Pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie ¹⁴analiz NH₄⁺/¹⁵NH₄⁺ poprzez sekwencyjną konwersję do_N2O

Ekosystemy przybrzeżne i morskie są ważne jako rezerwuary do usuwania azotanów z ekosystemów lądowych. Azotany w środowisku wodnym mogą być zużywane przez kilka procesów jednocześnie. Takich jak denitryfikacja, anammox i DNRA.

Podczas gdy poprzednie badania wykazały, że DNRA jest potencjalnie odpowiedzialna za denitryfikację, badania mierzące aktywność DNRA są nadal bardzo ograniczone w porównaniu z tymi, które mierzą denitryfikację. W naszym protokole udostępniamy szczegółową procedurę pomiaru potencjalnego wskaźnika DNRA w próbkach środowiskowych. Uważamy, że potencjalny wskaźnik DNRA można obliczyć na podstawie akumulacji amonu znakowanej N15 z dodatkiem azotanów znakowanym N15.

Zaletą naszej metody w porównaniu z innymi metodami jest to, że amon jest ostatecznie przekształcany w podtlenek azotu, który ma niskie tło atmosferyczne. Nie jest również mądre, że zmierzyliśmy podtlenek azotu za pomocą kwadrupolowego spektrometru masowego chromatografii gazowej. Jest to mniej kosztowne i łatwiejsze w obsłudze niż spektrometr masowy ze stosunkiem izotopów.

Najpierw umieść 60-milimetrowy kawałek taśmy PTFE na małym arkuszu folii aluminiowej. Popiel filtr z włókna szklanego w temperaturze 450 stopni Celsjusza przez cztery godziny w piecu muflowym. Następnie umieść filtr z włókna szklanego nieco powyżej środkowego punktu dłuższej osi taśmy.

Następnie umieść 20 mikrolitrów 0,9 mola na litr kwasu siarkowego na środku filtra z włókna szklanego i natychmiast złóż taśmę PTFE za pomocą płaskiego stempla i pęsety z prostym końcem. Odwróć taśmę PTFE na filtr z włókna szklanego, a następnie uszczelnij obie strony taśmy PTFE, składając, a następnie mocno dociskając krawędź pęsetą. Za pomocą pęsety złóż otwarty koniec taśmy PTFE i dociśnij krawędź.

Uszczelnij otwarty koniec taśmy PTFE, mocno dociskając krawędź pęsetą, uważając, aby nie naciskać filtra z włókna szklanego. Przenieść 30 miligramów sproszkowanego tlenku magnezu do szklanej fiolki o pojemności 20 mililitrów i umieścić w niej powłokę PTFE. Przenieść pięć mililitrów wcześniej przygotowanej próbki lub wzorca do fiolki zawierającej tlenek magnezu i kopertę z PTFE.

I natychmiast zamknąć fiolkę szarym korkiem z gumy butylowej. Następnie należy zamknąć fiolkę aluminiowym kapslem. Potrząsać fiolkami z prędkością 150 obr./min przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Następnie zdjąć aluminiowe kapsle i korek z gumy butylowej z każdej fiolki. Usunąć kopertę z PTFE z każdej fiolki za pomocą pęsety zakończonej punktowo i dokładnie wypłukać kopertę i pęsetę wodą jonowymienną. Następnie przetrzyj kopertę i pęsetę papierem do wycierania i umieść kopertę na świeżym papierze do wycierania.

Otwórz kopertę z PTFE pęsetą z płaskim i spiczastym końcem w odwrotnej kolejności do etapów składania. Za pomocą pęsety z płaskim końcem przytrzymaj obrzeża filtra z włókna szklanego, w którym kwas siarkowy powinien być niewchłonięty. I przenieś go do probówki z 11-milimetrową nakrętką.

Opłucz pęsetę wodą jonowymienną i przetrzyj je papierem do wycierania. Dodaj jeden mililitr wody jonowymiennej do każdej probówki. Zamknij probówki nakrętkami wyłożonymi PTFE i pozostaw je na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, aby całkowicie uniknąć kationu amonu z filtra z włókna szklanego.

Następnie otwórz nakrętkę, dodaj dwa mililitry wcześniej przygotowanego odczynnika utleniającego roztwór utleniający nadsiarczan do probówki i szczelnie zamknij probówkę zakrętką, aby zapobiec stratom lub zanieczyszczeniu podczas kolejnych kroków. Postaw probówki na stojaku, zawiń je w dwuwarstwową folię aluminiową i sterylizuj w autoklawie w pozycji pionowej przez godzinę w temperaturze 121 stopni Celsjusza. Wymieszaj 100 mililitrów sterylnego buforu fosforanowego 40 milimoli na litr i 100 mililitrów sterylnego 30 milimoli na litr glukozy aseptycznie.

Dodać glicerolowy zapas P.chlororaphis do 200 mililitrów roztworu glukozy buforowanego fosforanem, w 300-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. I oczyszczaj ultra czystym strumieniem helu przez godzinę. Następnie należy dozować dwa mililitry wcześniej przygotowanej zawiesiny denitryfikatora do pięciomililitrowych fiolek.

Każdą fiolkę zakryć szarym korkiem z gumy butylowej i aluminiowym zamknięciem. Zastąp powietrze w przestrzeni nad głową ultra czystym helem, odkurzając przez trzy minuty i ładując hel przez jedną minutę. Ustaw nadciśnienie gazu w przestrzeni nad powierzchnią na 1.3 atmosfery, aby uniknąć niezamierzonego zanieczyszczenia powietrza.

Wstrzyknąć jeden mililitr próbki lub wzorca przez korek z gumy butylowej za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Następnie inkubuj fiolki przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza, w ciemnych warunkach. Następnego dnia wstrzyknąć 0,3 mililitra po sześć moli na litr wodorotlenku sodu, aby zatrzymać denitryfikację i wchłonąć dwutlenek węgla Headspace, który w przeciwnym razie zakłóci analizę podtlenku azotu.

Ponieważ dwutlenek węgla i podtlenek azotu mają tę samą masę cząsteczkową. Oznaczyć ilości podtlenku azotu o masie cząsteczkowej 44, 45 i 46 w gazie Headspace za pomocą kwadrupola GC/MS ze zmodyfikowanym portem wtryskowym. Reprezentatywne wyniki uzyskano na podstawie 15 eksperymentów azotowych w osadach słonych bagien powstałych w wyniku wielkiego trzęsienia ziemi we wschodniej Japonii w 2011 r. w rejonie księżyca w mieście Kesennuma i prefekturze Miyagi w Japonii.

Wzrost znakowanego stężenia amonu w całym okresie inkubacji zaobserwowano dla wszystkich osadów zebranych w strefach podpływowych i międzypływowych. Wskaźniki DNRA mieściły się w przedziale od 24,8 do 177. I są porównywalne z wartościami podawanymi w poprzednich badaniach, ale wyższe niż wartości uzyskane z podobnych środowisk.

Wysoki wskaźnik DNRA można wytłumaczyć tym, że słone bagna były wykorzystywane jako pole uprawne przed trzęsieniem ziemi. Zgodnie ze spekulacjami, wskaźnik DNRA w strefie pływów, która jest bogata i zawiera związki organiczne w porównaniu ze strefą podpływową, był wyższy. Nasz protokół ma szerokie zastosowanie do analizy szlaków metabolicznych, które obejmują tworzenie amonu i dodawanie śladowych ilości N15.