Techniczny aspekt automatycznej syntezy i oceny kinetycznej w czasie rzeczywistym [¹¹C]SNAP-7941

Znakowanie radioaktywne węglem-11 pozwala na stosowanie małych związków do pozytonowej tomografii emisyjnej lub PET bez zmiany cząsteczki. Jest to niezbędne do badania poziomów ekspresji receptorów. Zaletą znakowania radioaktywnego węglem-11 jest to, że możemy użyć PET do bezpośredniej oceny kinetyki wiązań SNAP z receptorem hormonu koncentrującego melaninę w czasie rzeczywistym.

SNAP jako antagonista receptora hormonalnego koncentrującego melaninę przyczyni się do lepszego zrozumienia tego receptora i jego związku z chorobami metabolicznymi, takimi jak otyłość i cukrzyca. Transportery wypływu ulegające ekspresji na barierze krew-mózg mogą znacznie utrudniać stosowanie radiofarmaceutyków do obrazowania ekspresji receptorów centralnych. Dlatego tak ważna jest ocena śladów in vitro.

Zautomatyzowana radiosynteza SNAP ma szerokie zastosowanie do znakowanych radioaktywnie związków o niskiej masie cząsteczkowej z łatwą do oceny grupą metylową. Po ustaleniu procedura ta może być dostosowana do innych związków. W pokazie wezmą udział doktorantki Sarah Pfaff i Theresa Balber.

Aby rozpocząć syntezę węgla-11 SNAP, należy skonfigurować moduł automatycznej syntezy czystego węgla-11 z odpowiednimi odczynnikami i materiałami. Rozpocznij proces syntezy SNAP na komputerze modułu, który rozpocznie się od sprawdzenia i kondycjonowania systemu. Na około 30 do 40 minut przed tym, jak moduł będzie gotowy do dostarczenia C-11, wybierz cel dwutlenku węgla C-11 na cyklotronie i uruchom wiązkę przy natężeniu 65 mikroamperów.

Gdy moduł będzie gotowy do dostawy, zamknij okno wewnętrzne i drzwi zewnętrzne. Upewnij się, że pułapka CO2 ostygła do co najmniej 40 stopni Celsjusza i że pułapka metanu zaczęła się ochładzać. Gdy cyklotron wytworzy około 120 gigabekereli CO2 C-11, kliknij OK w oprogramowaniu modułu, aby otworzyć drogę od celu przez pułapkę CO2.

W komputerze cyklotronowym zacznij dostarczać CO2 C-11 do modułu. Monitoruj transfer aktywności na komputerze modułu i upewnij się, że po trzech minutach przechodzi on do redukcji CO2 do metanu. Monitoruj proces, gdy powstały metan jest wypłukiwany do metanowcy i przekształcany w jodek metylu przez cyrkulację przez piec jodowy.

Na końcu sekwencji konwersji poczekaj, aż produkty uboczne zostaną wypłukane z pułapki jodku metylu do wyczerpania, a następnie potwierdź, że reaktor jest gotowy do przyjęcia aktywności, klikając przycisk OK. Monitoruj system, gdy jodek metylu jest uwalniany z pułapki, przepłukiwany przez piec triflate metylu i uwięziony w reaktorze. Gdy aktywność w reaktorze ustabilizuje się, upewnij się, że pułapkowanie zostało zakończone. Poczekaj, aż mieszanina reakcyjna zareaguje w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty.

Następnie monitoruj system, gdy mieszanina reakcyjna jest schładzana do temperatury poniżej 35 stopni Celsjusza i schładzana 1,5 mililitra wody. Monitorować system, gdy mieszanina reakcyjna jest ładowana do pętli iniekcyjnej HPLC i jest wstrzykiwana do półprzygotowawczej kolumny HPLC. Obserwuj ślady detektora UV i gamma w miarę postępu chromatografii.

Gdy szczyt produktu zacznie pojawiać się ręcznie, rozpocznij zbieranie produktu z kolby zbiorczej z okrągłym dnem w module. Ręczne zakończenie zbierania, gdy sygnał gamma spadnie poniżej około 400 zliczeń na sekundę. Obserwuj poziom płynu w kolbie okrągłodennej, gdy produkt jest ładowany do wkładu ekstrakcyjnego do fazy stałej pod ciśnieniem helu.

Gdy kolba jest pusta, a płyn przejdzie przez wkład SPE, kliknij OK, aby rozpocząć mycie produktów uwięzionych na wkładzie. Następnie należy monitorować aktywność w fiolce do pobierania produktów, ponieważ produkt jest najpierw eluowany z wkładu do fiolki, a następnie rozcieńczany 0,9% roztworem soli fizjologicznej. Obserwuj, jak roztwór produktu jest przenoszony do fiolki z produktem przez sterylny filtr pod ciśnieniem helu.

Po zakończeniu przenoszenia zamknij zawór wyjściowy produktu. Gdy radioznacznik dotrze do fiolki z produktem, należy zmierzyć bezwzględną wydajność radioaktywną. Następnie użyj strzykawki z osłoną ołowiu, aby przenieść 100 mikrolitrów znacznika do małej fiolki w celu kontroli jakości.

Przynieś próbkę kontroli jakości do osłoniętego obszaru roboczego kontroli jakości. Pobrać 40 mikrolitrów próbki kontroli jakości do gazoszczelnej strzykawki, załadować ją do przygotowanego przyrządu HPLC wyposażonego w kolumnę analityczną i wstrzyknąć produkt. Wykonaj inne pomiary kontroli jakości podczas przebiegu HPLC.

Po zakończeniu cyklu HPLC należy zintegrować wszystkie piki w chromatogramie z detektora radioaktywności, aby określić, czy czystość chemiczna radiowa SNAP jest większa niż 95%Zintegruj piki w chromatogramie UV, aby określić czystość chemiczną produktu. Użyj obszaru pod szczytem produktu UV, aby obliczyć określoną aktywność. Gdy potwierdzimy, że produkt spełnia wymagania dotyczące użycia, należy zwolnić radioznacznik do laboratorium eksperymentów kinetycznych w czasie rzeczywistym.

Co najmniej 30 minut przed eksperymentem należy przemyć przygotowane komórki typu dzikiego lub transfekowanego DPBS i dodać dwa mililitry pożywki wzrostowej bez surowicy. Aby zablokować transfekowane komórki, dodaj 0,98 mikrolitra 20,4 milimolowego roztworu racemicznego chlorowodorku werapamilu w dimetylosulfotlenku. Inkubuj komórki na ukośnej płaszczyźnie przez 30 minut.

Następnie włącz przyrząd do oznaczania w czasie rzeczywistym i powiązany z nim komputer. Otwórz oprogramowanie sterujące i wybierz jeden cel. Ustaw liczbę pozycji na dwa, czas wykrywania na trzy sekundy, czas opóźnienia wykrywania na dwie sekundy, a nazwę pierwszej fazy na linię bazową.

Włóż naczynie do hodowli komórkowych do pochyłego wspornika urządzenia z drążkiem komórkowym na spodzie. Upewnij się, że biegun komórkowy jest pokryty pożywką do hodowli komórkowych. Rozpocznij 10-minutowy pomiar tła i ustaw nazwę pliku oraz ścieżkę.

Ustaw skalę czasu na minuty, a zbiór nuklidów na węgiel-11. Skonfiguruj wykres tak, aby pokazywał tło, element docelowy i odjęte dane docelowe w tle. Po dostarczeniu radioznacznika i zatwierdzeniu go do użytku należy pobrać małą próbkę do testu.

Obliczyć potrzebną objętość roztworu radioznacznika i przygotować pipetę. W oprogramowaniu przyrządu wstrzymaj pracę i poczekaj, aż obrót naczynia się zatrzyma. Otwórz pokrywę urządzenia, obróć wspornik o 90 stopni w lewo, dodaj radioznacznik z przygotowaną pipetą i przywróć urządzenie do pozycji wyjściowej.

Zamknij pokrywę urządzenia i natychmiast wznów eksperyment. Pozwól eksperymentowi działać przez 20 minut przed jego zakończeniem. Przetwarzanie i analizowanie danych w celu oceny wychwytu SNAP w komórkach.

Teraz procedurę można powtórzyć dla kontrolnej naczyń do hodowli komórek traktowanych DMSO i linii komórkowej typu dzikiego. Testy kinetyczne w czasie rzeczywistym przeprowadzono na komórkach typu dzikiego bez ekspresji PGP, komórkach eksprymujących PGP wstępnie zablokowanych werapamilem jako inhibitorem PGP i niezablokowanych komórkach PGP. Nie zaobserwowano istotnej różnicy między komórkami nieleczonymi a komórkami traktowanymi podłożem.

Węgiel-11 SNAP szybko gromadził się w komórkach typu dzikiego, podczas gdy nie zaobserwowano akumulacji w komórkach wykazujących ekspresję PGP. Wstępne zablokowanie transportera wypływu PGP za pomocą werapamilu spowodowało akumulację SNAP w komórkach PGP porównywalną z komórkami typu dzikiego. W połączeniu z pomiarami kinetycznymi w czasie rzeczywistym, układ ten umożliwia szerokie zrozumienie farmakokinetyki związków o niskiej masie cząsteczkowej i dlatego jest bardzo ważny dla przedklinicznego rozwoju radiofarmaceutyków.

Czas i organizacja są głównymi składnikami udanej radiosyntezy węgla-11 z późniejszymi eksperymentami kinetycznymi w czasie rzeczywistym, ponieważ okres połowicznego rozpadu węgla-11 wynosi tylko 20 minut. Ze względu na krótki okres półtrwania węgla-11 wiele części tej procedury jest wykonywanych jednocześnie. Ważne jest, aby wszystkie zaangażowane osoby rozumiały zakres i czas swojej roli.

Zarówno bezpieczeństwo produktu, jak i ochrona przed promieniowaniem mają kluczowe znaczenie dla przygotowania radiofarmaceutyków. Wszystkie eksperymenty muszą być prowadzone zgodnie z zasadą ALARA lub zasadą ALARA, aby ograniczyć narażenie operatora na promieniowanie.