Name: Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Naucz się wytwarzać organoidy z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy do badania biologii komórek żółciowych. Ta metoda pozwala na hodowlę nieograniczonej liczby cholangiocytów i badanie regeneracji tkanek oraz interakcji komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Association for the Study of Liver Diseases Pinnacle award (dla N.R.) oraz National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (nagrody P30 DK34933 dla N.R., P01 DK062041 dla J.L.M.). Dziękujemy dr Ramonowi Ocadiz-Ruizowi (University of Michigan) za pomoc w opracowaniu tej metodologii.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.
1. Przygotowanie sprzętu i materiałów do izolacji myszy EHBD
<ol>
	<li>Przygotować podłoże wysiewające i bufor myjący (tabela materiałów) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C lub na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Ustaw stół chirurgiczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Przygotuj wysterylizowane narzędzia chirurgiczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Umieścić sterylną 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w celu jej wstępnego ogrzania.</li>
	<li>Umieść podwielokrotność macierzy podstawowej na lodzie. Używaj matrycy piwnicznej tylko wtedy, gdy jest całkowicie upłynniona.</li>
</ol>
2. Izolacja EHBD i hodowla organoidów żółciowych
<ol>
	<li>Izolacja i przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki mysiego EHBD
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji dorosłą mysz (starszej niż 2 miesiące) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Umieść mysz w pozycji leżącej. Otwórz jamę brzuszną, stosując podejście w linii środkowej i cofnij wątrobę, aby spoczęła na przeponie.</li>
		<li>Zidentyfikuj wspólny przewód żółciowy znajdujący się bezpośrednio pod wnęką wątroby, delikatnie pociągając proksymalną dwunastnicę za pomocą hemostatu. Oddziel EHBD od otaczających tkanek za pomocą ostrza skalpela. Trzymając kleszczami bliższy koniec przewodu żółciowego wspólnego, rozetnij go dystalnie tuż nad jego połączeniem z dwunastnicą, a następnie wypreparuj bliższy koniec przewodu od wątroby (<klasa silna = "xfig">Ryc. 1D). Natychmiast umieść izolowany EHBD (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E) w buforze do mycia na zimno.</li>
		<li>Wyjmij EHBD z bufora myjącego i zmiel na kawałki 0,5 mm za pomocą sterylnego ostrza skalpela. Podczas zabiegu umieść chusteczkę na szklanej płytce na lodzie (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
		<li>Umieścić skrawki EHBD w probówce zawierającej 500 μl buforu dysocjacyjnego. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Zneutralizować bufor dysocjacyjny przez dodanie 500 μl lodowatej pożywki do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Rozcierać zawiesinę komórkową w górę i w dół, przechodząc przez igły 18 G i 20 G, 20 razy każda. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm i zbierz przepływ do probówki o pojemności 50 ml. 
		nuta: Przed filtracją należy wstępnie przygotować sitko 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby ułatwić przejście zawiesiny komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustanawianie organoidów EHBD
	<ol>
		<li>Odwirować przepływ z etapu 2.1.5 przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego sterylnego PBS. Przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 2.2.1.</li>
		<li>Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z umytych komórek zebranych na dnie probówki. Zawiesić osad komórkowy w 120 μl skroplonej, lodowatej matrycy podstawowej, pipetując w górę iw dół za pomocą końcówek P200. 
		nuta: Ponowne zawieszenie osadów komórkowych w matrycy podstawowej musi być przeprowadzone w łaźni lodowej.</li>
		<li>Płytka 40 μl resuspensji komórek w matrycy podstawowej do środka studzienki we wstępnie ogrzanej płytce 24-dołkowej. 
		nuta: Unikaj zasysania powietrza podczas manipulowania matrycą piwnicy, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.</li>
		<li>Umieścić płytkę z komórkami zawieszonymi w macierzy podstawowej do inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 15 minut lub do momentu zestalenia się matrycy podstawowej. Do każdej studzienki dodać 600 μl podłoża siewnego podgrzanego do temperatury 37 °C (tabela materiałów). Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zastąp pożywkę wysiewną 600 μl świeżej pożywki do hodowli organoidów w ciągu 3 dni, a następnie co 3 dni. Monitoruj wzrost organoidów za pomocą odwróconego mikroskopu. Użyj organoidów do dalszej aplikacji lub podziel je co 7 do 9 dni, zanim zaobserwuje się nagromadzenie szczątków śródświetlnych i zapadnięcie się organoidów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przejście i przechowywanie organoidów EHBD
<ol>
	<li>Pasaż organoidów EHBD w stosunku 1:3 do 1:4 co 7 do 9 dni
	<ol>
		<li>Wyjmij pożywkę z dołka i dodaj 400 μl lodowatego PBS. Ponownie zawiesić organoidy, delikatnie pipetując mieszaninę w górę iw dół 10 razy w studzience. Przenieść mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Przepuścić mieszaninę przez igłę 25 G 4 razy, aby oddzielić organoidy. Odwirować mieszaninę przy 400 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w macierzy podstawowej (1:3 do 1:4) w celu dalszego rozmnażania (etap 2.2.4.) lub umyć komórki lodowatym PBS w celu dalszego przetwarzania. 
		nuta: Zazwyczaj 250-300 komórek jest powlekanych w płytce 24-dołkowej do dalszych zastosowań. Wydajność posiewu można ocenić za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu mikroskopu odwróconego w 3-5 dniu po pasażowaniu, licząc liczbę organoidów i obliczając ich procent od początkowej liczby komórek. mRNA można wyizolować z EHBDO przemytych w PBS przy użyciu standardowego protokołu wykorzystującego ekstrakcję tiocyjanianianem guanidyny-fenolem-chloroformem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Długotrwałe przechowywanie organoidów EHBD
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę ze studzienki i umyć organoidy PBS o temperaturze pokojowej. Usuń PBS ze studni, nie naruszając spadku matrycy piwnicznej.</li>
		<li>Dodać 500 μl lodowatej pożywki do zamrażania komórek do studzienki. Delikatnie zawiesić organoidy w upłynnionej matrycy podstawowej i pożywce do zamrażania komórek, a następnie przenieść mieszaninę do fiolek kriogenicznych.</li>
		<li>Przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C przez 48 godzin. Przenieść fiolki do zbiornika z azotem w celu długotrwałego przechowywania w fazie gazowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie organoidów EHBD do zatapiania parafiny
<ol>
	<li>Zawiesić EHBDO w 500 μl lodowatego PBS (4 °C), pipetując w górę i w dół 5 do 10 razy. Zebrać zawieszony EHBDO w skroplonej matrycy podstawowej w probówce o pojemności 1,5 ml. 
	nuta: Aby uniknąć pękania organoidów, odetnij dolne 2-3 mm końcówki P1000 i bardzo ostrożnie usuń supernatant.</li>
	<li>Odwirować organoidy EHBD przy 350 x g przez 5 min. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu organoidowego.</li>
	<li>Dodać 1 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA) do organoidów i inkubować organoidy w 4% PFA przez noc w temperaturze 4°C. Usunąć 4% PFA z organoidów za pomocą końcówki P1000 po całonocnej inkubacji.</li>
	<li>Dodać 1000 μl PBS o temperaturze pokojowej do probówki z organoidami i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować probówkę z organoidami w PBS przy 350 x g przez 5 minut. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Usuń PBS i dodaj 1 ml 30% etanolu do organoidów. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 30% etanolu. Dodać 1 ml 70% etanolu i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować przy 350 x g przez 5 min. Usunąć 70% etanolu. Dodać 1 ml 100% etanolu i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT. 
	nuta: Organoidy można przechowywać w 100% etanolu w temperaturze pokojowej do 48 godzin przed dalszym przetwarzaniem.</li>
	<li>Podgrzewaj żel do obróbki próbek w kuchence mikrofalowej przez 20 s lub do upłynnienia. Dodać 50 μl żelu do przetwarzania próbek do probówki z organoidami. Umieść probówkę na lodzie, aż żel do obróbki próbki zestali się.</li>
	<li>Usunąć kroplę żelu do przetwarzania próbki z organoidami z probówki i umieścić między niebieskimi podkładkami z gąbki w kasecie do dalszego przetwarzania w procesorze tkankowym. Proszę poświęcić 15 minut na każdy etap zatapiania parafiny podczas dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Przeciąć organoidy zatopione w parafinie w żelu do przetwarzania próbek w odległości 4 μm. Kontynuować barwienie immunohistochemiczne zgodnie z wcześniejszym opisem16.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2FProgenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).</li>
<li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li>
<li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+And+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li>
<li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
<li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li>
<li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+the+Wild+West+of+Organoids%2C+Enteroids%2C+and+Mini-Guts%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113(2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+Natural+Academy+Of+Science+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li>
<li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li>
<li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+formation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tree+stem%2Fprogenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts%3A+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

W pracy opisano wygenerowanie organotypowego trójwymiarowego modelu mysich cholangiocytów EHBD. Ważne kroki w generowaniu hodowli EHBDO obejmują skrupulatne wypreparowanie EHBD w celu uniknięcia zanieczyszczenia komórek trzustki, utrzymanie sterylnych warunków w celu zapobieżenia skażeniu bakteryjnemu i grzybiczemu oraz staranną manipulację po odwirowaniu w celu uniknięcia utraty materiału komórkowego. Wymagane jest ścisłe przestrzeganie opisanych warunków temperaturowych. Istnieją pewne ograniczenia tej techniki. EHBD d...

Cholangiopatie są nieuleczalnymi, przewlekłymi, postępującymi zaburzeniami, które wpływają na komórki żółciowe zlokalizowane w wewnątrz- i zewnątrzwątrobowych drogach żółciowych (EHBD)1. Niektóre cholagiopatie, takie jak pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, rak dróg żółciowych, atrezja dróg żółciowych i torbiele żółciowe, wpływają głównie na EHBD. Rozwój terapii cholangiopatii jest ograniczony ze względu na ograniczoną dostępność modeli przedklinicznych. Ponadto wcześniejsze badania koncentrowały się na cholangiopatiach zgrupowanych razem: wątroba, intra- i EHBD. Jednak intra- i EHBD mają wyraźne pochodzenie embrionalne i dlatego powinny być uważane za odrębne patologie molekularne. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe rozwijają się z wewnątrzwątrobowych płytek przewodowych i czaszkowej części uchyłka wątroby, całe EHBD rozwijają się z ogonowej części uchyłka wątroby2. Opierają się również na różnych przedziałach komórek progenitorowych dla homeostazy dorosłych, w tym kanałów Heringa w wewnątrzwątrobowych drogach żółciowych i gruczołach okołożółciowych w EHBDs2,3. Wykorzystanie modeli zwierzęcych w badaniach przedklinicznych jest ograniczone kosztami i powinno być zminimalizowane ze względów etycznych. W związku z tym redukcjonistyczne, powtarzalne, efektywne czasowo i kosztowo modele in vitro są wysoce pożądane.
Większość wcześniejszych badań nad cholangiopatiami wykorzystywała normalne modele raka myszy lub szczurów, lub ludzkie linie komórkowe raka dróg żółciowych pochodzące z wewnątrz- i EHBDs4,5,6,7. Są to jednak modele transformowanych komórek i nie podsumowują normalnej biologii cholangiocytów w homeostazie lub w stanie zdrowym. Niedawny postęp w rozwoju modeli hodowli organotypowych pozwolił na opracowanie trójwymiarowych struktur z różnych typów tkanek, w tym tkanek wątroby i dróg żółciowych, chociaż nie normalnych mysich EHBDs8,9,10. Te "narządopodobne" struktury mają na celu naśladowanie tkanki pierwotnej i są hodowane w sztucznej niszy wspierającej samoodnawianie się specyficznych dla narządu komórek macierzystych/progenitorowych11.
"Organoid" to szerokie pojęcie, które najczęściej opisuje trójwymiarowe modele tkanek pochodzące z komórek macierzystych. Organoidy mogą być generowane z przeprogramowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych reprezentowanych przez embrionalne komórki macierzyste i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Mogą być również generowane z dorosłych komórek macierzystych specyficznych dla danego narządu12. Niektóre modele organoidów cholangiocytów zostały zaproponowane we wcześniejszych badaniach naukowych. W związku z tym zgłoszono organoidy pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych7,9,13 i stanowią cenne, efektywne czasowo narzędzie, które pozwala na jednoczesne generowanie różnych typów komórek. Jednak te pluripotencjalne organoidy pochodzące z komórek macierzystych nie odzwierciedlają w pełni struktury i funkcjonalności pierwotnych dorosłych cholangiocytów EHBD.
Zaproponowano również organoidy pochodzące z dorosłych komórek macierzystych human9 i feline10 wątroba. Modele kotów nie są powszechnie dostępne i mają ograniczone uzbrojenie narzędzi do celów badawczych. Co więcej, te organoidy pochodzące z dorosłych komórek macierzystych pochodzących z wątroby nie modelują cholangiocytów pozawątrobowych, ale raczej cholangiocyty wewnątrzwątrobowe.
Generowanie organoidów EHBD zostało zgłoszone z normalnych ludzkich EHBD14 i mysich EHBD cholangiocarcinoma15. Jednak dostęp do ludzkiej tkanki EHBD jest bardzo ograniczony, a organoidy pochodzące z genetycznego mysiego modelu raka dróg żółciowych 15 nie reprezentują zdrowej biologii cholangiocytów w homeostazie i pochodzą z komórek zmodyfikowanych genetycznie.
Aby rozwiązać problemy związane z ograniczeniami pluripotencjalnych modeli organoidów cholangiocytów pochodzących z komórek macierzystych i wątroby oraz ograniczonym dostępem do tkanek ludzkich potrzebnych w modelach przedklinicznych, opracowaliśmy mysi model organoidowy EHBD (Rysunek 1A). Niniejszy manuskrypt opisuje rozwój techniki pozyskiwania organoidów pochodzących z mysich tkanek pochodzących z EHBD. Te organoidy EHBD zwane EHBDO będą ważnym narzędziem in vitro do badania mechanizmów leżących u podstaw homeostazy cholangiocytów EHBD i procesów chorobowych, takich jak cholangiopatie.

<table><tbody><tr><td>L-WRN pożywka do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>1%</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>100 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Bufor myjący</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>50 ml</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>125 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B&nbsp;</td><td>6,25 &mikro; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli organoidów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Pożywka kondycjonowana&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>100 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-glutamina</td><td>10 &mikro; l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 &micro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 &mikro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td>Pożywka do wysiewu organoidów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli organoidów&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>50 ng / ml</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów-10 (FGF10)</td> <td>100 ng / ml</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cytokeratyny 19 (CK19), Królik</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Region determinujący płeć Przeciwciało Y-Box 9 (SOX9), Królik</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Przeciwciało Homeobox 1 (PDX1) trzustki dwunastnicy, Królik</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>Przeciwciało E-kadheryny, Koza</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Przeciwciało acetylowane i alfa;-tubulinowe, Mysz</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td> drugorzędowe<td></td></tr><tr><td>488 oznakowany anty-królik, osioł IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 oznakowany anty-koza, osioł IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 oznaczony anty-mysz, Koza IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>Test</td><td></td><td></td><td></td> reporterowy TopFlash Wnt</tr> <tr><td><silny>TopFlash HEK293 linia komórkowa</silny></td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania lucyferazy</td><td>Biotium</td><td></td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0,4% Trypan Blue Solution</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td>Dodatkowe materiały i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matryca podstawowa, bez fenolu Matrigel</td><td></td><td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Bufor dysocjacyjny, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>Pożywka do zamrażania kultur komórkowych, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe (70 &mikro; m, sterylizowane)</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>Ekstrakcja RNA z tiocyjanianianu guanidynianu, TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>Żel do przetwarzania próbek, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>Uniwersalny zestaw</td><td></td> do wykrywania mykoplazmy <td>ATCC</td><td>30-1012K</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka</td><td></td> do mikrowirówki <td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td></tr><tr>Płytka <td></td><td>24-dołkowa</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td>Mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipse E800 Mikroskop odwrócony Biotium 30003-2 Taca do sekcji zwłok Fisherbrand 13-814-61 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopatie, które wpływają na pozawątrobowe drogi żółciowe (EHBD), obejmują atrezję dróg żółciowych, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych i raka dróg żółciowych. Nie mają skutecznych opcji terapeutycznych. Narzędzia do badania EHBD są bardzo ograniczone. Naszym celem było opracowanie specyficznego dla narządu, wszechstronnego, opartego na dorosłych komórkach macierzystych, przedklinicznego modelu cholangiocytów, który można łatwo wygenerować z myszy dzikich i genetycznie zmodyfikowanych. W związku z tym informujemy o nowatorskiej technice opracowywania systemu hodowli organoidów EHBD (EHBDO) z dorosłych myszy EHBD. Model jest ekonomiczny, może być łatwo analizowany i ma wiele dalszych zastosowań. W szczególności opisujemy metodologię izolacji mysiego EHBD i dysocjacji pojedynczych komórek, inicjacji, rozmnażania hodowli organoidów oraz długotrwałego utrzymania i przechowywania. W tym artykule opisano również przetwarzanie EHBDO w immunohistochemii, mikroskopii fluorescencyjnej i kwantyfikacji obfitości mRNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Protokół ten ma znaczące zalety oprócz wytwarzania organoidów specyficznych dla EHBD. Zastosowanie kondycjonowanej pożywki z ogniw L-WRN znacznie obniża koszt tego modelu. Zastosowanie mysich EHBD zapewnia prawie nieograniczoną ilość tkanek do generowania hodowli, w przeciwieństwie do tkanek ludzkich. Wygenerowane mysie EHBDO zawierają czystą populację komórek nabłonkowych z markerami endodermalnych komórek progenitorowych i zróżnicowanych komórek żółciowych. Hodowane organoidy zachowują jednorodną morfologię poprzez wiele pasaży i mogą być odzyskane po długotrwałym okresie przechowywania w ciekłym azocie. Model pozwala na badanie proliferacji komórek progenitorowych dróg żółciowych, może być manipulowany farmakologicznie i może być generowany z genetycznie modyfikowanych myszy. Potrzebne są dalsze badania, aby zoptymalizować warunki hodowli w celu zwiększenia wydajności posiewu, oceny funkcjonalnej dojrzałości komórek i bezpośredniego różnicowania komórek. Pożądane jest również opracowanie modeli kokultur i bardziej neutralnej biologicznie macierzy zewnątrzkomórkowej.

Nasz protokół opisuje generowanie organoidów EHBD myszy, które są specyficzne tkankowo i pochodzą z dorosłych komórek macierzystych. Po wyhodowaniu organoidów, formowanie struktur torbielowatych można zaobserwować już 1 dzień po izolacji EHBD. Podczas generowania hodowli zazwyczaj nie obserwuje się zanieczyszczenia fibroblastami. Wydajność wysiewu EHBDO wynosi około 2%, niezależnie od tego, czy są one izolowane z myszy noworodkowych czy dorosłych (starszych niż 2 miesiące) (<strong class=...

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Ten mysi pozawątrobowy system organoidowy dróg żółciowych może rozwiązać problem ograniczonego dostępu do przedklinicznych modeli cholangiopatii oraz ograniczeń pluripotencjalnych komórek macierzystych i modeli organoidów cholangiocytów pochodzących z wątroby. Nasz model jest specyficzny dla tkanek dorosłych, redukcjonistyczny, powtarzalny oraz efektywny pod względem czasu i kosztów. Będzie to ze szczególnym skorzystaniem dla laboratoriów, które nie mają dostępu do tkanek ludzkich.Nasza technika pozwala na hodowlę niemal nieograniczonej liczby cholangiocytów pozawątrobowych dróg żółciowych w celu zbadania regeneracji tkanek i interakcji międzykomórkowych. Procedurę zademonstruje Junya Shiota, post-doc z mojego laboratorium. W celu izolacji wewnątrzwątrobowych dróg żółciowych umieść dorosłą mysz w pozycji leżącej na plecach i otwórz jamę brzuszną wzdłuż linii środkowej.Cofnij wątrobę, aby spoczęła na przeponie i użyj hemostatu, aby delikatnie pociągnąć proksymalną dwunastnicę, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy bezpośrednio poniżej wnęki wątroby. Użyj skalpela, aby oddzielić pozawątrobowy przewód żółciowy od otaczających tkanek. Trzymając proksymalny koniec wspólnego przewodu żółciowego za pomocą kleszczy, rozetnij przewód dystalnie tuż nad jego połączeniem z dwunastnicą, a następnie wypreparuj bliższy koniec przewodu od wątroby.Natychmiast umieść izolowany pozawątrobowy przewód żółciowy w szklanej płytce zawierającej zimny bufor do przemywania na lodzie, a następnie oczyść przewód żółciowy z otaczającej tkanki i zmielić na 0,5-milimetrowe odcinki. Gdy cała tkanka zostanie rozdrobniona, przenieś skrawki do probówki zawierającej 500 mikrolitrów buforu dysocjacyjnego na 20-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec dysocjacji zneutralizować bufor za pomocą 500 mikrolitrów lodowatej pożywki do hodowli komórkowych i rozcierać zawiesinę tkankową 20 razy przez igłę 18G, a następnie 20 razy przez igłę 20G.Następnie przefiltruj powstałą zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Aby ustalić hodowlę organoidów żółciowych, zbierz komórki przez odwirowanie i ostrożnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego, sterylnego PBS i przenieść komórki do 1,5-mililitrowej probówki w celu drugiego odwirowania.Ponownie zawiesić umyte osady w 120 mikrolitrach płynnej, lodowatej matrycy podstawowej i płytce 40 mikrolitrów komórek w środku każdej z trzech studzienek 24-dołkowej płytki o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na około 15 minut. Gdy matryca podstawowa stwardnieje, dodaj 600 mikrolitrów pożywki wysiewającej o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki przed powrotem płytki do inkubatora. Po trzech dniach, a następnie co trzy dni, zastąp podłoże wysiewające 600 mikrolitrami świeżej pożywki do hodowli organoidów, regularnie monitorując wzrost organoidów za pomocą odwróconego mikroskopu.Aby przejść przez pozawątrobowe kultury dróg żółciowych, należy pipetować organoidy w każdej studzience 400 mikrolitrami lodowatego PBS 10 razy na studzienkę przed przeniesieniem zawartości studzienki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek. Przepuść każdą mieszaninę przez igłę o rozmiarze 25 cztery razy, aby oddzielić organoidy i zebrać komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić komórki w matrycy podstawowej w odpowiednim stosunku do ponownego poszycia.W celu długotrwałego przechowywania organoidów w pozawątrobowych drogach żółciowych, umyj każdą studzienkę organoidów PBS o temperaturze pokojowej bez naruszania kropli matrycy piwnicznej i dodaj 500 mikrolitrów lodowatej pożywki zamrażającej do każdej studzienki. Delikatnie zawiesić organoidy i przenieść mieszaninę do indywidualnych fiolek kriogenicznych, a następnie umieścić fiolki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 48 godzin przed przeniesieniem organoidów do zbiornika z azotem w celu długotrwałego przechowywania w fazie gazowej. Aby przygotować organoidy do zatapiania w parafinie, zastąp pożywkę 500 mikrolitrami PBS o czterech stopniach Celsjusza i przenieś zawiesinę z każdej studzienki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek zawierających skroploną matrycę podstawową.Zebrać organoidy przez odwirowanie i użyć zmodyfikowanej końcówki pipety P1000, aby ostrożnie usunąć supernatanty bez naruszania osadków. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego, 4% paraformaldehydu do organoidów na nocną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka zastąpić utrwalacz jednym mililitrem PBS o temperaturze pokojowej na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej i umyć organoidy przez trzykrotne odwirowanie.Po ostatnim praniu ponownie zawiesić organoidy w jednym mililitrze 30% etanolu na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie pięciominutową inkubację w jednym mililitrze 70% etanolu w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji 70% etanolu zebrać organoidy przez odwirowanie i ponownie zawiesić organoidy w jednym mililitrze 100% etanolu na pięć minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji 100% etanolu podgrzej żel do przetwarzania próbki w kuchence mikrofalowej przez 20 sekund lub do momentu upłynnienia i dodaj 50 mikrolitrów płynnego żelu do każdej probówki organoidów.Umieść probówki na lodzie, aż żel do przetwarzania próbki zestali się i przenieś kroplę organoidów z każdej probówki między niebieskie podkładki z gąbki w kasecie w celu dalszego przetwarzania w zatapiaczu parafiny. Umieść kasetę w procesorze tkanek zaprogramowanym na 15 minut na krok, a następnie pokrój organoidy zatopione w parafinie w żelu do przetwarzania próbek w ilości czterech mikrometrów na sekcję w celu barwienia immunohistochemicznego i analizy zgodnie ze standardowymi protokołami. Skuteczność posiewu organoidów pozawątrobowych dróg żółciowych wynosi około 2% w przypadku izolacji od noworodków lub dorosłych myszy.Po drugim pasażu skuteczność posiewu organoidów pozawątrobowych dróg żółciowych pochodzących od dorosłych myszy wzrasta do 11% i pozostaje stabilna. Większość organoidów wykazuje torbielowatą morfologię we wszystkich przejściach z rzadkimi nieregularnymi organoidami. Organoidy osiągają szczyt wzrostu po pięciu do siedmiu dniach, po czym zaczynają gromadzić resztki śródświetlne i pogarszają się.Dlatego, w celu utrzymania hodowli organoidów, organoidy należy dzielić co siedem do 10 dni. Analizowane za pomocą immunofluorescencji organoidy pozawątrobowych dróg żółciowych składają się z czystej populacji komórek nabłonkowych oznaczonych E-kadheryną. Komórki organoidowe wykazują również markery komórek progenitorowych dróg żółciowych, a także markery różnicowania dróg żółciowych.Co ważne, wysoki odsetek komórek organoidowych posiada pierwotną rzęskę oznaczoną acetylowaną alfa tubuliną, co jest cechą prawidłowych cholangiocytów i sugeruje odpowiednią polaryzację komórek organoidowych. Wymagane jest ścisłe przestrzeganie opisanych warunków temperaturowych. Skrupulatne rozwarstwienie dróg żółciowych zapobiega zanieczyszczeniu komórek trzustki.Utraty materiału komórkowego można uniknąć poprzez staranną manipulację po odwirowaniu. Organoidy te mogą być wykorzystywane jako modele przedkliniczne, manipulowane genetycznie i farmakologicznie lub wykorzystywane do testowania leków i działania czynników zakaźnych. Metoda ta może być stosowana przez laboratoria, które chcą wykorzystać genetycznie zmodyfikowane modele myszy do dalszego badania mechanizmów biologii cholangiocytów.

generation-of-organoids-from-mouse-extrahepatic-bile-ducts

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano technikę izolowania cholangiocytów z pozawątrobowych dróg żółciowych u noworodków myszy. Kanaliki są skrupulatnie preparowane, a następnie komórki są izolowane przez wyrost w gęstych żelach kolagenowych. Metoda ta stanowi przydatne narzędzie do badania rozwoju i patologii pozawątrobowych dróg żółciowych.

Izolacja cholangiocytów zewnątrzwątrobowych noworodków

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Prezentujemy dość prostą i czułą metodę dokładnego oznaczania gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu modyfikatorów genetycznych i środowiskowych oraz skuteczności potencjalnych terapii w mysich modelach chorób dróg żółciowych.

Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Trójwymiarowe (3D) systemy komórkowe są istotnymi modelami do badania organogenezy. Zaproponowano metodę wytwarzania torbieli żółciowych opartą na hydrożelu i ich charakterystykę. Protokół ten odkrywa bariery w charakteryzacji 3D, dzięki prostej i niezawodnej metodzie oceny wydajności tworzenia torbieli, rozmiarów i testowania ich funkcjonalności.

Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych

Długoterminowy system hodowli organoidów 3D ex vitro został stworzony z mysich hepatocytów. Organoidy te mogą być pasażowane i manipulowane genetycznie przez infekcję lentiwirusem o konstrukcji shRNA/ektopowej, transfekcję siRNA i inżynierię CRISPR-Cas9.

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Do obserwacji zaburzeń dróg żółciowych u noworodków u myszy, niezbędny jest nienaruszony przewód żółciowy i skuteczne przygotowanie. W związku z tym z powodzeniem opracowano nowe podejście do izolowania całego pozawątrobowego układu dróg żółciowych u mysich noworodków przy zachowaniu integralności przewodu żółciowego.

Rozwarstwienie pozawątrobowego przewodu żółciowego i pęcherzyka żółciowego u dziewięciodniowych noworodków myszy

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Naucz się wytwarzać organoidy z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy do badania biologii komórek żółciowych. Ta metoda pozwala na hodowlę nieograniczonej liczby cholangiocytów i badanie regeneracji tkanek oraz interakcji komórkowych.

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Przeglądaj więcej filmów