Name: Pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+ poprzez sekwencyjną konwersję doN2O (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę pomiaru potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu w próbkach środowiskowych przy użyciu izotopów azotu-15 i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Naoto Tanace za pomoc w zbieraniu danych i rozwijaniu protokołu. Pobranie próbek zostało wsparte przez JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

1. Przygotowanie otoczki z PTFE do ilościowego wychwytywania gazowego NH3
<ol>
	<li>Umieść 60-milimetrowy kawałek taśmy politetrafluoroetylenowej (PTFE) (o szerokości 25 mm) na małym arkuszu folii aluminiowej (o wymiarach około 300 mm x 450 mm, przetartym etanolem).</li>
	<li>Popielić filtr z włókna szklanego (o średnicy 10 mm i wielkości porów 2,7 μm) w temperaturze 450 °C przez 4 godziny w piecu muflowym. Umieść filtr z włókna szklanego nieco powyżej punktu środkowego dłuższej osi taśmy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a).</li>
	<li>Umieść 20 μl 0,9 mol/L H2SO4 na środku filtra GF/D i natychmiast złóż taśmę PTFE za pomocą dwóch pęset: pęsety z płaskim końcem i pęsety z prostym końcem. Poniższe kroki, kroki 1.4–1.7, są pokazane w Rysunek 1 i powinny być wykonane szybko.</li>
	<li>Odwróć taśmę PTFE na filtr GF/D na przerywaną linię pokazaną na <silna klasa="xfig">Rysunek 1a, aby utworzyć kształt pokazany na <silna klasa="xfig">Rysunek 1b.</li>
	<li>Uszczelnij obie strony, składając, a następnie mocno dociskając krawędź pęsetą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1c). Nie naciskaj zbyt mocno i nie rysuj taśmy PTFE.</li>
	<li>Złóż otwarty koniec pęsetą, a następnie dociśnij krawędź pęsetą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1d).</li>
	<li>Uszczelnij otwarty koniec, mocno dociskając krawędź pęsetą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1e). Podczas tej procedury nie należy wciskać filtra GF/D.</li>
</ol>
2. Przygotowanie biomasy denitryfikatora z niedoborem reduktazy podtlenku azotu, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, do metody denitryfikatora
<ol>
	<li>Umieść 20% zapas glicerolu Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 na płytkach agarowych z bulionu sojowego tryptonu (TSB) o sile 1/4. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 2–3 dni.</li>
	<li>Przenieść pojedynczą kolonię P. chlororaphis do małej probówki zawierającej 5 ml autoklawowanej pożywki TSB i hodować ją tlenowo (bez wstrząsania) przez jeden dzień w temperaturze 25 °C w ciemności, aż do uzyskania maksymalnego wzrostu; zostanie ona wykorzystana jako hodowla wstępna.</li>
	<li>Przenieść 3 ml kultury wstępnej do 1-litrowej butelki z korkiem z gumy silikonowej, zawierającej 1 l świeżo przygotowanego, autoklawowanego, zmodyfikowanego TSB uzupełnionego 10 mmol/L KNO323. Inkubować butelkę, mieszając przy użyciu mieszadła, w ciemnych warunkach w temperaturze 25 °C. Po uprawie przez 8 godzin zastąp korek z gumy silikonowej nakrętką i szczelnie zamknij. Kontynuuj uprawę w anoksji przez noc.</li>
	<li>Odwirować kulturę przy 18 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek biomasy.</li>
	<li>Przemyć upakowaną biomasę trzykrotnie 30 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (D-PBS(-), pH 7,5), aby całkowicie wyeliminować NO3−. Warunki wirowania są takie same jak w kroku 2.3.</li>
	<li>Po umyciu ponownie zawiesić upakowaną biomasę za pomocą 30 ml D-PBS(-). Użyj 1 ml zawiesiny, aby oznaczyć gęstość komórek, mierząc OD600. Odpipetować 1 ml podwielokrotności pozostałej zawiesiny do sterylnych kriowiali zawierających 0,8 ml 45% glicerolu. Przygotowane zapasy glicerolu należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (patrz punkt 6).</li>
</ol>
3. Eliminacja tlenu, azotynów i azotanów z osadu próbki
<ol>
	<li>Zważyć 3,0 g (mokra masa) osadu do szklanej fiolki o pojemności 20 ml i dodać 9,0 ml wody powierzchniowej w celu zawieszenia (25% w/w zawiesiny).</li>
	<li>Zamknąć fiolkę czarnym korkiem z gumy butylowej (umytym wodą jonowymienną i wysterylizowanym w autoklawie) i aluminiowym wieczkiem.</li>
	<li>Oczyść zawieszenie i wymień powietrze w przestrzeni nad głową na Ar (>99,99%) w ilości 0,6 l/min przez 20 minut za pomocą kolektora.</li>
	<li>Zastąp gaz Ar headspace ultraczystym (>99,99995%) He, odkurzając przez 90 s i ładując He przez 30 s. Powtórz tę procedurę cztery razy. Ustaw ciśnienie gazu w przestrzeni nad głową na 1.5 atm.</li>
	<li>Inkubować fiolki w temperaturze 20 °C przez noc z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min w ciemności przy użyciu wytrząsarki o stałej temperaturze w celu wyeliminowania pozostałego tlenu, azotanów i azotynów w zawiesinie osadu i gazie w przestrzeni nadbrzeżnej.</li>
</ol>
4. Eksperyment z kursem czasowym do określenia wskaźnika DNRA
<ol>
	<li>Zastąp gaz w przestrzeni nadprożowej świeżym, ultraczystym He, stosując tę samą procedurę, co w kroku 3.5, ale bez czterech powtórzeń.</li>
	<li>Dodać oznakowane i nieoznakowane substraty do każdej fiolki zgodnie z Tabelą 1 przez korek z gumy butylowej za pomocą gazoszczelnej strzykawki. Przedtem przygotowane roztwory substratów należy przepłukać szklanymi fiolkami o odpowiedniej wielkości za pomocą ultra-czystego He przy ciśnieniu przestrzeni nad głową ustawionym na 1,5 atm, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza. Należy unikać niezamierzonego wstrzyknięcia jakiejkolwiek ilości powietrza podczas zabiegów wstrzykiwania.</li>
	<li>Inkubować fiolki w temperaturze 20 °C, wytrząsając z prędkością 150 obr./min. Dodać substraty do każdej fiolki zgodnie z tabelą 1 i inkubować przez 1 h, 3 h i 5 h. Po zatrzymaniu inkubacji zawiesinę osadu w fiolkach należy poddać następującym procedurom: kroki 4.4–4.9.</li>
	<li>Zdjąć aluminiowe wieczko i korek z gumy butylowej z każdej fiolki. Następnie dodać KCl (spopielany w temperaturze 450 °C przez 4 godziny) do zawiesiny osadu do końcowego stężenia około 2 mol/l, aby zapewnić odzyskanie NH4+ z osadu. Zamknąć fiolki korkiem z gumy butylowej i aluminiowym zamknięciem.</li>
	<li>Potrząsać osadem z prędkością 150 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemnych warunkach, aby wyekstrahować NH4+.</li>
	<li>Przenieść całą zawiesinę osadu z fiolki do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wypłucz wewnętrzną ściankę świeżo otwartej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml i przymocuj ją do świeżo otwartego jednorazowego filtra membranowego z octanu celulozy (wielkość porów 0,22 μm, średnica 25 mm). Następnie przepłukać filtr membranowy 1 ml supernatantu. Umieść przepłukaną strzykawkę-filtr na 20-mililitrowej butelce polipropylenowej (PP) z szerokim otworem.</li>
	<li>Przefiltrować pozostały supernatant przez filtr membranowy octanowy do butelki PP o pojemności 20 ml. Przechowywać ekstrakty ekstraktów w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Wychwytywanie rozproszonego NH4+ w 2M H2SO4 absorbowanego przez filtr GF/D w powłoce PTFE i utlenianie nadsiarczanu NH4+ do NO3−
<ol>
	<li>Przygotować roztwory wzorcowe 14NH4Cl o gradientach stężeń 0 μmol/l, 10 μmol/l, 40 μmol/l, 100 μmol/l, 200 μmol/l, 400 μmol/l i 500 μmol/l. Do analizy stosunku 15N ustalić całkowite stężenie NH4+ na 200 μmol/l i przygotować proporcje izotopów 100:0, 99,5:0,5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 i 10:90 z czystymi roztworami wzorcowymi 14NH4Cl i 15NH4Cl.</li>
	<li>Przenieść 30 mg MgO (spopielanej w temperaturze 450 °C przez 4 godziny) do szklanej fiolki o pojemności 20 ml i umieścić w niej powłokę z PTFE.</li>
	<li>Przenieść 5 ml próbki lub wzorca do fiolki zawierającej MgO i powłokę PTFE i natychmiast zamknąć szarym korkiem z gumy butylowej. Uszczelka z aluminiową nasadką. Jeżeli oczekuje się, że stężenie NH4+ przekroczy 500 μmol/l, rozcieńczyć próbkę do poziomu poniżej 500 μmol/l.</li>
	<li>Potrząsać fiolkami z prędkością 150 obr./min przez 3 godziny w temperaturze 4 °C w ciemnych warunkach.</li>
	<li>Zdejmij aluminiową nasadkę i korek z gumy butylowej. Wyjmij kopertę z PTFE z fiolki za pomocą pęsety z końcówką punktową, dokładnie wypłucz kopertę i pęsetę wodą jonowymienną, przetrzyj je papierem do wycierania, a następnie umieść kopertę na świeżym papierze do wycierania.</li>
	<li>Otwórz kopertę z PTFE za pomocą pęsety (zaleca się użycie zarówno pęsety z płaską, jak i spiczastą końcówką) dokładnie w odwrotnej kolejności niż składanie wykonane w krokach 1.4–1.7.</li>
	<li>Przytrzymaj peryferyjny obszar filtra GF/D, w którym H2SO4 ma być niewchłonięty, pęsetą z płaskim końcem i przenieś ją do 11-mililitrowej probówki z nakrętką z nakrętką z nasadką wyłożoną PTFE. Opłucz pęsetę wodą jonowymienną i przetrzyj je papierem do wycierania.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.5–5.7 dla pozostałych kopert.</li>
	<li>Dodaj 1 ml wody jonowymiennej do każdej z probówek, zamknij nakrętkę i utrzymuj ją bez wstrząsania przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, aby całkowicie wymyć NH4+ z filtra GF/D. Na tym etapie wykonaj równolegle kolejny krok (krok 5.10).</li>
	<li>Przygotuj odczynnik do roztworu utleniającego nadsiarczany (POR)25,26.
	<ol>
		<li>Ponieważ nie można go przechowywać, należy przygotować dokładną ilość POR potrzebną do obróbki próbek w ciągu jednego dnia.</li>
		<li>Aby przygotować POR do traktowania 50 próbek, wlej 100 ml wody jonowymiennej do butelki z zakrętką o pojemności 200 ml i dodaj 1,52 g NaOH (stopień analizy związków azotu), 3 g kwasu borowego i 5 g K2S2O8 (stopień analizy azotu i fosforu) w tej kolejności. Natychmiast po dodaniu każdego odczynnika wstrząsać roztworem, aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Jeśli to konieczne, namocz butelkę w ciepłej wodzie, aby pomóc w rozpuszczeniu chemikaliów; należy jednak zwrócić uwagę na zanieczyszczenie NO3−, ponieważ woda z kranu zwykle zawiera NO3−.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po kroku 5.8 otwórz nakrętkę, dodaj 2 ml odczynnika POR do probówki i szczelnie zamknij probówkę nakrętką, aby zapobiec stratom lub zanieczyszczeniu podczas kolejnych kroków.</li>
	<li>Postaw probówki na stojaku, zawiń je w dwuwarstwową folię aluminiową i sterylizuj w autoklawie przez 1 godzinę w temperaturze 121 °C. Podczas tego etapu utrzymuj probówki w pozycji pionowej i unikaj gwałtownych zmian temperatury po zakończeniu autoklawowania.</li>
</ol>
6. Oznaczanie NO3− przekształconego z NH4+ metodą denitryfikacyjną przy użyciu kwadrupola GC/MS
<ol>
	<li>Wymieszaj 100 ml sterylnego buforu fosforanowego 40 mmol/l (pH 7,2) i 100 ml sterylnej glukozy 30 mmol/l w asepcie (20 mmol/l fosforanu i 15 mmol/l glukozy; końcowy).</li>
	<li>Dodać 1/7,2 objętości glicerolu P. chlororaphis do 200 ml buforowanego fosforanem roztworu glukozy w 300-mililitrowej kolbie Erlenmeyera i przeczywać ultraczystym strumieniem He (>99,995%) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dozować 2,0 ml zawiesiny denitryfikatora do każdej fiolki o pojemności 5 ml. Zakręć fiolki szarym korkiem z gumy butylowej i aluminiowym zamknięciem.</li>
	<li>Zastąp powietrze w przestrzeni nad głową ultra czystym He, odkurzając przez 3 minuty i ładując He przez 1 minutę. Ustaw dodatnie ciśnienie gazu w przestrzeni nad głową na 1.3 atm, aby uniknąć niezamierzonego zanieczyszczenia powietrza.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 ml próbki lub wzorca przez korek z gumy butylowej za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml. Zanotuj dokładną ilość faktycznie wstrzykniętej próbki.</li>
	<li>Fiolki należy inkubować przez noc w temperaturze 25 °C w ciemności.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,3 ml 6-mol/LL NaOH, aby zatrzymać denitryfikację i wchłonąć CO2 w przestrzeni nadpowierzchniowej, co w przeciwnym razie poważnie zakłóci analizęN2Ometodą GC/MS, ponieważCO2 iN2Omają tę samą masę cząsteczkową.</li>
	<li>Określić ilości 44N2O, 45N2O i 46N2O w gazie w przestrzeni nad powierzchnią za pomocą kwadrupola GC/MS ze zmodyfikowanym portem wtrysku25. Warunki pracy stosowane do analizy GC/MS przedstawiono w tabeli 2.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Wyprowadzić krzywą kalibracyjną dla stężenia NH4+ z liniowej zależności między znanym stężeniem 14NH4+ a zmierzonymi intensywnościami sygnału całkowitego wytworzonego 44N2O + 45N2O + 46N2O. Wyprowadzić krzywą kalibracyjną dla zawartości 15N z liniowej zależności między znanym atomem % (tj. 15N/14N+15N) i obliczony atom% przy użyciu wcześniej podanego równania27. Obliczyć stężenie 15NH4+, mnożąc całkowity NH4+ przez stosunek 15N NH4+.</li>
	<li>Oblicz potencjalną szybkość DNRA, korzystając z równań podanych w innym miejscu28,29,30.</li>
</ol>

<ol><li>Gruber, N., Galloway, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Earth-system+perspective+of+the+global+nitrogen+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle.</a> Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nitrogen+Cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">The Nitrogen Cascade.</a> Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).</li>
<li>Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRysgaard%2C+S+%22Coastal+Lagoon+Eutrophication+and+Anaerobic+Processes+%28C.L.E.AN.%29.+Developments+in+Hydrobiology%22">Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology</a>. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).</li>
<li>Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sediment+mineralization%2C+nutrient+fluxes%2C+denitrification+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+in+an+estuarine+fjord+with+sea+cage+trout+farms%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).</li>
<li>Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycling+through+a+fringing+marsh-aquifer+ecotone%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone.</a> Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).</li>
<li>An, S. M., Gardner, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+%28DNRA%29+as+a+nitrogen+link%2C+versus+denitrification+as+a+sink+in+a+shallow+estuary+%28Laguna+Madre%2FBaffin+Bay%2C+Texas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas).</a> Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).</li>
<li>Gardner, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+fixation+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+%28DNRA%29+support+nitrogen+dynamics+in+Texas+estuaries%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries.</a> Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).</li>
<li>Preisler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+chemical+sulfide+oxidation+in+a+Beggiatoa+inhabited+marine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment.</a> The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).</li>
<li>Gardner, W. S., McCarthy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+dynamics+at+the+sediment-water+interface+in+shallow%2C+sub-tropical+Florida+Bay%3A+why+denitrification+efficiency+may+decrease+with+increased+eutrophication%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication.</a> Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).</li>
<li>Dong, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+benthic+denitrification%2C+nitrate+ammonification%2C+and+anammox+process+rates+and+nitrate+and+nitrite+reductase+gene+abundances+along+an+estuarine+nutrient+gradient+%28the+Colne+estuary%2C+United+Kingdom%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom).</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).</li>
<li>Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+increased+nitrate+loading+on+nitrate+reduction+via+denitrification+and+DNRA+in+salt+marsh+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments.</a> Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).</li>
<li>Dong, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+reduction+of+nitrate+to+ammonium%2C+not+denitrification+or+anammox%2C+dominates+benthic+nitrate+reduction+in+tropical+estuaries%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries.</a> Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).</li>
<li>Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen-limited+mangrove+ecosystems+conserve+N+through+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium.</a> Scientific Reports. 2, 419(2012).</li>
<li>Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+activity+distribution+of+dissimilatory+nitrate+reduction+in+coastal+marine+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments.</a> Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).</li>
<li>Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anammox+denitrification+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+in+the+East+China+Sea+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment.</a> Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).</li>
<li>Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+membrane+inlet+mass+spectrometer+method+to+measure+15NH4%2B15%2B+for+isotope-enrichment+experiments+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems.</a> Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tidal+pumping+facilitates+dissimilatory+nitrate+reduction+in+intertidal+marshes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes.</a> Scientific Reports. 6, 21338(2016).</li>
<li>Bu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+Nitrate+Reduction+to+Ammonium+in+the+Yellow+River+Estuary%3A+Rates%2C+Abundance%2C+and+Community+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity.</a> Scientific Reports. 7, 6830(2017).</li>
<li>Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denitrification%2C+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium%2C+and+nitrogen+fixation+along+a+nitrate+concentration+gradient+in+a+created+freshwater+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland.</a> Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).</li>
<li>Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+Nitrate+Reduction+Processes+in+Typical+Chinese+Paddy+Soils%3A+Rates%2C+Relative+Contributions%2C+and+Influencing+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors.</a> Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).</li>
<li>Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+in+upland+tropical+forest+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils.</a> Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).</li>
<li>Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+15N%E2%80%93NH4%2B+in+marine%2C+estuarine+and+fresh+waters%3A+An+adaption+of+the+ammonia+diffusion+method+for+samples+with+low+ammonium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations.</a> Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).</li>
<li>Sigman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+method+for+the+nitrogen+isotopic+analysis+of+nitrate+in+seawater+and+freshwater%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater.</a> Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).</li>
<li>Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updates+to+instrumentation+and+protocols+for+isotopic+analysis+of+nitrate+by+the+denitrifier+method%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).</li>
<li>Isobe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+techniques+for+quantifying+15N%2F14N+of+nitrate%2C+nitrite%2C+total+dissolved+nitrogen+and+ammonium+in+environmental+samples+using+a+gas+chromatograph+equipped+with+a+quadrupole+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Environments%22%5BJournal%5D)">Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer.</a> Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).</li>
<li>Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+15N+enrichment+of+dissolved+organic+nitrogen+in+environmental+waters+by+gas+chromatography%2Fnegative-ion+chemical+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry.</a> Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).</li>
<li>Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+contributions+of+nitrification+and+denitrification+to+the+flux+of+nitrous+oxide+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).</li>
<li>Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-replete+benthic+microalgae+as+a+source+of+dissolved+organic+carbon+to+coastal+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Estuaries+and+Coasts%22%5BJournal%5D)">Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters.</a> Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).</li>
<li>Huygens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+retention+of+bioavailable+nitrogen+in+volcanic+rainforest+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Geoscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils.</a> Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).</li>
<li>Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+importance+of+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+for+the+terrestrial+nitrogen+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle.</a> Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).</li>
<li>Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNRA+community+structure+and+activity+in+a+shallow+lagoonal+estuarine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 460(2014).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+nitrate+reduction+processes+in+sediments+of+urban+river+networks%3A+Spatiotemporal+variations+and+environmental+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications.</a> Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).</li>
<li>Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+biogeochemical+investigation+of+sedimentary+nitrogen+cycling+communities+responding+to+tidal+and+seasonal+dynamics+in+Cape+Fear+River+Estuary%5BTitle%5D)+AND+%22Estuarine%2C+Coastal+and+Shelf+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary.</a> Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).</li>
<li>Deng, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+nitrate+reduction+processes+and+associated+contribution+to+nitrogen+removal+in+sediments+of+the+Yangtze+Estuary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Geophysical+Research%3A+Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).</li>
<li>Tiedje, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTiedje%2C+JM+%22Biology+of+Anaerobic+Microorganisms%22">Biology of Anaerobic Microorganisms</a>. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).</li>
<li>Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denitrification%3A+ecological+niches%2C+competition+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Denitrification: ecological niches, competition and survival.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).</li>
<li>Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+organic+carbon+and+nitrate+loading+on+partitioning+between+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+%28DNRA%29+and+N2+production%5BTitle%5D)+AND+%22Geochimica+et+Cosmochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164(2015).</li>
<li>Sigman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+abundance-level+measurement+of+the+nitrogen+isotopic+composition+of+oceanic+nitrate%3A+an+adaptation+of+the+ammonia+diffusion+method%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method.</a> Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).</li>
<li>Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+microdiffusion-hypobromite+oxidation+method+for+determining+nitrogen-15+isotope+in+ammonium%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Science+Society+of+America+Journal%22%5BJournal%5D)">Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium.</a> Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).</li>
<li>Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+chromatographic+analysis+of+15N%3A14N+ratios+in+ammonium+or+nitrate+for+isotope+addition+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments.</a> Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stężenie i stosunek izotopów NH4+ do analizy DNRA określono ilościowo przy użyciu kilku metod. Stężenia i stosunki izotopów NH4+ są na ogół mierzone oddzielnie. Stężenie NH4 + jest zwykle mierzone metodami kolorymetrycznymi, w tym autoanalizatorem 4,10,15,16,17. Pomiar stosunku izotopów ma duże ...

Sztuczna synteza nawozu azotowego i jego powszechne stosowanie znacznie zakłóciły globalny obieg azotu. Szacuje się, że transfer reaktywnego azotu z systemów lądowych do przybrzeżnych podwoił się od czasów przedindustrialnych1. Znaczna część nawozów stosowanych na danym polu jest wypłukiwana z gleby do rzek lub wód gruntowych, przede wszystkim jako NO3− 2. Może to powodować problemy środowiskowe, takie jak zanieczyszczenie wody pitnej, eutrofizacja i powstawanie niedotlenienia. NO3− w środowisku wodnym jest usuwany lub zatrzymywany w ekosystemie poprzez asymilację biologiczną i różne procesy dysymilacji mikrobiologicznej. Wiadomo, że denitryfikacja i anammox są głównymi procesami usuwania mikrobiologicznego NO3−. Denitryfikacja to mikrobiologiczna redukcja NO3− do gazowych produktów N (NO,N2OiN2) w połączeniu z utlenianiem donora elektronów, takiego jak substancje organiczne, zmniejszając w ten sposób ryzyko wystąpienia wyżej wymienionych problemów. Anammox wytwarza również N2 z NO2− i NH4+; w związku z tym usuwa nieorganiczny N z ekosystemu. I odwrotnie, DNRA działa na rzecz zatrzymania N w ekosystemie; ogólnie przyjmuje się, że DNRA jest wykonywana głównie przez bakterie fermentatywne lub bakterie chemolitoautotroficzne i że redukują one dysymilacyjny NO3− do biodostępnego i mniej mobilnegoNH4+.
Badania nad DNRA były głównie prowadzone w ekosystemach morskich lub ujściach rzek, takich jak osady oceaniczne lub ujścia rzek oraz woda, słona lub słonawa gleba bagienna i gleba namorzynowa. Ekosystemy przybrzeżne lub morskie są ważne jako rezerwuary do usuwania NO3− z ekosystemów lądowych, a w poprzednich badaniach wykazano, że DNRA przyczynia się do bardzo szerokiego zakresu usuwania NO3− (0–99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Co więcej, istnienie DNRA zostało zademonstrowane w szerokim zakresie środowisk, w tym w środowiskach słodkowodnych19, glebach ryżowych20 i glebach leśnych21. Chociaż badania te wykazały, że DNRA jest potencjalnie porównywalna z denitryfikacją w celu usunięcia NO3−, badania mierzące aktywność DNRA są nadal bardzo ograniczone w porównaniu z tymi, które mierzą denitryfikację.
Wskaźnik DNRA został oceniony przy użyciu 15technik znakowania N w połączeniu z analizą danych za pomocą modeli analitycznych lub numerycznych. Jedno z rozwiązań analitycznych do obliczania wskaźnika DNRA opiera się na wzroście wzbogacenia puli NH4+ w 15N po dodaniu 15NO3− jako znacznika. 15Znakowany N NO3− dodaje się do próbki i inkubuje, a następnie można obliczyć szybkość DNRA na podstawie zmian stężenia i stosunku izotopów w NH4+ przed i po pewnym czasie. W artykule szczegółowo opisano metodę ilościowego oznaczania stężenia NH4+ i stosunku izotopów, które są wymagane do obliczenia wskaźnika DNRA. Zasadniczo, opisana tutaj metoda jest kombinacją kilku wcześniej zgłoszonych technik22,23,24,25,26 z dodanymi modyfikacjami niektórych procedur. Metoda składa się z szeregu pięciu procedur składowych: (1) inkubacja próbki środowiskowej ze zmianą znacznika stabilnego izotopu, 15NO3−, (2) ekstrakcja i odzysk NH4+ przy użyciu "procedury dyfuzji" z modyfikacjami, (3) utlenianie nadsiarczanu NH4+ w próbce, składającej się z rodzimych NH4+ i 15NH4+ pochodzących z 15NO3− poprzez aktywność DNRA, do NO3− i 15NO3−, (4) późniejsza mikrobiologiczna transformacja izotopomerów NO3− i 15NO3− doN2O metodą zmodyfikowanego denitryfikatora oraz (5) oznaczanie ilościowe N2Izotopomery O przy użyciu chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC/MS). W następnej sekcji najpierw opisano przygotowanie do zabiegów (2) i (4), a następnie szczegółowo opisano wszystkie pięć procedur składowych.

<table><tbody><tr><td>15N-KNO3</td><td>SHOKO SCIENCE</td><td>N15-0197</td><td></td></tr><tr><td>15N-NH4Cl</td><td>SHOKO SCIENCE</td><td>N15-0034</td><td></td></tr><tr><td>Butelka PP 20 ml</td><td>SANPLATEC</td><td>61-3210-18</td><td>Nakrętka</td></tr><tr><td>aluminiowa</td><td>szerokokątna Maruemu</td><td>1307-13</td><td>nr 20, z otworem</td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>borowyWako</td><td>021-02195</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>HITACHI</td><td>Himac CR21G II</td><td></td></tr><tr><td>Ciśnienie i ciśnienie gazu odtlenionego Wymień wtryskiwacz</td><td>SANSIN INDUSTRIAL</td><td>IP-12</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy filtr membranowy z octanu celulozy</td><td>ADVANTEC</td><td>25CS020AS</td><td>Wielkość porów 0,22 i mikro; m, średnica 25 mm</td></tr><tr><td>Strzykawka jednorazowa</td><td>Termo</td><td>SS-10SZ</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Strzykawka jednorazowa</td><td>Termo</td><td>SS-01T</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (-)</td> <td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td><td>5913</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka gazoszczelna</td><td>VICI Valco Instruments</td><td>4075-15010</td><td>Seria A-2, 100 i mikro; L</td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>shimadzu</td><td>GCMS-QP2010ultra</td><td></td></tr><tr><td>GF/D</td><td>Whatman</td><td>1823-010</td><td>o średnicy 10 mm Szklana</td></tr><tr><td>fiolka</td><td>Maruemu</td><td>0501-06</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Szary korek z gumy butylowej</td><td>Maruemu</td><td>1306-03</td><td>No.20-S</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Wako</td><td>192-04696</td><td>Gwarantowany odczynnik</td></tr><tr><td>K2S2O8</td><td>Wako</td><td>169-11891</td><td>Klasa do analizy azotu i fosforu</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td>Gwarantowany odczynnik</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Wako</td><td>160-04035</td><td>Gwarantowany odczynnik</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>191-08625</td><td>Klasa analizy związków azotu</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>017-02995</td><td>Gwarantowany odczynnik</td></tr><tr><td>Plastikowa probówka wirówkowa</td><td>ASONE</td><td>1-3500-22</td><td>50 mL, VIO-50BN</td></tr><tr><td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC 13985</td><td>Liofilizowany, typ szczepu Pseudomonas aureofaciens</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca PTFE</td><td>Sigma-Aldrich Z221880</td><td></td><td>szerokości 25 mm</td></tr><tr><td>Wytrząsarka posuwisto-zwrotna</td><td>TAITEC</td><td>0000207-000</td><td>NR-10</td></tr><tr><td>Probówka z nakrętką</td><td>IWAKI</td><td>84-0252</td><td>11 ml</td></tr><tr><td>Nasadka wyłożona PTFE do probówki</td><td>IWAKI</td><td>84-0262</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>Difco Laboratories</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie 14analiz nh4+/15nh4+ poprzez sekwencyjną konwersję don2o

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Znaczenie zrozumienia losu azotanu (NO3−), który jest dominującym gatunkiem N przeniesionym z ekosystemów lądowych do wodnych, wzrasta, ponieważ globalne ładunki azotu dramatycznie wzrosły po industrializacji. Dysymilacyjna redukcja azotanów do amonu (DNRA) i denitryfikacja to procesy mikrobiologiczne, które wykorzystują NO3− do oddychania. W porównaniu z denitryfikacją, ilościowe oznaczenia aktywności DNRA przeprowadzono jedynie w ograniczonym zakresie. Doprowadziło to do niewystarczającego zrozumienia znaczenia DNRA w przemianach NO3− i czynników regulujących ten proces. Celem artykułu jest przedstawienie szczegółowej procedury pomiaru potencjalnego wskaźnika DNRA w próbkach środowiskowych. Krótko mówiąc, potencjalną szybkość DNRA można obliczyć na podstawie szybkości akumulacji 15znakowanych N amonu (15NH4+) w inkubacji 15NO3−. Oznaczanie 14stężeńNH4+ i 15NH4+ opisanych w niniejszej pracy składa się z następujących etapów. Najpierw NH4+ w próbce jest ekstrahowany i zatrzymywany na zakwaszonym szklanym filtrze jako sól amonowa. Po drugie, uwięziony amon jest eluowany i utleniany do NO3− poprzez utlenianie nadsiarczanu. Po trzecie, NO3− jest przekształcany wN2Oza pomocą denitryfikatora z niedoboremN2O. Na koniec przekształcony N2O jest analizowany przy użyciu wcześniej opracowanego systemu kwadrupolowej chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Zastosowaliśmy tę metodę do solnych osadów bagiennych i obliczyliśmy ich potencjalne wskaźniki DNRA, wykazując, że proponowane procedury pozwalają na proste i szybsze określenie w porównaniu z poprzednio opisanymi metodami.

Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszej pracy uzyskano w eksperymentach z wykorzystaniem znacznika 15N w osadach solnisk. Próbkowane solnisko zostało utworzone po trzęsieniu ziemi w Wielkim Wschodnim Japonii w 2011 roku w obszarze Moune w mieście Kesen-numa w prefekturze Miyagi w Japonii. We wrześniu 2017 roku pobrano osady powierzchniowe (0–3 cm) z dwóch stanowisk w strefach subtidalnej i intertidalnej. Najpierw, bezpośrednio po pobraniu, osad przesiano przez sito o ...

Szczegółowo przedstawiono szereg metod do określania potencjalnego wskaźnika DNRA na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+. NH4+ jest przekształcany wN2Ow kilku etapach i analizowany za pomocą kwadrupolowej chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+ poprzez sekwencyjną konwersję doN2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Ekosystemy przybrzeżne i morskie są ważne jako rezerwuary do usuwania azotanów z ekosystemów lądowych. Azotany w środowisku wodnym mogą być zużywane przez kilka procesów jednocześnie. Takich jak denitryfikacja, anammox i DNRA.Podczas gdy poprzednie badania wykazały, że DNRA jest potencjalnie odpowiedzialna za denitryfikację, badania mierzące aktywność DNRA są nadal bardzo ograniczone w porównaniu z tymi, które mierzą denitryfikację. W naszym protokole udostępniamy szczegółową procedurę pomiaru potencjalnego wskaźnika DNRA w próbkach środowiskowych. Uważamy, że potencjalny wskaźnik DNRA można obliczyć na podstawie akumulacji amonu znakowanej N15 z dodatkiem azotanów znakowanym N15.Zaletą naszej metody w porównaniu z innymi metodami jest to, że amon jest ostatecznie przekształcany w podtlenek azotu, który ma niskie tło atmosferyczne. Nie jest również mądre, że zmierzyliśmy podtlenek azotu za pomocą kwadrupolowego spektrometru masowego chromatografii gazowej. Jest to mniej kosztowne i łatwiejsze w obsłudze niż spektrometr masowy ze stosunkiem izotopów.Najpierw umieść 60-milimetrowy kawałek taśmy PTFE na małym arkuszu folii aluminiowej. Popiel filtr z włókna szklanego w temperaturze 450 stopni Celsjusza przez cztery godziny w piecu muflowym. Następnie umieść filtr z włókna szklanego nieco powyżej środkowego punktu dłuższej osi taśmy.Następnie umieść 20 mikrolitrów 0,9 mola na litr kwasu siarkowego na środku filtra z włókna szklanego i natychmiast złóż taśmę PTFE za pomocą płaskiego stempla i pęsety z prostym końcem. Odwróć taśmę PTFE na filtr z włókna szklanego, a następnie uszczelnij obie strony taśmy PTFE, składając, a następnie mocno dociskając krawędź pęsetą. Za pomocą pęsety złóż otwarty koniec taśmy PTFE i dociśnij krawędź.Uszczelnij otwarty koniec taśmy PTFE, mocno dociskając krawędź pęsetą, uważając, aby nie naciskać filtra z włókna szklanego. Przenieść 30 miligramów sproszkowanego tlenku magnezu do szklanej fiolki o pojemności 20 mililitrów i umieścić w niej powłokę PTFE. Przenieść pięć mililitrów wcześniej przygotowanej próbki lub wzorca do fiolki zawierającej tlenek magnezu i kopertę z PTFE.I natychmiast zamknąć fiolkę szarym korkiem z gumy butylowej. Następnie należy zamknąć fiolkę aluminiowym kapslem. Potrząsać fiolkami z prędkością 150 obr./min przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.Następnie zdjąć aluminiowe kapsle i korek z gumy butylowej z każdej fiolki. Usunąć kopertę z PTFE z każdej fiolki za pomocą pęsety zakończonej punktowo i dokładnie wypłukać kopertę i pęsetę wodą jonowymienną. Następnie przetrzyj kopertę i pęsetę papierem do wycierania i umieść kopertę na świeżym papierze do wycierania.Otwórz kopertę z PTFE pęsetą z płaskim i spiczastym końcem w odwrotnej kolejności do etapów składania. Za pomocą pęsety z płaskim końcem przytrzymaj obrzeża filtra z włókna szklanego, w którym kwas siarkowy powinien być niewchłonięty. I przenieś go do probówki z 11-milimetrową nakrętką.Opłucz pęsetę wodą jonowymienną i przetrzyj je papierem do wycierania. Dodaj jeden mililitr wody jonowymiennej do każdej probówki. Zamknij probówki nakrętkami wyłożonymi PTFE i pozostaw je na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, aby całkowicie uniknąć kationu amonu z filtra z włókna szklanego.Następnie otwórz nakrętkę, dodaj dwa mililitry wcześniej przygotowanego odczynnika utleniającego roztwór utleniający nadsiarczan do probówki i szczelnie zamknij probówkę zakrętką, aby zapobiec stratom lub zanieczyszczeniu podczas kolejnych kroków. Postaw probówki na stojaku, zawiń je w dwuwarstwową folię aluminiową i sterylizuj w autoklawie w pozycji pionowej przez godzinę w temperaturze 121 stopni Celsjusza. Wymieszaj 100 mililitrów sterylnego buforu fosforanowego 40 milimoli na litr i 100 mililitrów sterylnego 30 milimoli na litr glukozy aseptycznie.Dodać glicerolowy zapas P.chlororaphis do 200 mililitrów roztworu glukozy buforowanego fosforanem, w 300-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. I oczyszczaj ultra czystym strumieniem helu przez godzinę. Następnie należy dozować dwa mililitry wcześniej przygotowanej zawiesiny denitryfikatora do pięciomililitrowych fiolek.Każdą fiolkę zakryć szarym korkiem z gumy butylowej i aluminiowym zamknięciem. Zastąp powietrze w przestrzeni nad głową ultra czystym helem, odkurzając przez trzy minuty i ładując hel przez jedną minutę. Ustaw nadciśnienie gazu w przestrzeni nad powierzchnią na 1.3 atmosfery, aby uniknąć niezamierzonego zanieczyszczenia powietrza.Wstrzyknąć jeden mililitr próbki lub wzorca przez korek z gumy butylowej za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Następnie inkubuj fiolki przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza, w ciemnych warunkach. Następnego dnia wstrzyknąć 0,3 mililitra po sześć moli na litr wodorotlenku sodu, aby zatrzymać denitryfikację i wchłonąć dwutlenek węgla Headspace, który w przeciwnym razie zakłóci analizę podtlenku azotu.Ponieważ dwutlenek węgla i podtlenek azotu mają tę samą masę cząsteczkową. Oznaczyć ilości podtlenku azotu o masie cząsteczkowej 44, 45 i 46 w gazie Headspace za pomocą kwadrupola GC/MS ze zmodyfikowanym portem wtryskowym. Reprezentatywne wyniki uzyskano na podstawie 15 eksperymentów azotowych w osadach słonych bagien powstałych w wyniku wielkiego trzęsienia ziemi we wschodniej Japonii w 2011 r. w rejonie księżyca w mieście Kesennuma i prefekturze Miyagi w Japonii.Wzrost znakowanego stężenia amonu w całym okresie inkubacji zaobserwowano dla wszystkich osadów zebranych w strefach podpływowych i międzypływowych. Wskaźniki DNRA mieściły się w przedziale od 24,8 do 177. I są porównywalne z wartościami podawanymi w poprzednich badaniach, ale wyższe niż wartości uzyskane z podobnych środowisk.Wysoki wskaźnik DNRA można wytłumaczyć tym, że słone bagna były wykorzystywane jako pole uprawne przed trzęsieniem ziemi. Zgodnie ze spekulacjami, wskaźnik DNRA w strefie pływów, która jest bogata i zawiera związki organiczne w porównaniu ze strefą podpływową, był wyższy. Nasz protokół ma szerokie zastosowanie do analizy szlaków metabolicznych, które obejmują tworzenie amonu i dodawanie śladowych ilości N15.

measurement-potential-rates-dissimilatory-nitrate-reduction-to

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Pokazujemy ekstrakcję amoniaku ze strumienia bogatego w amoniak za pomocą systemu elektrochemicznego i bioelektrochemicznego. Omówiono konfigurację reaktora, jego działanie i analizę danych.

Elektrochemicznie i bioelektrochemicznie indukowany odzysk amonu

Emisje amoniaku są głównym zagrożeniem dla środowiska poprzez eutrofizację, zakwaszenie gleby i tworzenie drobnych cząstek i pochodzą głównie ze źródeł rolniczych. Metoda ta umożliwia pomiary ubytków amoniaku w powtórzonych próbach polowych, umożliwiając analizę statystyczną emisji i zależności między rozwojem upraw a emisjami.

Skalibrowane próbkowanie pasywne - wielopowierzchniowe pomiary terenowe emisji NH3 z kombinacją dynamicznej metody rurkowej i próbników pasywnych

Tutaj prezentujemy małe inkubacje rdzenia do pomiaru wymiany gazu osad-woda i substancji rozpuszczonej. Umożliwią one wiarygodne pomiary wymiany osad-woda, które ocenią rolę osadów we wpływie na procesy biologiczne i biogeochemiczne w ekosystemach wodnych.

Bentosowa wymianaO2, N2 i rozpuszczonych składników odżywczych przy użyciu inkubacji z małym rdzeniem

Tlenek azotu (NO) jest ważną cząsteczką sygnałową w homeostazie naczyń krwionośnych. Produkcja in vivo NIE jest zbyt niska do bezpośredniego pomiaru. Chemiluminescencja dostarcza użytecznych informacji na temat cyklu NO poprzez pomiar jego prekursorów i produktów utleniania, azotynów i azotanów. Wyjaśniono oznaczanie azotynów / azotanów w tkankach i płynach ustrojowych.

Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Poprzednie prace sugerują, że skład izotopowy atmosferycznych tlenków azotu może rozróżniać wpływ różnych źródeł w środowisku. Przedstawiamy zautomatyzowaną, mobilną, opartą na terenie metodę zapewniającą wysoką skuteczność zbierania atmosferycznej analizy izotopowej NOx dla N w rozdzielczości godzinowej.

Zautomatyzowany, mobilny system zbierania o wysokiej rozdzielczości do analizy izotopowej azotu NOx

Amoniak może być syntetyzowany pod niskim ciśnieniem przy użyciu konwencjonalnego katalizatora i selektywnego absorbentu amoniaku.

Synteza amoniaku pod niskim ciśnieniem

α-hydroksylacja rakotwórczych nitrozoamin przez cytochrom P450s jest akceptowanym szlakiem metabolicznym, który wytwarza produkty pośrednie uszkadzające DNA, które powodują mutacje. Jednak nowe dane wskazują, że może dojść do dalszego utleniania do nitrozamidów. Opisujemy ogólną metodę wykrywania nitrozamidów wytwarzanych w wyniku katalizowanego in vitro metabolizmem nitrozoamin katalizowanym cytochromem P450.

Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Ta metoda szacuje tempo denitryfikacji osadów w rdzeniach osadów za pomocą techniki inhibicji acetylenu i pomiarów mikrosensorem nagromadzonegoN2O. W protokole opisano procedury pobierania rdzeni, kalibracji czujników, przeprowadzania inhibicji acetylenu, pomiaru akumulacjiN2Oi obliczania szybkości denitryfikacji.

Szacowanie szybkości denitryfikacji osadów za pomocą rdzeni i mikroczujnikówN2O

Projekt mikrodziałki do badań nad znacznikiem 15N jest opisany tak, aby pomieścić wiele wydarzeń związanych z pobieraniem próbek roślin i gleby w sezonie. Przedstawiono procedury pobierania i przetwarzania próbek gleby i roślin, w tym protokoły mielenia i ważenia, dla analizy 15N.

Projektowanie mikrowykresów oraz przygotowanie próbek roślin i gleby do analizy 15azotu

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Poznaj metodę pomiaru potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu w próbkach środowiskowych przy użyciu izotopów azotu-15 i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+ poprzez sekwencyjną konwersję doN2O (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie ¹⁴analiz NH₄⁺/¹⁵NH₄⁺ poprzez sekwencyjną konwersję do_N2O

Przeglądaj więcej filmów