Name: Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków. Technika ta umożliwia bezpośrednią obserwację dynamiki wzrostu bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii, Grant-in-Aid for Young Scientist Research (No. 18K18157, 16K21034) od Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) dla M.M., oraz Grant-in-Aid od MEXT dla K.K. (No. 17H06417, 17H06413).

1. Przygotowanie GV zawierających komórki bakteryjne metodą transferu kropelek
<ol>
	<li>Przygotować podstawowe roztwory lipidów 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC, 10 mM, 1 ml) i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[biotynylo(glikol polietylenowy)-2000] (biotyna-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) w roztworze chloroformu/metanolu (2/1, v/v) i przechowywać materiał podstawowy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu oleju zawierającego lipidy
	<ol>
		<li>Wlać 20 μl roztworu POPC i 4 μl roztworu biotyny-PEG-DSPE do szklanej probówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b (i)).</li>
		<li>Odparować rozpuszczalnik organiczny za pomocą przepływu powietrza, aby utworzyć film lipidowy i umieścić film w eksykatorze na 1 godzinę, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik organiczny (<klasa strong="xfig">Rysunek 1b (ii)). 
		nuta: Konieczne jest odparowanie rozpuszczalnika organicznego w dygestorium.</li>
		<li>Dodaj 200 μl oleju mineralnego (0,84 g/ml, tabela materiałów) do szklanej fiolki (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1b (iii)).</li>
		<li>Owinąć początkową część szklanej fiolki folią i poddać sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej (120 W) przez co najmniej 1 godzinę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b (iii)). Końcowe stężenia POPC i biotyny-PEG-DSPE wynoszą odpowiednio 1 mM i 0,002 mM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna hodowla komórek bakteryjnych
	<ol>
		<li>Zaszczepić E. coli w 1x pożywce LB (1 g ekstraktu drożdżowego, 2 g baktotryptonu i 2 g chlorku sodu w 200 ml wody dejonizowanej) z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-14 godzin (przez noc).</li>
		<li>Po inkubacji zebrać 20 μl roztworu hodowlanego i przenieść do 1,98 ml świeżej pożywki 1x LB i ponownie hodować komórki przez 2 godziny.</li>
		<li>Sprawdzić gęstość optyczną roztworu do hodowli wstępnej (przygotowanego w kroku 1.3.2) przy wartości 600 nm (OD600). Należy użyć roztworu do hodowli wstępnej o średnicy zewnętrznej600 = 1,0–1,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zewnętrznych i wewnętrznych roztworów wodnych GV
	<ol>
		<li>Rozpuść glukozę w pożywce 1x LB, aby przygotować zewnętrzny wodny roztwór GV. Przygotuj 20 ml podstawowego roztworu glukozy (500 mM).</li>
		<li>Rozcieńczyć podstawowy roztwór glukozy w pożywce 1x LB do 200 mM (Tabela 1).</li>
		<li>Rozpuść sacharozę w 1x pożywce LB, aby przygotować wewnętrzny wodny roztwór GV. Przygotuj 20 ml podstawowego roztworu sacharozy (500 mM).</li>
		<li>Wymieszać roztwór do hodowli wstępnej (OD600 = 1,0–1,5), roztwór sacharozy (500 mM) i 1x pożywkę LB (tabela 1). Końcowa wartość OD600 roztworu hodowlanego powinna wynosić 0,01–0,015, a końcowe stężenie sacharozy powinno wynosić 200 mM. 
		nuta: Uważaj, aby uniknąć ciśnienia osmotycznego. Konieczne jest zrównoważenie stężenia między wewnętrznym i zewnętrznym roztworem wodnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kropelek wody w oleju (W/O) zawierających komórki bakteryjne
	<ol>
		<li>Dodać 2 μl wewnętrznego wodnego roztworu GV (przygotowanego w kroku 1.4.4) do 50 μl roztworu oleju zawierającego lipidy (olej mineralny z POPC i biotyną-PEG-DSPE) w plastikowej probówce o pojemności 0,6 ml (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1b (iv)).</li>
		<li>Zemulguj dwa składniki w plastikowej tubie, stukając w rurkę ręcznie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b (v)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powstawanie GV zawierających komórki bakteryjne
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl zewnętrznego wodnego roztworu GV (przygotowanego w kroku 1.4.2) do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml z pokrywką (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b (vi)) i delikatnie nałożyć 150 μl roztworu oleju zawierającego lipidy (olej mineralny z POPC i biotyną-PEG-DSPE) na powierzchnię zewnętrznego roztworu wodnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b (vii)). Próbkę należy inkubować w temperaturze pokojowej (RT, 25 °C) przez 10–15 minut. Sprawdź, czy granica faz oleju i roztworów wodnych jest płaska.</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworu kropelek W/O (przygotowanego w kroku 1.5.2) na granicy faz oleju i roztworu wodnego za pomocą pipety (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b (viii)).</li>
		<li>Odwirować probówkę z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml z pokrywką (od kroku 1.6.2) przez 10 minut przy 1 600 x g w temperaturze pokojowej w wirówce biurkowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1b (ix)). Po odwirowaniu odessać olej (górna warstwa) z plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml z pokrywką za pomocą pipety i zebrać GV zawierające komórki bakteryjne (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1b (x)).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie systemu obserwacji GV (System Hodowli Komórek Bakteryjnych)
<ol>
	<li>Przygotowanie małych pęcherzyków (SV) do budowy podpartej membrany dwuwarstwowej 
	<ol>
		<li>Wlać 20 μl roztworu POPC i 4 μl roztworu biotyny-PEG-DSPE do szklanej probówki (używając tego samego składu lipidowego, jaki zastosowano do przygotowania GV w kroku 1.1).</li>
		<li>Odparować rozpuszczalnik organiczny za pomocą przepływu powietrza, aby utworzyć film lipidowy i umieścić tę próbkę w eksykatorze na 1 godzinę w celu całkowitego odparowania rozpuszczalnika organicznego.</li>
		<li>Dodać 200 μl 200 mM glukozy w 1x pożywce LB (zewnętrzny wodny roztwór GV) do szklanej fiolki.</li>
		<li>Owinąć otwierającą się część szklanej fiolki folią i poddać sonikacji w łaźni ultradźwiękowej (120 W) przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Przygotuj SV metodą ekstruzji21 za pomocą mini-ekstrudera i membrany poliwęglanowej o wielkości porów 100 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ręcznie robionej komory
	<ol>
		<li>Wywierć otwór o średnicy 7 mm za pomocą wydrążonego stempla na dwustronnej uszczelce (10 mm x 10 mm x 1 mm).</li>
		<li>Wklej dwustronną uszczelkę z otworem w szkle nakrywkowym (30 mm x 40 mm, grubość 0,25–0,35 mm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie podpartej dwuwarstwowej membrany na szkle nakrywkowym w otworze studzienki
	<ol>
		<li>Dodać 30 μl roztworu SV do otworu komory (przygotowanego w ppkt 2.2) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Delikatnie przemyć otwór dwukrotnie 20 μl pożywki 1x LB zawierającej 200 mM glukozy (zewnętrzny wodny roztwór GV) przez pipetowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomienie GV na podpartej membranie dwuwarstwowej na szkle nakrywkowym w otworze komory
	<ol>
		<li>Wprowadzić 10 μl neutrawarydyny z zewnętrznym wodnym roztworem GV (1 mg/ml) do otworu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Delikatnie przemyć otwór dwukrotnie 20 μl pożywki 1x LB zawierającej 200 mM glukozy (zewnętrzny wodny roztwór GV) przez pipetowanie.</li>
		<li>Dodać cały roztwór zawierający GV (przygotowany w kroku 1.6.3) do otworu komory i uszczelnić szkłem nakrywkowym (18 mm x 18 mm, grubość 0,13–0,17 mm) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2b).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja mikroskopowa wzrostu komórek bakteryjnych wewnątrz GV
	<ol>
		<li>Ustaw mikroskopijny system ogrzewania z odwróconym mikroskopem wyposażonym w soczewkę obiektywową o aperturze numerycznej (NA) 40x/0,6 o dużej odległości roboczej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2b).</li>
		<li>Umieść komorę na mikroskopijnym systemie ogrzewania stage (<silna klasa="xfig">Rysunek 2b). Inkubować GV zawierające komórki bakteryjne w komorze w stanie statycznym przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rejestruj i rejestruj obrazy mikroskopowe wzrostu komórek bakteryjnych wewnątrz GV co 30 minut za pomocą naukowej kamery z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (sCMOS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li>
<li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li>
<li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li>
<li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li>
<li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+From+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li>
<li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesizing+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells%2C+proteins%2C+and+microbeads+in+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li>
<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
<li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li>
<li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li>
<li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li>
<li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li>
<li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li>
<li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024(2018).</li>
<li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy metodę hodowli komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz GV. Ta prosta metoda polega na tworzeniu GV zawierających komórki bakteryjne na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu metody przenoszenia kropelk. W porównaniu z innymi podejściami do otrzymywania GV zawierających komórki bakteryjne, metoda ta ma dwie zalety: (i) jest łatwa do opracowania oraz (ii) do przygotowania GV wymagana jest niewielka objętość (2 μL) roztworu próbki. Metoda przenoszenia kropelek<sup class="xref"...

Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki cieszy się coraz większym zainteresowaniem. Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki w ograniczonej przestrzeni może wyjaśnić funkcje bakteryjne, takie jak zmienność fenotypowa1,2,3,4, cell behavior5,6,7,8,9, oraz Oporność na antybiotyki<klasa SUP="XREF">10,11. Ze względu na najnowsze postępy w technikach hodowli, hodowla pojedynczych bakterii może być osiągnięta w ograniczonej przestrzeni, np. w studni chipowej4,7,8, gel droplet12,13, and water-in-oil (W/O) droplet5,11. Aby ułatwić zrozumienie lub wykorzystanie pojedynczych komórek bakteryjnych, potrzebny jest dalszy rozwój techniczny technik hodowli.
Pęcherzyki, które naśladują biologiczną błonę komórkową, to kuliste przedziały składające się z amfifilowych cząsteczek i mogą zawierać różne materiały. Pęcherzyki są klasyfikowane według wielkości i obejmują małe pęcherzyki (SVs, średnica < 100 nm), duże pęcherzyki (LV, <1 μm) i gigantyczne pęcherzyki (GV, >1 μm). SV lub LV są powszechnie używane jako nośniki leków ze względu na ich powinowactwo do biologicznej błony komórkowej14. GV były również używane jako system reaktorów do budowy protokomórek15 lub artificial-cells16. Opisano enkapsulację komórek biologicznych w GV17,18, a zatem GV wykazują potencjał jako system hodowli komórkowej w połączeniu z systemem reaktora.
Tutaj, wraz z filmem przedstawiającym procedury eksperymentalne, opisujemy, jak można wykorzystać GV jako nowe naczynia do hodowli komórkowych19. GV zawierające bakterie zostały wytworzone metodą przenoszenia kropel20, a następnie unieruchomione na podpartej membranie na szkle nakrywkowym. Wykorzystaliśmy ten system do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek wewnątrz GV w czasie rzeczywistym.

<table><tbody><tr><td>Baktotrypton</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (18 i 18 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>C018181</td><td>grubość 0,13 i ndash; 0,17 mm</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (30 i razy; 40 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>Grubość na zamówienie</td><td>0,25 dokładki; Wirówka biurkowa 0,35 mm</td></tr><tr><td></td><td>Hi-Tech Co.</td><td>ATT101</td><td>typ wirnika wahadłowego</td></tr><tr><td>Dwustronne uszczelnienie (10 &razy; 10 & razy; 1 mm)</td><td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>Szklana fiolka</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01</td><td>Rurka fermentacyjna Durham</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopijny system grzewczy</td><td>TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>Mini-ekstruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&times;/0,6 NA</td><td></td></tr><tr><td>Membrany poliwęglanowe</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>wielkość porów 100 nm</td></tr><tr><td>kamera sCMOS</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 plus</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>AS ONE</td><td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa tubka z pokrywką 0,6 ml</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml plastikowa tubka z pokrywką</td><td>Sumitomo Bakelite Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfokolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-snglycero-3-fosfoetanoloamina-N-[biotynyl(glikol polietylenowy)-2000]</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129P</td><td>Biotyna-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Opracowaliśmy metodę hodowli komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków (GV). Hodowla komórek bakteryjnych jest ważna dla zrozumienia funkcji komórek bakteryjnych w środowisku naturalnym. Dzięki postępowi technologicznemu różne funkcje komórek bakteryjnych mogą zostać ujawnione na poziomie pojedynczej komórki w ograniczonej przestrzeni. GV to kuliste mikrokompartmenty zbudowane z amfifilowych cząsteczek lipidów i mogą zawierać różne materiały, w tym komórki. W tym badaniu pojedynczą komórkę bakteryjną zamknięto w GV o wielkości 10–30 μm metodą przenoszenia kropelk, a GV zawierające komórki bakteryjne unieruchomiono na podpartej membranie na podłożu szklanym. Nasza metoda jest przydatna do obserwacji wzrostu pojedynczych bakterii w czasie rzeczywistym wewnątrz GV. Hodowaliśmy komórki Escherichia coli (E. coli) jako model wewnątrz GV, ale tę metodę można dostosować do innych typów komórek. Nasza metoda może być stosowana w naukach ścisłych i przemysłowych mikrobiologii, biologii, biotechnologii i biologii syntetycznej.

Przedstawiamy prostą metodę generowania GVs zawierających pojedyncze komórki bakteryjne z wykorzystaniem metody transferu kropli (Rysunek 1). Rysunek 1a przedstawia schemat wytrącania GVs zawierających bakterie. Krople W/O zawierające bakterie są przenoszone przez granicę fazy olej-woda (monowarstwa lipidowa) za pomocą wirowania w celu utworzenia GVs. Różnica w gęstości między sacharozą (wewnętrzny roztwór wodny) a glukozą (zewnę...

Pokazujemy jednokomórkową hodowlę bakterii wewnątrz gigantycznych pęcherzyków (GV). GV zawierające komórki bakteryjne przygotowano metodą transferu kropelkowego i unieruchomiono na podpartej membranie na szklanym podłożu w celu bezpośredniej obserwacji wzrostu bakterii. To podejście można również dostosować do innych komórek.

Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Protokół ten zapewnia środki do hodowli komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków. Łatwo jest rozwinąć gigantyczne pęcherzyki, a do przygotowania pęcherzyków potrzebna jest tylko bardzo mała objętość roztworu próbki. Procedurę zademonstruje Yuri Ota, doktorant z naszego laboratorium.Rozpocząć od dodania 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu POPC i czterech mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu biotyny-PEG-DSPE do szklanej fiolki. Odparować rozpuszczalnik organiczny za pomocą przepływu powietrza, aż utworzy się film lipidowy. Umieść folię w eksykatorze na jedną godzinę, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik organiczny.Następnie dodaj 200 mikrolitrów oleju mineralnego do fiolki. Przykryj otwór fiolki plastikową folią parafinową i poddaj sonikę zawartości fiolki w kąpieli ultradźwiękowej o mocy 120 watów przez co najmniej jedną godzinę. W przypadku preparatu z małymi pęcherzykami utwórz film lipidowy, jak właśnie pokazano, i dodaj 200 mikrolitrów 200 milimetrów glukozy w pożywce LB do filmu.Następnie poddaj folię sonifikacji o mocy 120 watów przez co najmniej godzinę, a następnie wytłaczanie powstałych gigantycznych pęcherzyków w małe pęcherzyki za pomocą mini ekstrudera i membrany poliwęglanowej o wielkości porów 100 nanometrów. W przypadku wstępnej hodowli komórek bakteryjnych należy zaszczepić E. coli z płytki LB w mililitrach pożywki LB w celu hodowli przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka przenieś 20 mikrolitrów supernatantu kultury do 1,98 mililitra świeżej pożywki LB na dodatkowe dwie godziny hodowli.Pod koniec inkubacji sprawdzić gęstość optyczną roztworu z hodowli wstępnej na poziomie 600 nanometrów lub wartość OD 600 na spektrofotometrze. Należy użyć roztworu do hodowli wstępnej o OD 600 od jednego do 1,5. Następnie wymieszać roztwór hodowli wstępnej ze świeżo przygotowanym roztworem sacharozy i świeżym pożywką LB, zgodnie z tabelą pierwszą.Aby utworzyć gigantyczne pęcherzyki, dodaj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego zewnętrznego wodnego roztworu gigantycznych pęcherzyków do 1,5 mililitrowej plastikowej probówki z pokrywką. Delikatnie nałóż 150 mikrolitrów roztworu oleju zawierającego lipidy na zewnętrzny wodny roztwór gigantycznych pęcherzyków. Powstały roztwór inkubować przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, przed sprawdzeniem, czy granica faz oleju i roztworów wodnych jest płaska.W przypadku tworzenia się kropelek w komórkach bakteryjnych wody i oleju, dodaj dwa mikrolitry świeżo przygotowanego wewnętrznego wodnego roztworu gigantycznych pęcherzyków do 50 mikrolitrów sonikowanego roztworu oleju zawierającego lipidy w plastikowej probówce o pojemności 0,6 mililitra. Następnie postukaj w probówkę, aby zemulgować oba składniki. Następnie za pomocą pipety dodaj 50 mikrolitrów roztworu wody i kropelki oleju do granicy faz oleju i roztworu wodnego, a następnie osadź gigantyczne pęcherzyki zawierające komórki bakteryjne przez odwirowanie.Następnie odessaj górną warstwę oleju i zbierz gigantyczne pęcherzyki. Aby przygotować ręcznie robioną komorę, wywierć siedmiomilimetrowy otwór za pomocą wydrążonego stempla na dwustronnej uszczelce o wymiarach 10 na 10 na jeden milimetr, a następnie wklej dwustronną uszczelkę na szkło nakrywkowe o wymiarach 30 na 40 milimetrów. Aby przygotować podpartą dwuwarstwową membranę, dodaj 30 mikrolitrów roztworu małego pęcherzyka do otworu ręcznie robionej komory.Inkubuj pęcherzyki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Pod koniec inkubacji delikatnie umyj otwór dwa razy 20 mikrolitrami pożywki LB, uzupełnionej 200 milimłynarką glukozy. Aby unieruchomić gigantyczne pęcherzyki na dwuwarstwowej membranie podtrzymującej, wprowadź 10 mikrolitrów neutrawaryny w zewnętrznym wodnym roztworze pęcherzyków olbrzymich do otworu na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji delikatnie przemyj otwór dwa razy 20 mikrolitrami pożywki LB, uzupełnionej 200 milimillerem glukozy i dodaj całą objętość roztworu gigantycznych pęcherzyków do otworu w komorze. Następnie uszczelnij otwór szklaną pokrywą o wymiarach 18 na 18 milimetrów. Aby monitorować rozwój bakterii w gigantycznych pęcherzykach, wybierz obiektyw 40X w odwróconym mikroskopie i umieść komorę w systemie podgrzewania mikroskopu.Następnie inkubuj gigantyczne pęcherzyki zawierające komórki bakteryjne w komorze w warunkach statycznych przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rejestrując i rejestrując obrazy wzrostu komórek bakteryjnych co 30 minut, za pomocą naukowej komplementarnej kamery półprzewodnikowej z tlenku metalu. Gigantyczne pęcherzyki zawierające komórki bakteryjne zwykle mają wielkość od 10 do 30 mikrometrów. W przypadku obu rozmiarów gigantycznych pęcherzyków, komórki E. coli przechodzą procesy wydłużania i podziału, przy czym niektóre komórki E. coli rosną do bardzo dużej liczby komórek w ciągu sześciogodzinnego okresu obserwacji.Względna częstość występowania gigantycznych pęcherzyków zawierających pojedynczy poziom komórek wynosi około 10% uzyskanych gigantycznych pęcherzyków, a gigantyczne pęcherzyki zamknięte na poziomie pojedynczej komórki stanowią około 50% gigantycznych pęcherzyków zawierających komórki bakteryjne. Stabilność granicy faz olej-woda jest ważna dla uzyskania gigantycznych pęcherzyków zawierających komórki bakteryjne. Uważaj, aby ostrożnie zassać olej przed korekcją gigantycznych pęcherzyków.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować komórki bakteryjne na poziomie pojedynczej komórki w pojedynczych gigantycznych pęcherzykach. Nasza metoda hodowli bakteryjnej jest nowym narzędziem w mikrobiologii do hodowli nieznanych bakterii środowiskowych w celu uzyskania lub analizy ich produktów przemiany materii.

bacterial-cell-culture-at-the-single-cell-level-inside-giant-vesicles

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Morita, M., et al. Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje metodę hodowli i obserwacji pojedynczych komórek bakteryjnych zamkniętych w gigantycznych pęcherzykach zakotwiczonych w podpartej dwuwarstwie lipidowej. System umożliwia stabilne, długoterminowe obrazowanie dynamiki wzrostu pojedynczych komórek w ograniczonym, fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku.

Jednokomórkowa hodowla bakterii w gigantycznych pęcherzykach

Źródło: Cabeen, M. T. i in. Analiza mikrofluidyczna pojedynczych komórek Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje użycie urządzenia mikrofluidycznego do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek. Pokazuje, jak nieruchome komórki bakteryjne, zamknięte w mikroskalowych rowach, są nieustannie odżywiane i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym podziału komórek i śledzenia linii genealogicznej na przestrzeni...

Śledzenie wzrostu bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w układzie mikrofluidowym

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Ten protokół opisuje metodę odwróconej emulsji używaną do hermetyzacji systemu ekspresji bezkomórkowej (CFE) w gigantycznym pęcherzyku jednowarstwowym (GUV) w celu zbadania syntezy i włączenia modelowego białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej.

Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Poznaj metodę hodowli komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków. Technika ta umożliwia bezpośrednią obserwację dynamiki wzrostu bakterii.

Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków

Przeglądaj więcej filmów