Name: Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Naucz się izolować i oczyszczać perycyty serca myszy za pomocą perfuzji, trawienia kolagenazą i sortowania FACS. Ta metoda umożliwia badanie biologii perycytów i ich roli w homeostazie serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Amgen Flow Cytometry Core za pomoc w projektowaniu paneli fluoroforowych, rozwiązywaniu problemów i sortowaniu komórek.

Wszystkie zwierzęta były trzymane i wykorzystywane w obiekcie akredytowanym przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC), a wszystkie prace ze zwierzętami były prowadzone pod odpowiednim nadzorem weterynaryjnym i zgodnie z zatwierdzonym protokołem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) firmy Amgen Inc.
1. Przygotowanie narzędzi i pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Autoklaw chirurgiczne 9 cm nożyczki z cienką końcówką i 10 cm ząbkowane kleszcze kątowe.</li>
	<li>Dodaj 25 ml 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml 1% penicyliny streptomycyny (P/S) do 500 ml butelki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (CMF-DPBS) bez wapnia i magnezu. Umieść roztwór w łaźni lodowej, aby upewnić się, że w momencie użycia będzie zimny. Porcję 50 ml do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu izolacji serca. Dodać 250 jednostek/ml roztworu heparyny sodowej do 50 ml podwielokrotności. Będzie to określane jako heparynizowany CMF-DPBS.</li>
	<li>Dodaj 20% FBS (100 ml) i 1% P/S (5 ml) do 500 ml butelki zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy. Będzie to określane jako pożywka hodowlana bez enzymów. Podwielokrotność 20 ml DMEM + 20% FBS + 1% P/S i dodać 500 μg/ml kolagenazy B. Będzie to określane jako roztwór enzymu. Utrzymywać zarówno pożywkę hodowlaną bez enzymów, jak i roztwór enzymu w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub łaźni wodnej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierzęcia i pobranie tkanki serca
<ol>
	<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć myszowi 250 jednostek roztworu heparyny sodowej za pomocą strzykawki igłowej 31 G. Następnie odczekaj 10−15 minut, aż mysz pozostanie aktywna w swojej klatce domowej. 
	nuta: Reprezentatywne dane w tym badaniu uzyskano od 4-miesięcznego samca myszy C57BL/6. Jednak ten protokół może być używany na każdej myszy niezależnie od odmiany, wieku, płci, wagi itp.</li>
	<li>Znieczulij mysz 5% izofluranem. Sprawdź głębokość znieczulenia myszy za pomocą odruchu szczypania.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i przyklej taśmą jej przednie kończyny. Ostrożnie otwórz jamę klatki piersiowej i dokonaj kaniulacji aorty zstępującej za pomocą igły motylkowej 25 G.</li>
	<li>Zrób nacięcie w prawym przedsionku i wykonaj perfuzję serca za pomocą co najmniej 20 ml 250 jednostek/ml heparynizowanego CMF-DPBS w stężeniu 2 ml / min za pomocą pompy perystaltycznej o zmiennym przepływie. Kiedy PBS wychodzi z prawego przedsionka czysty, perfuzja jest zakończona.</li>
	<li>Wytnij serce w aorcie i umieść je w lodowatym CMF-DPBS.</li>
</ol>
3. Dysocjacja tkanki serca
<ol>
	<li>Przełóż serce na szalkę Petriego o wymiarach 15 cm x 15 cm. Pokrój serce na drobne kawałki (1 mm / sztukę) za pomocą nożyczek sprężynowych i cienkich kleszczyków z wystarczającą ilością roztworu enzymatycznego, aby pokryć kawałki (10-15 ml).</li>
	<li>Przenieść kawałki i roztwór do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, zamknąć folią parafinową z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min przez 75 minut.</li>
	<li>Po wytrawieniu kolagenazą roztworem enzymu, przelej płyn przez sitko o wielkości 100 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml, ale pozostaw tyle roztworu, aby upewnić się, że kawałki nie wyschną.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków punktowych wyjmij tkankę z rurki i umieść kilka kawałków na szkiełku mikroskopowym. Następnie zmiel tkankę między dwoma szkiełkami mikroskopowymi, aby rozbić tkankę. Przepłukać szkiełka pożywką hodowlaną bez enzymów do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Powtarzać krok 3.4, aż wszystkie fragmenty tkanki zostaną rozdzielone.</li>
	<li>Połącz roztwory z kroków 3.3−3.5 w jedną probówkę. Powstałą zawiesinę przecedzić przez sitko o pojemności 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 220 x g, 4 °C, przez 5 minut. Odessać poprzedni roztwór i delikatnie zawiesić osad komórkowy w świeżej, bezenzymatycznej pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Policz komórki i sprawdź żywotność za pomocą licznika komórek. Rozcieńczyć komórki do 1 x 106/ml zimnym buforem barwiącym FACS zawierającym 500 ml DPBS i 10−25 ml 2−5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Komórki są gotowe do barwienia i sortowania.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie perycytów z surowej mieszaniny komórek za pomocą FACS
<ol>
	<li>Przygotuj i oznacz probówki FACS o pojemności 5 ml dla wszystkich próbek kontrolnych i komórek. Podwielokrotnić komórki (1 ml komórek na probówkę) dla niebarwionej próbki, kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) i kontrole dopasowane izotypowo. Użyj pozostałych komórek do sortowania. Wszystkie kontrole i próbki mogą być przygotowywane i barwione w tym samym czasie. 
	nuta: Do reprezentatywnego sortowania z jednego serca użyto łącznie 13 ml przy 0,5 x 106 komórek/ml. Jednak objętość zależy od tego, ile komórek badacz uzyska z izolacji, ile serc użyje i jak dobrze trawiona jest tkanka serca; Wielkość każdego serca jest również zmienną, która może zmieniać głośność.
	<ol>
		<li>Użyj koralików kompensacyjnych (Tabela materiałów), aby zoptymalizować kontrolę kompensacji fluorescencji. Przygotować jedną kontrolę kompensacyjną dla każdego fluorochromu w eksperymencie w oznakowanej probówce FACS o pojemności 5 ml. Do tego eksperymentu przygotuj w sumie 9 kontroli kompensacyjnych - 2 rodzaje niebarwionych kulek oraz 7 różnych fluorochromów z panelu markerów, w tym NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 i żywotność komórek-APC-Cy7 (tabela materiałów).
		<ol>
			<li>Dodać jedną kroplę kulek kompensacyjnych (~ 50 μl) z fiolki do wyciskania do każdej probówki. Następnie dodaj 1 μl przeciwciała do kulek. Powtórz te czynności dla każdego przeciwciała z panelu markerów. Mieszaj energicznie przez pulsacyjne wirowanie. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, z wyjątkiem kulek żywotności komórek, które można pozostawić w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
			<li>Następnie dodać 3 ml buforu barwiącego FACS do każdej probówki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać roztwór i ponownie zawiesić każdą granulkę w 400 μl buforu barwiącego FACS. Elementy sterujące kompensacją są gotowe do użycia. Trzymaj na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj kontrolek FMO, aby zoptymalizować barwienie tła ze względu na nakładanie się widma.
		<ol>
			<li>Przygotować kontrole FMO, używając 1 ml komórek, które zostały podane zgodnie z sekcją 4.1 w probówce FACS o pojemności 5 ml i dodając wszystkie przeciwciała z panelu markerów opisanego w kroku 4.1.1 w rozcieńczeniu 1:100, ale z wyłączeniem jednego przeciwciała. Na przykład przygotuj FMO NG2-AF488, dodając przeciwciała dla CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, barwnika żywotności komórek, ale nie przeciwciała NG2-AF488. Delikatnie wymieszać przez pulsacyjne wirowanie. Powtórz dla każdego przeciwciała, co daje łącznie 7 kontroli. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
			<li>Następnie dodać 3 ml buforu barwiącego FACS do każdej probówki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać roztwór i ponownie zawiesić każdą komórkę w 400 μl buforu barwiącego FACS. Elementy sterujące FMO są gotowe do użycia. Trzymaj na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Stosować przeciwciała kontrolne dopasowane izotypowo (tabela materiałów) do barwienia nieswoistego.
		<ol>
			<li>Przygotować próby kontrolne izotypu, dodając przeciwciało kontrolne dopasowane do izotypu (tabela materiałów) do 1 ml próbki komórek przygotowanej z sekcji 4.1 w rozcieńczeniu 1:100 każda w probówce FACS o pojemności 5 ml. Delikatnie wymieszać przez pulsacyjne wirowanie. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
			<li>Następnie dodać 3 ml buforu barwiącego FACS do każdej probówki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać roztwór i ponownie zawiesić każdą komórkę w 400 μl buforu barwiącego FACS. Kontrolki izotypu są gotowe do użycia. Trzymaj na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj komórki do sortowania, dodając koktajl przeciwciał do świeżo wyizolowanych komórek.
		<ol>
			<li>Przygotować próbkę komórkową z sekcji 4.1, dodając koktajl przeciwciał zawierający anty-mysie NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 w rozcieńczeniu 1:100 każdy i barwnik żywotności komórek w rozcieńczeniu 1:1000. Delikatnie zmieszaj, aby wymieszać. Próbki inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, chroniąc je przed światłem.</li>
			<li>Po zabarwieniu przemyć komórki buforem barwiącym FACS przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 5 min 4 °C. Odessać roztwór i ponownie zawiesić osad komórek w buforze barwiącym FACS do 0,5 x 106 komórek/ml.</li>
			<li>Korzystając z nowych probówek FACS, które mają górną część filtra 35 μm, pipetuj barwione próbki komórek na pokrywkach i filtrat grawitacyjny, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek. Trzymaj na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj sortera komórek, aby oczyścić komórki.
	<ol>
		<li>Uruchom niezabarwione komórki w sortowniku komórek, aby ustawić napięcia i skorygować sygnał tła (na przykład ustaw napięcia dla rozproszenia do przodu na 490−560 i dla rozproszenia bocznego na 180−250).</li>
		<li>Uruchom każdą jednokolorową próbkę koralika kompensacyjnego pojedynczo, aby dostosować napięcia dla każdego kanału i dostosować bramki dla sygnału dodatniego. Zbieranie danych. Użyj oprogramowania do obliczenia nakładania się spektralnego, obliczając macierz kompensacji. Wszystkie napięcia są gotowe i ustawione.</li>
		<li>Uruchom każdą kontrolkę izotypu pojedynczo, a te dane mogą być użyte do dostosowania bramek dla niespecyficznych wiązań, jeśli takie istnieją.</li>
		<li>Uruchom każdą próbkę FMO pojedynczo i dostosuj napięcia dla każdego kanału, aby skorygować przenikanie widmowe dzięki wielokolorowemu panelowi.</li>
		<li>Uruchom wybarwione próbki komórek w sortowniku komórek i zbierz komórki w 10 ml bezenzymatycznych pożywkach hodowlanych (DMEM + 20% FBS + 1% P/S) w stożkowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml. Użyj następującej strategii bramkowania: bramka dla pojedynczych komórek, bramka dla żywych komórek, bramka dla komórek ujemnych CD45, bramka dla komórek ujemnych CD34 i CD31, bramka dla komórek dodatnich NG2 i wreszcie bramka dla komórek dodatnich CD146 i CD140b.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Hodowla perycytów
<ol>
	<li>Pokryj 24-dołkową płytkę 0,2% żelatyną przez 5 minut i odessaj roztwór żelatyny. Wysiew świeżo uzyskanych komórek z kroku 4.2.5 w DMEM + 20% FBS + 1% P/S do 2 x 104 komórek/cm2. Hodowla komórek w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 95 %O2</li>
	<li>Pasażowanie perycytów</li>
	<li>Gdy komórki zlewają się w 95%, umyj komórki ciepłym 1x DPBS i podnieś komórki 200 μl 0,1% trypsyny w każdym dołku w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w płytkę, aby poluzować komórki.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę 3,5 razy większą ilością pożywki hodowlanej (700 μL DMEM + 20% FBS + 1% P / S) i zasiej przejście dwóch (P2) komórek na niepowlekaną płytkę 6-dołkową w odległości do 2 x 104 komórek/cm2.</li>
	<li>Każda studzienka, po zlewaniu się, może być przeniesiona do pojedynczej kolby T-75 jako komórki P3, które następnie można podzielić w stosunku 1:6.</li>
</ol>
6. Charakterystyka perycytów
<ol>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Należy użyć tego samego protokołu barwienia FACS i strategii bramkowania, jak opisano wcześniej w sekcji 4.</li>
		<li>Uruchomić kontrole i barwione próbki na cytometrze przepływowym. Zbieraj dane i analizuj dane za pomocą oprogramowania analitycznego (Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać obrazy w jasnym polu, hoduj komórki w kolbie w inkubatorze komórkowym ustawionym na 37 °C, 5% CO2 i 95% O2 . Uchwyć obrazy pod mikroskopem po przyczepieniu się komórek do powierzchni.</li>
	<li>Immunocytochemia
	<ol>
		<li>Hoduj komórki na 96-dołkowej płytce, aż do 90% zlewania się. Umyj komórki ciepłym 1x DPBS i utrwal 4% paraformaldehydem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj komórki 3x 1x DPBS i przepuszczaj 0,1% detergentem przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować komórki z buforem blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu dodać przeciwciała pierwszorzędowe (jedno przeciwciało na basenik) rozcieńczone w stosunku 1:100 w buforze blokującym i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Przeciwciałami pierwszorzędowymi są: anty-NG2, anty-CD140b, anty-CD31, anty-wimentyna, anty-desmina i anty-alfa aktyna mięśni gładkich.</li>
		<li>Następnego dnia umyj komórki 3x buforem do przemywania (Tabela Materiałów). Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:1 000 w buforze blokującym i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Przeciwciało drugorzędowe to przeciwciało anty-królicze sprzężone z FITC.</li>
		<li>Przemyj komórki 3x buforem do mycia. Dodać 300 μM barwienia jądrowego rozcieńczonego w stosunku 1:1,000 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj ogniwa 3x za pomocą 1x DPBS i zamontuj za pomocą mediów montażowych.</li>
		<li>Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2Fpericyte+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Sengillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+mural+vascular+cells+coincides+with+blood-brain+barrier+disruption+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).</li>
<li>Avolio, E., Madeddu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cardiac+pericyte+biology%3A+From+physiopathological+mechanisms+to+potential+therapeutic+applications+in+ischemic+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease.</a> Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cerebral+microvascular+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).</li>
<li>Bryan, B. A., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+isolation+and+use+in+endothelial%2Fpericyte+coculture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models.</a> Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).</li>
<li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+outgrowth%2C+propagation+and+characterization+of+human+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li>
<li>Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perivascular cells for regenerative medicine.</a> Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+long-term+culture+of+multipotent+progenitor+cells+affiliated+with+the+walls+of+human+blood+vessels%3A+myoendothelial+cells+and+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes.</a> Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).</li>
<li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+bulk+cultivation%2C+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes%3A+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li>
<li>Avolio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+characterization+of+neonatal+cardiac+pericytes+provides+a+novel+cellular+option+for+tissue+engineering+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease.</a> Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043(2015).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myocardial+pericytes%3A+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li>
<li>Baily, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Perivascular+Multipotent+Precursor+Cell+Populations+from+Human+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54252(2016).</li>
<li>Murray, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+and+cardiac+muscle+pericytes%3A+Functions+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential.</a> Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ badania nad perycytami serca są stosunkowo nowe, rola perycytów w fizjologii i patofizjologii układu sercowo-naczyniowego nie została jeszcze zdefiniowana. W innych narządach wykazano, że odgrywają one kluczową rolę w homeostazie naczyń i perfuzji 1,2. W porównaniu z literaturą dotyczącą perycytów z innych narządów, takich jak mózg, jest znacznie mniej publikacji na temat perycytów serca. Izolacja perycytów serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich cech funkcjonalnych i mechanizmów sygnalizacji. W związku z tym protokół ten zapewni badaczom łatwiejszy sposób dostępu do perycytów serca z łatwiej dostępnego źródła tkankowego i będzie promować badania nad ich biologią. Pomoże odpowiedzieć na pytania o to, w jaki sposób perycyty serca przyczyniają się do homeostazy i patofizjologii serca, a także zbadać ich potencjał terapeutyczny.
Populacja perycytów wyizolowana z mysiego serca i charakteryzująca się CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ została wielokrotnie pasażowana (do P12 i nadal była silna), która nie zmniejsza żywotności i szybko się rozmnaża (ryc. uzupełniająca 2). Komórki zostały również zamrożone i odzyskane z co najmniej 95% żywotnością. Jednak do naszych eksperymentów wolimy używać komórek P7 lub młodszych. Porównując obrazy w jasnym polu naszych perycytów z perycytami ludzkiego mózgu, dwie linie komórkowe mają porównywalną morfologię komórek (ryc. 4A), a różnią się morfologią od komórek mięśni gładkich (ryc. 4A). Nasze komórki P7 charakteryzowały się immunocytochemią dla markerów perycytów, niektóre z naszego panelu FACS (NG2 i CD140b), a kilka nie w panelu (wimentyna, desmina, αSMA) i stwierdziliśmy, że komórki wyrażają markery perycytów jednorodnie (Figura 4B). Dodatkowo, nasze komórki P7 zostały ponownie przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej z tym samym panelem markerów, aby ocenić zmiany w ekspresji markera spowodowane pasażowaniem i stwierdziliśmy, że nie było żadnych zmian (Figura 4C). Dlatego, zarówno fenotypowo, jak i morfologicznie, nasze komórki są perycytami.
Badania Neesa i wsp.10, Avolio i wsp.11, Chen i wsp.12 oraz Baily i wsp.13 wykazały udane izolacje perycytów serca. Jednak użycie własnego, specjalnie zbudowanego sprzętu do odłączania perycytów od mikronaczyń przez Neesa i wsp.10 obejmowało dwie komory z pompami, które perfundowały roztwór proteazy tam iz powrotem przez stos siatki, co było trudne do odtworzenia, ponieważ nie dostarczały schematu i / lub obrazu aparatu i sposobu jego budowy. Chociaż Nees i wsp.10 z powodzeniem wyizolowali perycyty serca od wielu gatunków, nigdy nie byliśmy w stanie odtworzyć ich metody. Nasz etap odklejania perycytów w naszym protokole po prostu wykorzystuje wytrząsarkę orbitalną (do dysocjacji wszystkich komórek), która jest dostępna w większości, jeśli nie we wszystkich laboratoriach, z roztworem tkanki i enzymu w stożkowej probówce, po którym następuje etap dysocjacji mechanicznej. Nie jest wymagana żadna niestandardowa aparatura. Po drugie, pozostałe protokoły obejmują wykorzystanie tkanek ludzkich, a zatem pobieranie tkanek ludzkich jest ograniczone do badaczy. Nasz protokół jest modyfikacją i optymalizacją obecnych protokołów 9,12 przy użyciu modeli mysich (typ dziki, genetycznie zmodyfikowany, chory) i materiałów, które są łatwo dostępne dla wszystkich badaczy.
Ponieważ komórki okołonaczyniowe są na ogół wrażliwe, żywotność komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej wydajności. Podczas pobierania tkanki serca i barwienia komórek, tkanka/komórki muszą być utrzymywane w lodowatej temperaturze. Po drugie, trawienie enzymatyczne tkanki może wymagać indywidualnej optymalizacji. W zależności od jednostek aktywności na fiolkach z enzymami, może być konieczna optymalizacja koncentracji i czasu trawienia. Upewnij się, że roztwór enzymatyczny jest za każdym razem przygotowywany na świeżo, w przeciwnym razie wydajność spadnie. Po trzecie, surowa mieszanina zawiera dużo komórek, niektóre martwe i/lub umierające, najlepiej jest obniżyć stężenie FBS w buforze barwiącym z 5% do 2%. Jeśli masz problemy z zatykaniem dyszy przez komórki podczas sortowania, najpierw wzbogać komórki za pomocą zestawu do usuwania martwych komórek. Możesz również dodać bufor EDTA/HEPES lub leczenie DNazą do wstępnego sortowania komórek, aby zapobiec zbrylaniu się komórek. Wreszcie, ponieważ nasz panel przeciwciał jest dość duży i wykorzystuje wiele fluoroforów, upewnij się, że kontrole FMO i kontrole kompensacyjne są wykonane prawidłowo.
Jednym z ograniczeń tej metody jest ilość perycytów serca, które można uzyskać na serce. W naszym przypadku tylko 1,1% naszej surowej mieszanki z jednego serca myszy stanowiły perycyty, co jest porównywalne z procentem w izolacjach ludzkiego serca, ale liczba komórek jest znacznie mniejsza ze względu na ilość tkanki serca dostarczanej przez mysz. Ponieważ początkowa liczba komórek jest tak niska po FACS, lepiej byłoby wyizolować z wielu serc jednocześnie. Jednak problem polega na samej liczbie komórek, które trzeba posortować w ciągu jednego dnia. Jeśli masz więcej niż 30 milionów komórek, trudno będzie przejść przez sortowanie bez wpływu na żywotność komórek. Gdyby badacz miał wiele sortowników komórek, izolacja z wielu serc w ciągu jednego dnia byłaby wykonalna. Innym ograniczeniem jest to, że ponieważ nie wiemy, czy w sercu istnieją subpopulacje perycytów, tak jak w przypadku mięśni szkieletowych15,16, nie wiemy, czy eliminujemy podtyp w naszej strategii bramkowania. Jesteśmy w trakcie charakteryzowania naszych perycytów serca i jak dotąd w naszych niepublikowanych danych są one funkcjonalnie podobne do innych perycytów w literaturze.
Nasz protokół umożliwi badaczom udzielenie odpowiedzi na pytania dotyczące właściwości, charakterystyki, funkcjonalności i innych aspektów perycytów serca, które pomogą określić ich wkład w homeostazę serca i hemodynamikę. Komórki te mogą mieć potencjał terapeutyczny w chorobach sercowo-naczyniowych, gdy ich biologia zostanie lepiej poznana.

Komórki okołonaczyniowe, znane jako perycyty, otaczają mikronaczynia i naczynia włosowate drzewa naczyniowego1,2. Fizjologicznie wiadomo, że promują i odgrywają rolę w angiogenezie, zwiększają integralność bariery ze względu na ich bliski związek z komórkami śródbłonka, a także stabilizują i dojrzewają naczynia1,2. Co więcej, dysfunkcja i/lub utrata tych komórek są związane z chorobami takimi jak choroba Alzheimera2,3 i różne choroby sercowo-naczyniowe4. Komórki te znajdują się w całym ciele, ale liczba komórek jest zależna od tkanki. Perycyty były badane przede wszystkim w mózgu ze względu na wysokie unaczynienie bariery krew-mózg1,2. Jednak w sercu biologia perycytów jest niedostatecznie zbadana.
Ostatnio wzrosło zainteresowanie perycytami sercowymi, ale obecnie nie ma dostępnego uproszczonego protokołu ich izolacji od jednego z najczęściej używanych narzędzi w biologii - myszy. W literaturze istnieją protokoły dotyczące izolowania perycytów od mózgu5, retina6, placenta7, and skeletal muscle8,9; Jednak niewiele protokołów dotyczy izolowania perycytów od serca. Istnieje kilka grup, które mają izolowane perycyty serca. Nees i in. byli w stanie wyizolować dużą ilość perycytów serca od wielu gatunków, w tym myszy; Jednak ich metody wykorzystywały specyficzny sprzęt zbudowany przez nas, co zmniejsza odtwarzalność10. Avolio et al.11, Chen et al.12, oraz Baily et al.13 również z powodzeniem wyizolowali perycyty serca z ludzkiej tkanki serca, ale ludzkie tkanki nie zawsze są dostępne i trudne do uzyskania dla niektórych badaczy. W tym przypadku opracowaliśmy metodę izolacji w celu uzyskania perycytów serca z modeli mysich, aby badacze mogli dalej badać ich biologię za pomocą łatwo dostępnych materiałów.
Korzystając z trawienia enzymatycznego i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) ze znanymi kluczowymi markerami perycytów14, nasz protokół pozwala nam wyizolować i oczyścić populację perycytów, które charakteryzują się CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Nasz panel markerów zawiera zarówno znaczniki włączenia, jak i wykluczenia. CD45 jest używany jako marker do wykluczenia komórek krwiotwórczych. CD31 jest używany jako marker do wykluczenia komórek śródbłonka. CD34 jest używany jako marker do wykluczania zarówno hematopoetycznych, jak i śródbłonkowych komórek progenitorowych. CD146 jest markerem komórek okołonaczyniowych. Wreszcie, NG2 i CD140b (znane również jako receptor beta czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego - PDGFRβ) są akceptowanymi markerami dla perycytów14. Uzyskana kultura pierwotna może być hodowana i pasażowana wiele razy bez zmian w morfologii lub ekspresji markera. Co więcej, komórki te mogą być hodowane wspólnie z komórkami śródbłonka w celu badania ich interakcji i wzajemnych przesłuchów. Ta metoda izolacji komórek pozwoli badaczom badać biologię i patofizjologię perycytów serca z modeli myszy typu dzikiego, choroby i wariantów genetycznych.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td>rozcieńczyć 1x DPBS, aby uzyskać 0,1%</td></tr><tr><td>100 &mu; M Sitko do komórek</td><td>FisherSci</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe Falcon</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Igła motylkowa 25 G</td><td>FisherSci</td><td>22-253-146</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka igłowa 31 G</td><td>FisherSci</td><td>B328446</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon rurki stożkowe</td><td>BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>anty-alfa aktyna mięśni gładkich królik mAb</td><td>abcam</td><td>ab32575</td><td>Przeciwciało stosowane w ICC 1:100 rozcieńczeniu</td></tr><tr><td>anty-CD140b mAb królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>28E1</td><td>Przeciwciało stosowane w ICC 1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>anty-CD31 królicze pAb</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>Przeciwciało stosowane w ICC 1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>anty-desmina królika pAb</td><td>abcam</td><td>ab8592</td><td>Przeciwciało stosowane w ICC 1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>anty-NG2 sprzężone z AF488</td><td>Millipore</td><td>MAB5384A4</td><td>Przeciwciało stosowane w ICC 1:100 rozcieńczeniu</td></tr><tr><td>anty-wimentyny królika mAb</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>Przeciwciało stosowane w rozcieńczeniu ICC 1:100</td></tr><tr><td>ArC Zestaw kulek kompensacyjnych reaktywnych</td> aminy <td>Invitrogen</td><td>A10346</td><td>koraliki kompensacyjne do żywego/martwego barwnika w bliskiej odległości Brightfield</td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Dołączona kamera</td>mikroskopowa</tr><tr><td>CD140b-PE (klon APB5)</td> <td>eBioscience</td><td>12-1402-81</td><td>Przeciwciało stosowane w rozcieńczeniu FACS 1:100</td></tr><tr><td>CD146-BV605 (klon ME-9F1)</td> <td>740434 BD</td><td></td><td>Przeciwciało stosowane w rozcieńczeniu FACS 1:100</td></tr><tr><td>CD31-APC (klon MEC 13.3)</td> <td>551262 BD</td><td></td><td>Przeciwciało stosowane w rozcieńczeniu FACS 1:100</td></tr><tr><td>CD34-BV421 (klon RAM 34)</td> <td>BD</td><td>56268</td><td>Przeciwciało stosowane w rozcieńczeniu FACS 1:100</td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7 (klon 30-F11)</td><td>BD</td><td>552848</td><td>Przeciwciało stosowane w rozcieńczeniu FACS 1:100</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td>0,226 U/mg lyo.</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td><td>konfokalny</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>DMEM z 4,5 g/l glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Nożyczki do kołków</td><td>FST</td><td>15040-11</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco bez Ca i Mg (CMF-DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze drobnoziarniste</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik komórek FACSAria</td><td>Lasery BD</td><td></td><td>: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FACSAria</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon probówka okrągłodenna polipropylenowa, 5 ml</td><td>BD</td><td>38057</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Falcon z nasadką sitka komórkowego, 5 ml</td><td>BD</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Corning</td><td>35-015-CV</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>FlowJo FlowJo LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Fortessa LSR</td><td>Lasery BD</td><td></td><td>: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW</td></tr><tr><td>Powłoka na bazie żelatyny</td><td>Cell Biologics</td><td>6950</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł anty-króliczy IgG (H + L) Przeciwciało wtórne wchłonięte krzyżowo, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>Przeciwciało stosowane w ICC 1:1000 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze</td><td>FST</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna roztwór sodu</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2720-02</td><td>10 000 jednostek USP/10 ml; z jelit świń</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td>ustawiony na 37 & deg; C, 5% CO2, 95% O2&nbsp;</td></tr><tr><td>Żywe/bliskie podczerwieni</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>FisherSci</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>NG2-FITC</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>AB5320A4</td><td>stosowane w rozcieńczeniu FACS 1:100</td></tr><tr><td>Wytrząsarka oryginalna</td><td>VWR</td><td></td><td>Inside 37 &deg; C inkubator lub pomieszczenie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>FisherSci</td><td>50-980-487</td><td>rozcieńczyć 1x DPBS, aby uzyskać 4%</td></tr> <tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002-CI&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; Szalka Petriego</td><td>FisherSci</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta i końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond</td><td>ThermoFisher</td><td>P36965</td><td>media montażowe</td></tr><tr><td>Jodek propidu</td> Barwnik żywotności komórek <td>ThermoFisher</td><td></td><td>dla rysunku uzupełniającego 2</td></tr><tr><td>IgG królika FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-4614-80</td><td>Przeciwciało kontrolujące izotyp - FITC</td></tr><tr><td>IgG2a APC</td><td>Przeciwciało kontrolne Biolegend</td><td>400512</td><td>Isotype - APC</td></tr><tr><td>Rat IgG2a BV421</td><td>Biolegend</td><td>400536</td><td>Przeciwciało kontrolne izotypu - BV421</td></tr><tr><td>Rat IgG2a BV605</td><td>BD</td><td>563144</td><td>Przeciwciało kontrolne izotypu - BV605</td></tr><tr><td>Rat IgG2a PE</td><td>Biolegend</td><td>400308</td><td>Przeciwciało kontrolne izotypu - PE</td></tr><tr><td>Rat IgG2b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>400617</td><td>Kontrola izotypu przeciwciało - PE-Cy7</td></tr><tr><td>SuperBlock Bufor blokujący</td><td></td><td>ThermoFisher</td><td>37515</td></tr><tr><td>T75</td><td>Detergent ThermoFisher</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>, rozcieńczyć x DPBS, aby uzyskać 0,1%</td></tr> <tr><td>kulek UltraComp Koraliki</td><td>kompensacyjne</td><td>Invitrogen</td><td>01-2222-42</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie</td><td>FisherSci</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>ViCell Licznik komórek</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>płuczący 1:10 rozcieńczenie Superbloku w 1x DPBS</td></tr></tbody></table>

izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Perycyty, komórki okołonaczyniowe mikronaczyń i naczyń włosowatych, odgrywają rolę w angiogenezie, stabilizacji naczyń i integralności bariery śródbłonkowej. Jednak ich specyficzne tkankowo funkcje w sercu nie są dobrze poznane. Co więcej, obecnie nie ma protokołu wykorzystującego łatwo dostępne materiały do izolacji i oczyszczania perycytów pochodzenia sercowego. Nasz protokół skupia się na wykorzystaniu szeroko stosowanego modelu ssaków, myszy, jako naszego źródła komórek. Korzystając z trawienia enzymatycznego i mechanicznej dysocjacji tkanki serca, otrzymaliśmy surową mieszaninę komórek, która została następnie oczyszczona przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) za pomocą wielu markerów. Ponieważ nie ma jednego jednoznacznego markera dla perycytów, przeprowadziliśmy bramkowanie dla komórek, które były CD31-CD34-CD45-CD140b + NG2 + CD146 +. Po oczyszczeniu te pierwotne komórki były hodowane i pasażowane wiele razy bez żadnych zmian w morfologii i ekspresji markerów. Dzięki możliwości regularnego pozyskiwania pierwotnych mysich perycytów serca przy użyciu naszego protokołu, mamy nadzieję lepiej zrozumieć rolę perycytów w fizjologii układu krążenia i ich potencjał terapeutyczny.

Po trawieniu enzymatycznym i dysocjacji całego serca, a przed oczyszczaniem komórek metodą FACS, komórki stanowią surową mieszaninę zawierającą wiele różnych typów komórek serca (Ryc. 1A). Po oczyszczeniu metodą FACS i hodowli komórki są homogenne. Są one jednojądrowe, dość płaskie i wykazują typową dla perycytów morfologię romboidalną (Ryc. 1B).
Z wykorzystaniem FACS komórki są oczyszczane do postaci homogennej. Nabarwiona próbka kontrolna komórek służy do zaprezentowania strategii bramkowania (Rycina 2). W pierwszej kolejności, na podstawie rozkładów rozpraszania przedniego i bocznego, odrzucono debris oraz dublety. Następnie wykluczono martwe komórki ze względu na ich reakcję aminową z barwnikiem, która generuje sygnał silniejszy i bardziej intensywny niż w przypadku komórek żywych. Z puli żywych komórek odseparowano komórki hematopoetyczne, identyfikując je jako CD45+. Aby całkowicie usunąć komórki hematopoetyczne i endotelialne, odrzucono komórki CD34+ oraz CD31+. Na koniec wyselekcjonowano komórki NG2+  i CD140b+/CD146+ jako komórki okołonaczyniowe wykazujące ekspresję typowych markerów perycytów (Rycina 3). Panel markerów przetestowano również na komórkach endotelialnych naczyń wieńcowych myszy w ramach kontroli (Rycina uzupełniająca 1). Po sortowaniu okazało się, że perycyty stanowiły jedynie około 1% surowej mieszaniny komórek.
Aby potwierdzić, że komórki rzeczywiście były perycytami, przeprowadzono ich pasażowanie w celu dalszej charakterystyki. Komórki rosły szybko po osiągnięciu P3 w kolbach T-75, bez zmian w żywotności wraz z upływem czasu (Rycina uzupełniająca 2). W porównaniu z ludzkimi perycytami mózgowymi, komórki wykazywały podobną morfologię (Rycina 4A). W porównaniu z komórkami mięśni gładkich myszy i człowieka, komórki te miały inną morfologię (Rycina 4A). Po pasażowaniu nie zaobserwowano również zmian w morfologii ani w ekspresji markerów w P7 podczas barwienia immunocytochemicznego lub analizy cytometrycznej (Rycina 4B,C).
<img alt="Obraz mikroskopowy porównujący nieoczyszczone i oczyszczone komórki, podkreślający wyniki procesu oczyszczania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Komórki nieoczyszczone w porównaniu z komórkami oczyszczonymi. (A) Obraz w jasnym polu mieszaniny nieoczyszczonych komórek po enzymatycznym trawieniu i dysocjacji całego serca, hodowanej w kolbie T25 przez 14 dni. (B) Obraz w jasnym polu jednorodnej populacji perycytów serca po sortowaniu i 14-dniowej hodowli. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej ilustrujące sortowanie komórek; SSC vs FSC; markery fluorescencyjne CD45, CD31, CD146." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy analizy FACS niebarwionych komórek. Schematyczna prezentacja strategii bramkowania zastosowanej do oczyszczania surowej mieszaniny komórek. Bramka dla komórek pojedynczych, żywych, CD45-, CD31-, CD34-, NG2+, CD146+ oraz CD140b+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig2v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej; schematy sortowania komórek z markerami CD45, CD34, CD31; wykresy FSC, SSC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy analizy FACS surowych komórek. Schematyczne przedstawienie sortowania użytego do uzyskania homogennej populacji perycytów sercowych. Około 1% surowych komórek to CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy eksperymentów z hodowli komórkowych i immunobarwienia wraz z panelami analizy danych z cytometrii przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Charakterystyka pierwotnie izolowanych pericytów serca (A) Obrazy w świetle przechodzącym hodowanych komórek z ludzkiego mózgu (hPC) i serc mysich (mPC) wykazują podobną morfologię pericytów, lecz odmienną od morfologii ludzkich komórek mięśni gładkich (hSMC) i mysich komórek mięśni gładkich (mSMC). Pasek skali = 100 µm. (B) Charakterystyka fenotypowa komórek w pasażu P7 za pomocą immunocytochemii na markery pericytów. Pasek skali = 100 µm. (C) Analiza pericytów w pasażu P7 metodą cytometrii przepływowej, gdzie zastosowano bramkowanie dla markerów negatywnych CD31, CD34, CD45 oraz markerów pozytywnych NG2, CD140b i CD146. Populacja pozostaje homogenna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina dodatkowa 1: Reprezentatywne obrazy analizy cytometrii przepływowej komórek śródbłonka z wykorzystaniem panelu markerów. Jako kontrolę specyficzności wiązania markerów wykorzystano linię komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy. Stosując tę samą strategię bramkowania, która została użyta podczas sortowania, z wyjątkiem zastosowania bramy pozytywnej dla CD31 zamiast bramy negatywnej, wykazano, że komórki śródbłonka były negatywne dla CD45, CD34, NG2, CD140b i CD146, lecz zgodnie z oczekiwaniami pozytywne dla CD31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/JOVE_Suppl_Figure_1.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>
Rysunek dodatkowy 2: Reprezentatywne obrazy analizy cytometrii przepływowej różnych pasażów mPC. Pierwotne izolowane perycyty serca były hodowane i pasażowane do pasażu 12. Komórki barwiono jodkiem propidyny i analizowano za pomocą cytometru przepływowego. Populacją kontrolną była mieszanina komórek martwych i żywych. Nie stwierdzono istotnych różnic w liczbie żywych komórek między pasażami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/JOVE_Suppl_Figure_2.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem modelu mysiego i wykorzystuje materiały, które są łatwo dostępne dla wszystkich badaczy. Technikę tę można zastosować do zdrowych, chorych lub genetycznie zmienionych modeli myszy. Nasz protokół umożliwi badaczom udzielenie odpowiedzi na wszelkie pytania dotyczące biologii perycytów serca na podstawie dowolnego mysiego modelu choroby lub zmienności genetycznej.Ta procedura zapewni wgląd w biologię perycytów serca i pomoże nam zrozumieć ich wkład w homeostazę serca i hemodynamikę zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i przyklej taśmą jej przednie kończyny. Ostrożnie otwórz jamę klatki piersiowej i znówuj zstępującą aortę za pomocą igły motylkowej o rozmiarze 25.Zrób nacięcie w prawym atrium. Następnie przeprowadź perfuzję serca za pomocą co najmniej 20 mililitrów heparynizowanej, wolnej od wapnia i magnezu soli fizjologicznej Dulbecco w postaci heparyny fosforanowej o pojemności 250 jednostek na mililitr na mililitr na minutę w ilości dwóch mililitrów na minutę za pomocą pompy perystaltycznej o zmiennym przepływie. Perfuzja jest zakończona, gdy czysty PBS wychodzi z prawego przedsionka.Wytnij serce w aorcie i umieść je w lodowatym DPBS bez wapnia i magnezu. Następnie przenieś serce na szalkę Petriego o wymiarach 15 na 15 centymetrów. Pokrój serce na drobne kawałki za pomocą nożyczek sprężynowych i drobno zakończonych kleszczyków z wystarczającą ilością roztworu enzymatycznego, aby pokryć kawałki.Teraz przenieś kawałki i roztwór do 50-mililitrowej stożkowej rurki i zamknij folią parafinową z tworzywa sztucznego. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min przez 75 minut. Po wytrawieniu kolagenazy roztworem enzymu, przelej płyn przez sitko do komórek o średnicy 100 mikronów do nowej 50-mililitrowej probówki, pozostawiając wystarczającą ilość roztworu, aby kawałki nie wyschły.Za pomocą cienkich kleszczyków wyjmij tkankę z rurki i umieść kilka kawałków na szkiełku mikroskopowym. Następnie zmiel tkankę między dwoma szkiełkami mikroskopowymi, aby rozbić tkankę. Przepłukać szkiełka pożywką hodowlaną bez enzymów do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Powtarzaj ten krok, aż wszystkie kawałki tkanki zostaną zdysocjowane. Połącz odcedzony roztwór i zmieloną tkankę w jedną probówkę. Przecedź powstałą zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikronów do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Odwirować próbkę w temperaturze 220 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odessać poprzedni roztwór i delikatnie zawiesić osad komórkowy w zimnym buforze barwiącym FACS zawierającym DPBS i albuminę surowicy bydlęcej. Policz komórki i sprawdź żywotność za pomocą licznika komórek.Rozcieńczyć komórki do miliona komórek na mililitr zimnym buforem barwiącym FACS zawierającym DPBS i albuminę surowicy bydlęcej. Komórki są teraz gotowe do barwienia i sortowania. Przygotuj i oznacz pięciomililitrowe probówki FACS dla wszystkich próbek kontrolnych i komórek.Podamknij jeden mililitr komórek na probówkę dla niebarwionej próbki, fluorescencja minus jedna kontrola i kontrole dopasowane izotypowo. Użyj pozostałych komórek do sortowania. Wszystkie kontrole i próbki mogą być przygotowywane i barwione w tym samym czasie.Przygotuj również i oznacz pięciomililitrowe probówki FACS dla łącznie dziewięciu kontroli kompensacyjnych, dwóch rodzajów niebarwionych koralików oraz siedmiu różnych fluorochromów z panelu markerów. Aby zoptymalizować kontrolę kompensacji fluorescencji, dodaj jedną kroplę kulek kompensacyjnych z fiolki do wyciskania do każdej probówki. Następnie dodaj jeden mikrolitr przeciwciała do kulek.Powtórz te czynności dla każdego przeciwciała z panelu markerów. Użyj kontrolek FMO, aby zoptymalizować barwienie tła ze względu na nakładanie się widma. Do komórek w probówkach kontrolnych FMO dodać wszystkie przeciwciała z panelu markerów w rozcieńczeniu 1 do 100, ale wykluczyć jedno przeciwciało.Powtórz te czynności dla każdego przeciwciała, co daje w sumie siedem prób kontrolnych. Do barwienia nieswoistego należy stosować przeciwciała kontrolne dopasowane izotypowo. Do komórek w dopasowanych izotypowo znakowanych probówkach dodać przeciwciało kontrolne dopasowane izotypem w rozcieńczeniu 1 do 100.Następnie przygotuj komórki do sortowania. Do świeżo wyizolowanych komórek dodać koktajl przeciwciał w rozcieńczeniu jeden do 100. Dodaj również barwnik żywotności komórek w rozcieńczeniu jeden do 1 000.Energicznie wymieszaj elementy sterujące kompensacją za pomocą wirowania impulsowego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronić przed światłem, z wyjątkiem kulek żywotności komórek, które można pozostawić w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Delikatnie wymieszaj kontrolki FMO, kontrole dopasowane do izotypu i komórki, które mają być sortowane przez wirowanie impulsowe.Inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronić przed światłem. Dodaj trzy mililitry buforu barwiącego FACS do każdej kontroli kompensacji, kontroli FMO i kontroli izotypu. Odwirować probówki o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać roztwór i ponownie zawiesić każdą osadkę w 400 mikrolitrach buforu barwiącego FACS. Elementy sterujące kompensacją, kontrole FMO i kontrole izotypu są teraz gotowe do użycia. Po barwieniu przemyć komórki buforem barwiącym FACS przez odwirowanie w ilości 300 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać roztwór i ponownie zawiesić osad komórek w buforze barwiącym FACS do 0,5 miliona komórek na mililitr. Używając nowych probówek FACS, które mają 35-mikronowe pokrywki filtracyjne, odpipetuj wybarwione próbki komórek na pokrywki i filtrat grawitacyjny, aby uzyskać zawiesiny jednokomórkowe. Trzymaj na lodzie.Użyj sortera komórek, aby oczyścić komórki. Uruchom niezabarwione komórki w sortowniku komórek, aby ustawić napięcia i skorygować sygnał tła. Uruchom każdą jednokolorową próbkę koralika kompensacyjnego pojedynczo, aby dostosować napięcia dla każdego kanału i dostosować bramki dla sygnału dodatniego.Zbierz dane. Użyj oprogramowania do obliczenia nakładania się spektralnego, obliczając macierz kompensacji. Wszystkie napięcia są gotowe i ustawione.Uruchamiaj każdą kontrolkę izotypu pojedynczo. Dane te mogą być używane do dostosowywania bramek dla niespecyficznych powiązań, jeśli takie istnieją. Uruchom każdą próbkę FMO pojedynczo.Dostosuj napięcia dla każdego kanału, aby skorygować przenikanie widmowe spowodowane wielokolorowym panelem. Uruchom poplamione próbki komórek w sortowniku komórek. Zbierz komórki w 10-mililitrowej pożywce hodowlanej bez enzymów w 15-mililitrowej stożkowej probówce zbiorczej.Użyj następującej strategii bramkowania. Po pierwsze, bramka dla pojedynczych komórek. Następnie bramka dla żywych komórek.Następnie bramka dla komórek CD45-ujemnych. Bramka dla komórek CD34 i CD31-ujemnych. Następnie bramka dla komórek NG2-dodatnich.I wreszcie bramka dla komórek CD146 i CD140b-dodatnich. Aby wyhodować perycyty, należy wysiać świeżo uzyskane komórki w pożywce hodowlanej bez enzymów na powlekanej 24-dołkowej płytce. Hoduj komórki w inkubatorze komórkowym ustawionym na 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu.Po trawieniu enzymatycznym i dysocjacji całego serca, a przed oczyszczeniem komórek przez FACS, komórki są surową mieszaniną, która zawiera wiele różnych typów komórek z serca. Po oczyszczeniu i hodowli FACS komórki są jednorodne. Są jednojądrzaste, dość płaskie i mają typową romboidalną morfologię okołocytów.Za pomocą FACS komórki są oczyszczane do jednorodności. Po pierwsze, szczątki i dublety zostały wybramowane na podstawie rozkładu rozproszenia do przodu i na boki. Następnie martwe komórki zostały bramkowane w wyniku ich reakcji aminowej z barwnikiem, który wytwarza sygnał większy i intensywniejszy niż żywe komórki.Spośród żywych komórek, komórki krwiotwórcze były bramkowane przez to, że były CD45-dodatnie. Aby dalej usunąć komórki krwiotwórcze i śródbłonka, komórki CD34-dodatnie i CD31-dodatnie zostały bramkowane. Wreszcie, komórki NG2-dodatnie i CD140b/CD146-dodatnie zostały wybrane jako komórki okołonaczyniowe z ekspresją typowych markerów perycytów.W porównaniu z perycytami ludzkiego mózgu, komórki miały podobną morfologię. W porównaniu z mysimi i ludzkimi komórkami mięśni gładkich, komórki miały inną morfologię Charakterystyka fenotypowa komórek w siódmym pasażu za pomocą immunocytochemii markerów perycytów nie wykazała zaobserwowanych zmian w morfologii ani ekspresji markerów. Podobnie, analiza za pomocą cytometrii przepływowej perycytów w okresie siódmym potwierdziła, że populacja pozostała jednorodna.Żywotność komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrego plonu. Utrzymuj tkankę w niskiej temperaturze podczas pobierania i utrzymuj komórki w niskiej temperaturze podczas barwienia komórek. Upewnij się również, że roztwór enzymatyczny jest za każdym razem przygotowywany na świeżo.Aby zapewnić izolację właściwych komórek po hodowli, należy je scharakteryzować za pomocą cytometrii przepływowej i barwienia immunofluorescencyjnego. Komórki te mogą być wykorzystywane w eksperymentach kokultury z komórkami śródbłonka do badań barier funkcjonalnych, a także do testów w celu zbadania ich biologicznych i fizjologicznych funkcji i cech. Perycyty serca odgrywają fundamentalną rolę w integralności i stabilności naczyń krwionośnych, a ich dysfunkcja ma wpływ na globalną czynność serca.Dzięki naszej technice naukowcy mogą badać potencjał terapeutyczny perycytów serca.

isolation-and-purification-of-murine-cardiac-pericytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania perycytów mózgowych od mózgu myszy. Wyizolowane komórki są hodowane w pożywkach specyficznych dla perycytów w celu promowania proliferacji perycytów.

Izolowanie i hodowla perycytów mózgowych myszy

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Ta praca opisuje protokół oparty na FACS, który pozwala na łatwą i jednoczesną izolację perycytów typu I i II od mięśni szkieletowych.

Izolacja perycytów typu I i typu II z mięśni szkieletowych myszy

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.

Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Naucz się izolować i oczyszczać perycyty serca myszy za pomocą perfuzji, trawienia kolagenazą i sortowania FACS. Ta metoda umożliwia badanie biologii perycytów i ich roli w homeostazie serca.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Przeglądaj więcej filmów