Mikroelektrody z włókna węglowego modyfikowane nanocząstkami złota dla lepszej detekcji neurochemicznej

Metoda ta jest istotna, ponieważ umożliwia detekcję neurochemiczną z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, co może potencjalnie wzbogacić metody wykrywania neurochemicznego in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybka, łatwa i powtarzalna metoda zwiększania czułości i rozdzielczości czasowej wykrywania neuroprzekaźników. Procedurę zademonstrują Sanuja Mohanaraj i Pauline Wonnenberg, doktorantki z mojego laboratorium.

Na początek podziel materiał z włókna węglowego na pojedyncze pasma i wyciągnij pojedyncze włókno węglowe o średnicy siedmiu mikrometrów z pasma. Podłącz przewód próżniowy do kapilary ze szkła borokrzemianowego i zassaj włókno węglowe do kapilary. Następnie wytnij kawałek tektury o wymiarach 10 na 25 centymetrów, aby służył jako uchwyt elektrody.

Przyklej ręcznik papierowy do kartonu jako podparcie, a następnie włóż kapilę do uchwytu elektrody i ostrożnie zabezpiecz ją w pionowym ściągaczu kapilarnym. Skonfiguruj ściągacz kapilarny tak, aby przeciągnąć szklaną kapilę do drobnego stożka dla materiałów elektrod i uruchom go. Po zakończeniu ciągnięcia i ostygnięciu wężownicy grzewczej odetnij włókno węglowe łączące elektrody ciągnięte za rurkę.

Ostrożnie wyjmij mikroelektrody ze ściągacza kapilary. Kierując się stereoskopem lub mikroskopem, użyj ostrego ostrza lub nożyczek chirurgicznych, aby przyciąć wystające włókno węglowe na każdej elektrodzie do około 100 do 150 mikrometrów długości. Następnie w 25-mililitrowej fiolce użyj bawełnianego wacika, aby wymieszać 10 gramów żywicy epoksydowej z 0,2 mililitra utwardzacza.

Napełnij kolejną fiolkę acetonem. Dla każdej elektrody zanurz końcówkę z włókna węglowego w żywicy epoksydowej na 15 sekund, a następnie zanurz ją w acetonie na trzy sekundy, aby usunąć nadmiar żywicy epoksydowej. Po epoksydowaniu epoksydowane elektrody są następnie utwardzane w piecu przez trzy godziny w temperaturze 125 stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść mikroelektrodę z włókna węglowego w elektrodzie referencyjnej srebro-srebro-chlorek w 0,5 milimolowym roztworze kwasu chloroaurowego w 0,1-molowym wodnym roztworze chlorku potasu. Podłącz elektrody do potencjostatu z mikroelektrodą z włókna węglowego jako elektrodą roboczą. Skanuj elektrodę od 0,2 V do minus jednego wolta przy 50 miliwoltach na sekundę przez 10 cykli, aby wykonać osadzanie elektrody.

Bardzo ważne jest zoptymalizowanie parametrów osadzania powłoki złotej. Zbyt duża powłoka spowoduje zakłócenia i przeciążenie sygnału, podczas gdy zbyt mała powłoka nie poprawi wykrywania neurochemicznego. Przed badaniem należy przygotować 10-milimolowy roztwór podstawowy dopaminy w kwasie nadchlorowym i około litra buforu na bazie pH 7,4 PBS w wodzie dejonizowanej.

Odpipetować jeden mikrolitr podstawowego roztworu dopaminy do 10 mililitrów buforu, aby uzyskać około jednego mikromolowego roztworu dopaminy. Następnie podłącz mikroelektrodę z włókna węglowego i elektrodę odniesienia srebro-chlorek srebra do potencjostatu. Zamocuj elektrodę z włókna węglowego i elektrodę odniesienia w stopniu głowicy aparatu komory przepływowej i użyj mikromanipulatora, aby opuścić je do komory przepływowej.

Pobrać 60 mililitrów buforu PBS do strzykawki. Napełnij komorę przepływową buforem i zamontuj strzykawkę w pompie strzykawkowej. Rozpocznij przepływ buforu przez komórkę przepływową z szybkością jednego mililitra na minutę.

Następnie skonfiguruj potencjostat tak, aby skanował w poszukiwaniu od minus 0,4 V do 1,3 V przy 10 Hz i 400 V na sekundę. Krótko przyłóż przebieg do mikroelektrody, obserwuj oscyloskop i wyreguluj wzmocnienie, aby zapobiec przeciążeniu. Pozwól mikroelektrodzie zrównoważyć się przez 10 minut w buforze.

Następnie pobrać rozcieńczony roztwór dopaminy do strzykawki i podłączyć go do portu iniekcyjnego komory przepływowej. Ustaw całkowity czas pracy potencjostatu na 30 sekund. Rozpocznij rejestrowanie pomiarów, odczekaj 10 sekund, a następnie wstrzyknij 0,2 mililitra roztworu dopaminy do komórki przepływowej.

Po zakończeniu przebiegu przetwórz dane za pomocą oprogramowania do analizy cyklicznej woltamperometrii w wysokiej rozdzielczości. Pozwól mikroelektrodzie ponownie zrównoważyć się przez 10 minut przed wykonaniem kolejnego testu. Po zakończeniu testów wyczyść komórkę przepływową, trzykrotnie wstrzykując trzy mililitry wody i trzy mililitry powietrza do bufora i portów wtryskowych.

Powlekane włókna węglowe zobrazowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Grubość i wielkość cząstek powłok z nanocząstek złota można kontrolować za pomocą czasu osadzania elektrody. 20 minut osadzania elektrody dało grubą złotą powłokę z ostrymi grzbietami, podczas gdy pięć minut dało cienką, jednolitą złotą powłokę.

Mikroelektrody z włókna węglowego pokryte nanocząstkami złota miały znacznie wyższe szczytowe prądy utleniania i szybszą kinetykę przenoszenia elektronów niż elektrody niemodyfikowane. Powłoka z nanocząstek złota nie miała znaczącego wpływu na stabilność reakcji elektrody, jak wykazano w roztworze dopaminy. Zarówno elektrody pokryte gołymi, jak i pokrytymi nanocząstkami złota reagowały liniowo na zmiany szybkości skanowania ze znacznie większą wielkością zmian w elektrodach pokrytych złotem.

Wskazywało to, że wchłanianie dopaminy może być kontrolowane za pomocą szybkości skanowania. Zarówno gołe, jak i pokryte złotymi nanocząstkami elektrody reagowały liniowo między stężeniami dopaminy od 100 nanomolowych do 10 mikromolowych. Przy wyższych stężeniach zaobserwowano krzywą asymptotyczną wskazującą, że dopamina jest przesycona na powierzchni elektrody.

Zdolność do wykrywania zmian neurochemicznych w szybszej skali czasowej i przy wyższej czułości pomoże odpowiedzieć na złożone pytania w neurobiologii. Metoda ta ma również zastosowanie w chemii analitycznej, metabolomice i naukach o środowisku. Chociaż jest to łatwe do nauczenia, demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie dla nauki wytwarzania, modyfikowania i testowania mikroelektrod.

Przyszłe kierunki tej metody obejmują dostosowanie osadzania złota i innych powłok w celu uwzględnienia grubości, rozmiaru, kształtu i morfologii w celu optymalizacji wykrywania określonych neuroprzekaźników. Naukowcy powinni poćwiczyć obchodzenie się z małymi włóknami pod mikroskopem przed wypróbowaniem tej techniki. Również roztwór podstawowy neuroprzekaźnika powinien być przygotowany w dygestorium, ponieważ używają one 1 molowego kwasu nadchlorowego.