednostek/ mL</td></tr><tr><td>BamH I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td>10 000 jednostek/mL</td></tr><tr><td>BstB I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0519S</td><td>20 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Cells&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>18290015</td><td>Elektrokompetentne ogniwa DH10B</td></tr><tr><td>Kuwety elektroporacyjne, 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>zestaw do dużych konstrukcji (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12462</td><td>Do preparatu BAC o wysokiej czystości</td></tr><tr><td>LB Rosół</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen 12780029</td><td></td> <td>Może być również domowej roboty</td></tr><tr><td>LB z agarem</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>22700041</td><td>Może być również domowej roboty</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>Mlu I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0198S</td><td>10 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Midi do plazmidu (25)</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>Do przygotowania plazmidów BAC w średniej skali</td></tr><tr><td>Pml I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0532S</td><td>20 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe (10 ml)</td><td>DeltaLab</td><td>175724</td><td>Inne źródła komercyjne są dopuszczalne Zestaw</td></tr> do <tr><td>ekstrakcji żelu QIAEX II (150)</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td>Zestaw do czyszczenia żelu zoptymalizowany pod kątem fragmentów DNA większych niż 10 kb</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna krewetek (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1,000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>15544034</td><td>Może być również domowej roboty</td></tr><tr><td>Synteza fragmentów cDNA</td><td>Bio Basic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>10481220001</td><td>1,000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>2. Odczynniki do hodowli komórkowych</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe ThermoFisher</td><td>Scientific (Nunc)</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>Agar Noble</td><td>VWR</td><td>214230</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Sprzężona mrówka-mysz przeciwciało wtórne</td><td>Zmienia</td><td>się Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało przeciw mysim przeciwciałom wtórnym</td><td>zmienia się</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych (100 mm x 21 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (15 ml)</td><td>VWR</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (50 ml)</td><td>VWR</td><td>525-0155</td><td></td></tr><tr><td>Kryształowy fiolet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Toksyczny i rakotwórczy</td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific (HyClone))</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Toksyczna i rakotwórcza</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>11668019</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Obniżona surowica</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>31985070</td><td>Pożywka transfekcyjna</td></tr><tr><td>Białko E panflawiwirusa E mAb 4G2</td><td>BEI Zasoby</td><td>NR-50327</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710-S</td><td>Toksyczny i rakotwórczy</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong Gold</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ABC Vectatain Vector</td><td>Laboratories Inc</td><td>PK-4010</td><td>Zestaw peroksydazy na bazie awidyny/biotyny</td></tr><tr><td>Vero Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV E Białko mAb 1176-56</td><td>BioFront Technologies</td><td>BF-1176-56</td><td></td></tr><tr><td><silny>3. Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy w żelu agarozowym</td><td>Bio-Rad</td><td>1704468</td><td>Inne źródła komercyjne są dopuszczalne</td></tr><tr><td>Klasa II Bezpieczeństwo biologiczne Szafka CO2</td><td>Różni się</td><td>Nie dotyczy</td><td>Inne źródła komercyjne są dopuszczalne</td></tr><tr><td>Wirówka chłodnicza na biurku</td><td>Różni się</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td> <td>fluorescencyjnyRóżni</td><td>się Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Szybkoobrotowa wirówka chłodnicza</td><td>Zmienia się</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator MicroPulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td>Inne maszyny są dopuszczalne</td></tr><tr><td>Termocykler SimpliAmp</td><td>ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>A24811</td><td>Inne maszyny są dopuszczalne</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>zmienia</td><td>się nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

uratowanie rekombinowanego wirusa zika z bakteryjnego klonu cdna ze sztucznego chromosomu

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

Związek zakażenia wirusem Zika (ZIKV) z powikłaniami neurologicznymi podczas niedawnej światowej epidemii oraz brak zatwierdzonych szczepionek i/lub leków przeciwwirusowych podkreśliły pilną potrzebę opracowania systemów odwróconej genetyki ZIKV, aby ułatwić badania nad biologią ZIKV i rozwój metod terapeutycznych i/lub profilaktycznych. Jednak, podobnie jak w przypadku innych flawiwirusów, wytwarzanie pełnowymiarowych zakaźnych klonów cDNA ZIKV zostało utrudnione ze względu na toksyczność sekwencji wirusowych podczas ich amplifikacji w bakteriach. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy nietradycyjne podejście oparte na wykorzystaniu sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC). Stosując to podejście, pełnowymiarowa kopia cDNA szczepu ZIKV Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) jest generowana z czterech syntetycznych fragmentów DNA i składana w pojedynczą kopię plazmidu pBeloBAC11 pod kontrolą promotora ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV) o natychmiastowym wczesnym początku. Złożony klon cDNA BAC jest stabilny podczas namnażania się w bakteriach, a zakaźny rekombinowany (r)ZIKV jest odzyskiwany w komórkach Vero po transfekcji klonu cDNA BAC. Opisany tutaj protokół zapewnia potężną technikę generowania zakaźnych klonów flawiwirusów, w tym ZIKV, i innych wirusów o dodatniej nici RNA, szczególnie tych z dużymi genomami, które mają problemy ze stabilnością podczas rozmnażania się bakterii.

Opisany tutaj protokół umożliwia generowanie stabilnych, pełnowymiarowych klonów infekcyjnych cDNA ZIKV z wykorzystaniem BAC, aby zminimalizować problemy z toksycznością związane z wieloma sekwencjami flawiwirusów. Efektywną regenerację infekcyjnego rZIKV z klonu cDNA BAC można łatwo osiągnąć po transfekcji podatnych komórek Vero (Rysunek 2). Stosując ten protokół, wygenerowaliśmy stabilny, pełnowymiarowy klon cDNA szczepu ZIKV RGN32 poprzez sekwencyjne klonowanie czterech nakładających się fragmentów cDNA do plazmidu BAC pBeloBAC1134, wykorzystując konwencjonalne metody klonowania oraz unikalne miejsca restrykcyjne obecne w genomie wirusa (Rysunek 2). Pełnowymiarowy klon cDNA był flankowany na końcu 5' przez ludzki promotor CMV, aby umożliwić ekspresję vRNA w jądrze transfekowanych komórek, oraz na końcu 3' przez HDV RZ, po którym następowały sekwencje poliadenylacji i terminacji BGH, aby wytworzyć RNA zawierające dokładny koniec 3' genomu wirusowego (Rysunek 2). Stabilność wygenerowanego klonu cDNA BAC w bakteriach, wraz z łatwością jego manipulacji przy użyciu standardowych technologii rekombinowanego DNA, podkreśla potencjał podejścia opartego na cDNA BAC w szybkim i niezawodnym generowaniu stabilnych, pełnowymiarowych klonów cDNA ZIKV oraz innych flawiwirusów lub wirusów RNA o dodatnej polarności z niestabilnymi genomami wirusowymi.
Po zmontowaniu klonu cDNA w BAC (Rysunek 2), zakaźny wirus mógł zostać łatwo odzyskany po bezpośredniej transfekcji podatnych komórek Vero klonem cDNA BAC przy użyciu liposomów kationowych(Rysunek 3). System ten, oparty na cDNA, umożliwił wewnątrzkomórkową ekspresję uncapped vRNA, co pozwoliło na odzyskanie zakaźnych wirusów bez konieczności przeprowadzenia etapu transkrypcji in vitro. Stosując to podejście, udało nam się uzyskać rZIKV-RGN z mianami przekraczającymi 106 PFU/mL w 5. dniu po transfekcji (Rysunek 4A). Ponadto odzyskany wirus wywołał wyraźny efekt cytopatyczny (CPE) (Rysunek 4B), tworzył jednorodnie wielkościowe plaki o średnicy około 2 mm (Rysunek 4C), a jego tożsamość została potwierdzona poprzez sekwencjonowanie (dane niepokazane) oraz analizę immunofluorescencyjną z użyciem przeciwciała mAb specyficznego dla białka E ZIKV, 176-56 (Rysunek 4D). Dane in vitro wskazują, że odzyskany rZIKV-RGN replikował się wydajnie w komórkach Vero na poziomach porównywalnych z naturalnym izolatem ZIKV32 (dane niepokazane). Podsumowując, wyniki te dowodzą, że zakaźny rZIKV może zostać odzyskany z pełnowymiarowych klonów cDNA zmontowanych w BAC.
<img alt="Schemat struktury białek wirusowych i cięcia proteazowego; przekrój wirionu z opisanymi białkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Organizacja genomu i struktura wirionu ZIKV. (A) Organizacja genomu: ZIKV zawiera jednoniciowy RNA o polarności dodatniej, który jest translacyjny jako pojedynczy poliprotein. Powstały poliprotein jest cięty przez proteazy wirusowe (strzałki) i gospodarza (romby), w wyniku czego powstają białka strukturalne: kapsydu (C, niebieski), macierzy (M, brązowy) i otoczki (E, zielony) oraz siedem białek niestrukturalnych (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5). Nietranslacyjne regiony (UTR) 5' i 3' na końcach genomu wirusowego zaznaczono czarnymi liniami. (B) Struktura wirionu: wiriony ZIKV są pokryte białkami E i M, zakotwiczonymi w dwuwarstwie lipidowej o strukturze zbliżonej do ikosaedru. Pod otoczką wirusową znajduje się nukleokapsyd wirusowy, składający się z białka C powiązanego z genomowym RNA wirusa. Rysunek ten został zaadaptowany z pracy Ávila-Pérez i wsp.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapy bakteryjnych sztucznych chromosomów; schematy plazmidów pBeloBAC1 (7 507 bp) i pBAC-ZIKV (18 308 bp)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Montaż pełnowymiarowego infekcyjnego klonu cDNA ZIKV w wektorze BAC. (A) Schematyczny rysunek BAC pBeloBAC1: Geny regulatorowe parA, parB, parCi repE,miejsce inicjacji replikacji czynnika F (OriS)), gen oporności na chloramfenikol (Cmr), a i lacOznaczone są geny Z. Podkreślono odpowiednie miejsca restrykcyjne wykorzystane do zmontowania infekcyjnego klonu cDNA ZIKV. (B) Montaż pełnej infekcyjnej kopii cDNA ZIKV w BAC pBeloBAC1: Cztery nakładające się fragmenty DNA (Z1-Z4), obejmujące cały genom ZIKV (Rycina 1) i otoczone wskazanymi miejscami restrykcyjnymi, zostały wytworzone drogą syntezy chemicznej i sekwencyjnie sklonowane do wektora pBeloBAC11 w celu otrzymania infekcyjnego klonu cDNA ZIKV pBAC-ZIKV. Pełnowymiarowe infekcyjne cDNA ZIKV zostało zmontowane pod kontrolą ludzkiego promotora wczesnego i natychmiastowego cytomegalowirusa (CMV) oraz otoczone na końcu 3' rybozymem HDV (RZ) oraz sekwencjami terminacji i poliadenylacji hormonu wzrostu bydlęcego (BGH). Akronimy genów wirusowych i elementów regulacyjnych są opisane w Rycina 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces amplifikacji ZIKV, transfekcja DNA pBAC-ZIKV, schemat komórek Vero, oś czasu replikacji wirusa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Procedura generowania rZIKV z klonu cDNA w BAC. Komórki Vero przy 90% konfluencji transfekowano w monowarstwie pełnym infekcyjnym klonem cDNA ZIKV pBAC-ZIKV (Rysunek 2) przy użyciu liposomów kationowych. W 4–6 dniach po transfekcji, gdy widoczny był efekt cytopatyczny (CPE), pobrano nadnadczyn z hodowli tkankowej zawierający rZIKV i oceniono obecność wirusa (Rysunek 4) i wykorzystywano do amplifikacji wirusa w komórkach Vero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Krzywa wzrostu wirusa, mikroskopia kontroli (Mock) i rZIKV, barwienie fioletem krystalicznym, analiza immunobarwienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Odzyskiwanie i charakterystyka in vitro rZIKV. (A) Wytworzenie zakaźnego rZIKV z klonu cDNA w BAC: Komórki Vero przy 90% konfluencji (format płytki 6-dołkowej, powtórzenia trzykrotne) poddano transfekcji pozornej lub transfekcji za pomocą 4 µg/well pBAC-ZIKV (Rysunek 3), a we wskazanych dniach po transfekcji miana wirusa w nadsączach hodowli tkankowych określono za pomocą metody płytek wirusowych (PFU/mL). Słupki błędów wskazują odchylenia standardowe z trzech różnych eksperymentów transfekcyjnych. Czarna przerywana linia oznacza granicę wykrywalności (50 PFU/mL). (B) Wirusowy efekt cytopatyczny (CPE): Komórki Vero przy 90% konfluencji (format płytki 6-dołkowej, w trzech powtórzeniach) poddano infekcji pozorowanej (góra) lub infekcji rZIKV (MOI = 0,5 PFU/komórkę), a po 48 h od infekcji oceniono obecność CPE za pomocą mikroskopii świetlnej. Paski skali = 100 µm. (C) Test plackowy i immunostaining: komórki Vero przy 90% konfluencji (w formacie płytki 12-dołkowej) zainfekowano rZIKV, a po 72 h od infekcji plaki wirusowe zwizualizowano poprzez barwienie fioletem krystalicznym (lewo) lub immunostaining (prawo) przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 4G2 przeciwko białku E pan-flavivirus. Paski skali = 5 mm. (D) Immunofluorescencja: Komórki Vero przy 90% konfluencji (format płytki 24-dołkowej, w trzech powtórzeniach) zainfekowano rZIKV (MOI 0,5 PFU/komórkę), a po 48 h od infekcji poddano analizie immunofluorescencyjnej z użyciem przeciwciała monoklonalnego mAb 176-56, specyficznego dla białka E ZIKV. Jądra komórkowe zabarwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywny obraz scalony zainfekowanych ZIKV komórek Vero. Biały kwadrat w prawym górnym rogu przedstawia powiększony obraz zainfekowanych ZIKV komórek Vero. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>

Niedawna epidemia wirusa Zika podkreśla znaczenie ustanowienia odwrotnego podejścia genetycznego do opracowania szczepionek i/lub strategii terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół ratowania zakaźnego rekombinowanego wirusa Zika z pełnowymiarowego klonu cDNA złożonego w bakteryjnym sztucznym chromosomie pod kontrolą ludzkiego wirusa cytomegalii o natychmiastowym wczesnym promotorze.

Uratowanie rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest wygenerowanie zakaźnego rekombinowanego wirusa Zika z pełnowymiarowego klonu cDNA, złożonego w bakteryjny sztuczny chromosom pod kontrolą ludzkiego wirusa cytomegalii o natychmiastowym wczesnym promotorze. Opracowanie odwróconego systemu genetycznego dla wirusów RNA, takich jak wirus Zika, pozwala na bezpośrednią manipulację genomem wirusa w celu zbadania wielu aspektów biologii i patogenezy wirusa oraz opracowania strategii szczepień. Główną zaletą tej techniki jest to, że konstrukcja zakaźnego klonu wirusa Zika jako sztucznego chromosomu bakteryjnego przezwycięża toksyczność związaną z genomem flawiwirusa i umożliwia uratowanie zakaźnego wirusa poprzez bezpośrednią transfekcję klonu cDNA BAC do wrażliwych komórek.Metodologia ta może być zastosowana do konstruowania stabilnych i w pełni funkcjonalnych zakaźnych klonów cDNA dla innych flawiwirusów, a także innych wirusów o dodatniej nici RNA. Aby rozpocząć tę procedurę, należy skonstruować klon cDNA wirusa Zika zgodnie z opisem w protokole tekstowym, używając odpowiednich miejsc restrykcyjnych. Cztery fragmenty DNA obejmujące genom wirusa Zika, otoczone ludzkim promotorem CMV na piątym końcu i rybosomem wirusa zapalenia wątroby typu delta oraz sekwencjami terminacji i poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu na trzecim końcu są łączone w bakteryjnym plazmidzie sztucznego chromosomu.Najpierw hoduj pojedynczą kolonię E. coli DH10B przenoszącą zakaźny klon wirusa pBAC-Zika w pięciu mililitrach pożywki LB zawierającej chloramfenikol przez osiem godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym potrząsaniem. Następnie dodaj 500 mililitrów pożywki LB zawierającej chloramfenikol do dwulitrowej kolby. Dodaj jeden mililitr przygotowanej kultury bakteryjnej do kolby i hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 do 16 godzin, aż OD600 osiągnie około 0,6 do 0,8.Następnie użyj komercyjnego zestawu opracowanego specjalnie do oczyszczania BAC, aby oczyścić klon cDNA infekcji BAC przez lizę alkaliczną, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Na dzień przed transfekcją umieść komórki Vero w dołkach sześciodołkowej płytki o gęstości 500 000 komórek na dołek w pożywce wzrostowej. Aby przygotować mieszaninę transfekcyjną, dodaj cztery mikrogramy klonu cDNA BAC do 250 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy i dokładnie wymieszaj.W osobnej probówce rozcieńczyć 12 mikrolitrów środka do transfekcji w 250 mikrolitrach pożywki zredukowanej surowicy. Wirować mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie połącz rozcieńczone cDNA BAC ze środkiem transfekcyjnym.Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. Podczas tego okresu inkubacji użyj pożywki wzrostowej bez antybiotyków, aby umyć komórki Vero i pozostaw komórki w jednym mililitrze świeżej pożywki bez antybiotyków. Następnie rozprowadź kroplami 500 mikrolitrów mieszaniny cDNA i odczynnika do transfekcji na komórkach Vero.Kołysz płytką w przód iw tył, aby wymieszać i inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć godzin. Następnie usuń pożywkę do transfekcji i dodaj dwa mililitry świeżej pożywki wzrostowej z antybiotykami. Inkubuj komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, upewniając się, że codziennie sprawdzasz, czy nie ma indukcji efektu cytopatycznego.Po czterech do sześciu dniach transfekcji, gdy CPE wynosi około 50 do 75%, zbierz supernatanty z kultur tkankowych w 15-mililitrowych stożkowych probówkach i odwiruj przez 10 minut, aby usunąć resztki komórkowe. Następnie należy zebrać supernatanty zawierające rekombinowany wirus Zika i wyrzucić granulki komórek. Oddzielić supernatant w krioprobówkach i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Na początek wyhoduj komórki Vero do 90% konfluencji. Umyj komórki dwa razy PBS i zainfekuj je uratowanym wirusem o wielokrotności infekcji 0,1 w pożywce wzrostowej zawierającej 2% FBS. Umieść płytki komórek w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i rozdrabniaj co 15 minut przez 90-minutowy okres adsorpcji.Po adsorpcji wirusa usuń inokulum wirusa i dodaj świeżą pożywkę wzrostową z 2% FBS. Inkubować trzy lub cztery dni w tych samych warunkach, które stosowano wcześniej. Gdy CPE wynosi około 75%, zbierz supernatant kultury tkankowej i odwiruj, aby usunąć resztki komórkowe.Następnie należy zebrać supernatant zawierający rekombinowany wirus Zika i wyrzucić osad. Porcjować supernatant do krioprobówek. Umieść probówki w zamrażarce i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Gdy wszystko będzie gotowe, wyjąć podwielokrotność wirusa z zamrażarki i określić miano wirusa za pomocą testu płytki nazębnej, jak opisano w protokole tekstowym. W tym badaniu stabilny, pełnowymiarowy klon cDNA szczepu wirusa Zika Rio Grande do Norte Natal jest generowany przez sekwencyjne klonowanie czterech nakładających się na siebie fragmentów cDNA do bakteryjnego sztucznego chromosomu pBeloBAC11 przy użyciu konwencjonalnych metod klonowania i unikalnych miejsc restrykcyjnych obecnych w genomie wirusa. Ten pełnowymiarowy klon cDNA został otoczony na piątym końcu przez promotor ludzkiego wirusa cytomegalii, aby umożliwić ekspresję wirusowego RNA w jądrze transfekowanych komórek, a na trzecim końcu przez rybosom wirusa zapalenia wątroby typu delta, po którym następuje terminacja bydlęcego hormonu wzrostu i sekwencja poliadenylacji w celu wytworzenia RNA zawierającego dokładny trójgłówny koniec genomu wirusa.Po złożeniu cDNA BAC, zakaźny wirus można łatwo odzyskać po bezpośredniej transfekcji podatnych komórek Vero klonem cDNA BAC przy użyciu liposomów kationowych. Stosując to podejście, wirus R Zika RGN może zostać uratowany z mianami wyższymi niż milion jednostek tworzących płytki nazębne na mililitr. Ponadto uratowany wirus indukuje wyraźny efekt cytopatyczny i generuje jednorodne blaszki o wielkości około dwóch milimetrów.Tożsamość uratowanego wirusa potwierdza się za pomocą analizy immunofluorescencyjnej przy użyciu specyficznego przeciwciała monoklonalnego dla białka E wirusa Zika. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te pokazują, że zakaźny rekombinowany wirus Zika może zostać uratowany z pełnowymiarowych klonów cDNA złożonych w BAC. Podsumowując, opracowaliśmy potężne podejście genetyczne do odwrócenia wirusa Zika, oparte na wykorzystaniu sztucznego chromosomu bakteryjnego, który można dostosować do generowania stabilnych i funkcjonalnych infekcji klonem cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, aby ułatwić badanie patologii, opracowanie szczepionki i/lub ułatwienie identyfikacji leku o działaniu przeciwwirusowym.

rescue-recombinant-zika-virus-from-bacterial-artificial-chromosome

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich...

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Ten protokół opisuje odzyskiwanie zakaźnego wirusa Zika z dwuplazmidowego zakaźnego klonu cDNA.

Ratowanie i charakterystyka rekombinowanego wirusa z zakaźnego klonu wirusa Zika z Nowego Świata

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

W tym protokole opisujemy technikę wykrywania peptydów diagnostycznych specyficznych dla wirusa Zika za pomocą mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości. Protokół ten można łatwo dostosować do innych pojawiających się chorób zakaźnych.

Odkrycie epitopu diagnostycznego specyficznego dla wirusa Zika

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Poznaj metodę ratowania rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu. Technika ta umożliwia badanie biologii wirusowej i rozwój strategii szczepionkowych.

Uratowanie rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu

Przeglądaj więcej filmów