Name: Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Poznaj izolację i charakterystykę ludzkich komórek progenitorowych mięśni z biopsji tkanki mięśniowej. Ta metoda umożliwia badanie proliferacji, różnicowania i regeneracji mięśni szkieletowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Cornell University, Biotechnology Resource Center Imaging Facility za pomoc w sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją. Dziękujemy również Molly Gheller za pomoc w rekrutacji uczestników oraz Erice Bender za przeprowadzenie biopsji mięśni szkieletowych. Na koniec dziękujemy uczestnikom za poświęcony czas i udział w badaniu. Praca ta była wspierana przez National Institute on Aging of the National Institutes of Health w ramach Award Number R01AG058630 (dla B.D.C. i A.E.T.), przez Glenn Foundation for Medical Research i American Federation for Aging Research Grant dla młodszych wykładowców (dla B.D.C.) oraz przez President's Council for Cornell Women (dla A.E.T.).

<ol><li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li>
<li>D'Souza, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+satellite+cell+number+and+function+in+humans+and+mice+with+type+1+diabetes+is+the+result+of+altered+notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling.</a> Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).</li>
<li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+derived+from+Obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+Myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657(2012).</li>
<li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+capacity+of+human+muscle+progenitor+cells+differs+by+age%2C+sex%2C+and+metabolic+fuel+preference%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).</li>
<li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+and+in+vivo+self-renewal+of+human+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li>
<li>Alexander, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD82+Is+a+Marker+for+Prospective+Isolation+of+Human+Muscle+Satellite+Cells+and+Is+Linked+to+Muscular+Dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).</li>
<li>Thalacker-Mercer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+reveals+differential+transcript+profiles+associated+with+resistance+training-induced+human+skeletal+muscle+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy.</a> Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).</li>
<li>Garcia, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Yield+Purification%2C+Preservation%2C+and+Serial+Transplantation+of+Human+Satellite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).</li>
<li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+thawing+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).</li>
<li>Bareja, A., Billin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+therapy+-+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Satellite cell therapy - from mice to men.</a> Skeletal Muscle. 3 (1), 2(2013).</li>
<li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Satellite+Cell+Transplantation+and+Regeneration+from+Diverse+Skeletal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwotne hMPC są ważnym modelem badawczym wykorzystywanym do zrozumienia biologii mięśni szkieletowych i procesu regeneracji. Dodatkowo, hMPC mają potencjał do wykorzystania w terapii. Istnieją jednak uznane wyzwania związane z wykorzystaniem pierwotnych hMPC zarówno do badań, jak i terapii, w tym ograniczone zrozumienie komórek pochodzących od ludzi10. Istnieje również duży stopień zróżnicowania zdolności do ekspansji między kulturami dawców, co ogranicza potencjał stosowania hMPC i może wpływać...

Mięśnie szkieletowe to największy układ narządów w ludzkim ciele, stanowiący 30−40% masy całego ciała1. Oprócz dobrze rozpoznanej roli w lokomocji, mięśnie szkieletowe utrzymują temperaturę i postawę ciała oraz odgrywają kluczową rolę w homeostazie składników odżywczych całego organizmu. Badania z udziałem ludzi, zwierząt i modeli kultur komórkowych są cenne dla odpowiedzi na pytania dotyczące biologii i regeneracji mięśni szkieletowych. Izolacja i hodowla ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) zapewnia solidny model, który pozwala na zastosowanie technik hodowli komórkowych i manipulacji do próbek ludzkich. Zaletą stosowania hMPC jest to, że zachowują one fenotyp genetyczny i metaboliczny od każdego dawcy2,3. Utrzymanie fenotypu dawcy pozwala naukowcom na zbadanie międzyosobniczej zmienności w procesie miogennym. Na przykład, zastosowaliśmy naszą metodę charakterystyki hMPC, aby zidentyfikować związane z wiekiem i płcią różnice w zdolności ekspansji populacji hMPC4.
Celem tego protokołu jest szczegółowe opisanie technik izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania hMPC od tkanki biopsji mięśni szkieletowych. Opierając się na wcześniejszych pracach, które opisywały hMPC i identyfikowały potencjalnych producentów powierzchni komórek do izolacji hMPC5,6, protokół ten wypełnia krytyczną lukę w wiedzy, łącząc izolację z charakterystyką hMPC. Co więcej, szczegółowe instrukcje krok po kroku zawarte w tym protokole sprawiają, że izolacja i charakterystyka hMPC jest dostępna dla szerokiej publiczności naukowej, w tym dla osób o ograniczonym wcześniejszym doświadczeniu z hMPC. Nasz protokół jest jednym z pierwszych, który opisuje użycie cytometru obrazującego do śledzenia populacji komórek. Nowo zaprojektowane cytometry obrazujące są najnowocześniejsze, wysokowydajne i oparte na mikropłytkach, umożliwiając obrazowanie żywych komórek, zliczanie komórek i wielokanałową analizę fluorescencyjną wszystkich komórek w każdym dołku naczynia hodowlanego w ciągu kilku minut. System ten pozwala na szybką kwantyfikację dynamicznych zmian w proliferacji i żywotności całej populacji komórek przy minimalnym zakłóceniu hodowli. Na przykład, jesteśmy w stanie wykonać obiektywne pomiary konfluencji w kolejnych dniach in vitro, aby określić kinetykę wzrostu każdej kultury pochodzącej od różnych dawców. Wiele protokołów w literaturze, szczególnie te dotyczące różnicowania MPC, wymaga, aby komórki osiągnęły określony poziom konfluencji przed zainicjowaniem różnicowania lub leczenia7. Nasza metoda pozwala na obiektywne określenie zbiegu każdego dołka w naczyniu hodowlanym, co pozwala badaczom na rozpoczęcie leczenia w bezstronny, niesubiektywny sposób.
W przeszłości głównym ograniczeniem korzystania z podstawowych hMPC były niskie plony, które ograniczały liczbę komórek dostępnych do eksperymentów. My i inni wykazaliśmy, że wydajność MPC z tkanki biopsji mięśni szkieletowych wynosi 1−15 MPC na miligram tkanki (ryc. 1)8. Ponieważ nasz protokół pozwala na cztery przejścia komórek przed oczyszczeniem za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), nasze wyniki kriokonserwowanych hMPC, pochodzące z niewielkich ilości tkanki biopsyjnej (50-100 mg), są wystarczające do osiągnięcia celów badawczych, w których wymagane są liczne eksperymenty. Nasz protokół FACS wytwarza ~80% czystej (dodatniej Pax7) populacji MPC, dzięki czemu nasz protokół jest zoptymalizowany zarówno pod kątem wydajności, jak i czystości.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna, 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td>Trypsyna służy do usuwania przylegających hMPC z naczyń do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowej 10 cm</td><td>VWR</td><td>664160</td><td>Płytki do hodowli hMPC</td></tr><tr><td>15 ml probówka Falcon</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>stożkowe rurki 15 mL stosowane we wszystkich protokołach izolacji i hodowli hMPC</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Grenier Bio-One</td><td>662 160</td><td>Płytki używane do hodowli hMPC</td></tr><tr><td>7-AAD Roztwór do barwienia żywotności</td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td>Barwnik żywotności do identyfikacji żywych komórek podczas sortowania FACS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-ludzki CD29, klon: TS2/16</td><td>BioLegend</td><td>303016</td><td>Sprzężone przeciwciało dla FACS&nbsp;</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655079</td><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej idealna do obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu Celigo S</td></tr><tr><td>Celigo S Cytometr</td> do obrazowania <td>Nexcelcom Bioscience</td><td></td><td>Imaging służący do śledzenia hodowli hMPC</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>VWR</td><td>352350</td><td>Sitko do komórek do usuwania dużych kawałków zanieczyszczeń podczas przetwarzania biopsji mięśni</td></tr><tr><td>Kolagen typu I (Rat Ogon)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Kolagen do powlekania płytek do hodowli komórkowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11 088 882 001</td><td>Stosowana do degradacji kolagenu i innej tkanki łącznej w tkance biopsji mięśni szkieletowych</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>VWR</td><td>WN182</td><td>Stosowany do kriokonserwacji hMPC</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D4693</td><td>Proteaza stosowana do enzymatycznego trawienia tkanki</td></tr> <tr><td>biopsji mięśni szkieletowychDulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose Powder</td><td>Gibco</td><td>31600-034</td><td>Niskoglukozowy DMEM do przetwarzania biopsji mięśni</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td>PBS do przetwarzania biopsji mięśni</td></tr><tr><td>EDTA Sól disodowa Dihydrat</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-01&nbsp;</td><td>Wymagane dla bufora FACS</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>VWR</td><td>89510-186&nbsp;</td><td>Płodowa surowica bydlęca stosowana do pożywek wzrostowych hMPC</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Gibco</td><td>21700-026</td><td>Pożywka bazowa do hMPC</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica koni</td><td>Gibco</td><td>26-050-070</td><td>Surowica końska używana do produkcji pożywki różnicującej hMPC</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>iNCyto</td><td>DHC-N0105</td><td>Służy do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Hibernacja A</td><td>Gibco</td><td>A1247501</td><td>Pożywka do konserwacji biopsji mięśni szkieletowych tkanka</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian</td><td>Life Technologies</td><td>H21492</td><td>Barwienie DNA do identyfikacji wszystkich komórek za pomocą Celigo S</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P-4</td><td>Służy do kontrolowanego zamrażania hMPC</td></tr><tr><td>Bufor Moxi</td><td>Orflo</td><td>MXA006</td><td>Bufor do automatycznego licznika komórek</td></tr><tr><td>Kasety</td><td>Moxi Orflo</td><td>MXC002</td><td>Kasety do automatycznego licznika komórek</td></tr><tr><td>Moxi z Mini Automatyczny licznik komórek</td><td>Orflo</td><td></td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Dostępny komercyjnie pojemnik do zamrażania komórek o kontrolowanej szybkości</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (10%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>Serum kozie stosowane w buforze FACS</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mysz anty-ludzka CD56 , klon: B159</td><td>BD Pharmingen</td><td>557747</td><td>Sprzężone przeciwciało dla FACS&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100x Roztwór</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>Antybiotyki dodawane do pożywek</td></tr><tr><td>hodowlanych Jodek propidyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>Barwienie DNA do identyfikacji martwych komórek za pomocą</td></tr><tr><td>rekombinowanego ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów</td> Celigo S <td>Suplement Promega</td><td>G5071</td><td>w pożywce wzrostowej hMPC zapobiegający spontanicznemu różnicowaniu</td></tr><tr><td>Regeneracyjne podłoże do zamrażania kultur komórkowych&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>Pożywka używana do kriopevery zawiesin z biopsji mięśni</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Dodany do</td></tr><tr><td>sterylnych probówek z okrągłym dnem 5 ml</td> szynki <td>VWR</td><td>60818-565</td><td>Probówki używane do FACS</td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td>Koraliki kompensacyjne do kalibracji przepływu Ustawienia FACS</td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Wykorzystanie pierwotnych tkanek i komórek ludzkich jest idealne do badania procesów biologicznych i fizjologicznych, takich jak proces regeneracji mięśni szkieletowych. Istnieją rozpoznane wyzwania związane z pracą z ludzkimi pierwotnymi dorosłymi komórkami macierzystymi, w szczególności ludzkimi komórkami progenitorowymi mięśni (hMPC) pochodzącymi z biopsji mięśni szkieletowych, w tym niska wydajność komórek z pobranej tkanki i duży stopień niejednorodności parametrów wzrostu i śmierci dawcy między hodowlami. Podczas gdy włączenie heterogeniczności do projektu eksperymentalnego wymaga większej wielkości próby w celu wykrycia znaczących efektów, pozwala nam również zidentyfikować mechanizmy, które leżą u podstaw zmienności zdolności do ekspansji hMPC, a tym samym pozwala nam lepiej zrozumieć heterogeniczność w regeneracji mięśni szkieletowych. Nowe mechanizmy, które odróżniają zdolność kultur do ekspansji, mogą potencjalnie doprowadzić do opracowania terapii poprawiających regenerację mięśni szkieletowych.

Reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej izolacji hMPC z ludzkiej tkanki mięśniowej przedstawiono na Rysunku 1. hMPC można zidentyfikować, najpierw bramkując zdarzenia na podstawie rozproszenia bocznego (side scatter) i przedniego (forward scatter) w celu wyeliminowania martwych komórek lub zanieczyszczeń, a następnie wybierając tylko komórki wykazujące brak sygnału dla 7-AAD, czyli komórki żywe. Wybór komórek pozytywnych zarówno dla markerów powierzchn...

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych. hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Wyizolowanie komórek progenitorowych mięśni ludzkich, które regulują regenerację mięśni szkieletowych, pozwala nam badać procesy, które leżą u podstaw procesu regeneracyjnego przy jednoczesnym zachowaniu zmienności dawcy. Technika ta pozwala na uzyskanie dużych plonów komórek progenitorowych ludzkich mięśni z niewielkich ilości tkanek i ich analizę fenotypową przy użyciu niewielkiej liczby komórek. Metoda ta została specjalnie zaprojektowana do izolowania ludzkich komórek progenitorowych mięśni w celu śledzenia ich zdolności do proliferacji i różnicowania oraz powiązania tych danych z procesem regeneracji mięśni szkieletowych.Najtrudniejszym aspektem tej dość prostej techniki jest zapewnienie, że każdy krok jest wykonywany w sposób powtarzalny, aby zoptymalizować wydajność i czystość komórek. Istnieje wiele kroków, które należy wykonać, aby pomyślnie wyizolować komórki. Niektóre kroki są łatwiejsze do zrozumienia, jeśli są obserwowane wizualnie.Aby wyizolować komórki progenitorowe ludzkich mięśni z tkanki biopsyjnej, umieść tkankę mięśniową na sterylnej szalce Petriego w sterylnych warunkach i użyj sterylnego skalpela, aby zmielić tkankę na jednomilimetrowe kawałki sześcienne. Gdy cała tkanka zostanie zmielona, przenieś kawałki do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów PBS i pozwól tkankom osiąść grawitacyjnie przed ostrożnym zasysaniem supernatantu bez naruszania tkanki. Po umyciu fragmentów po raz drugi, jak właśnie pokazano, zastąp PBS 10 mililitrami zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco o niskiej zawartości glukozy.Usunąć supernatant po ustabilizowaniu tkanek i ponownie zawiesić kawałki w trzech mililitrach pożywki wytrawiającej. Umieść tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, z rozcieraniem fragmentów mięśni co 10 minut za pomocą jednomililitrowej pipety serologicznej. Pod koniec inkubacji dodać do próbek 83 mikrolitry dodatkowej pożywki wytrawiającej i 24 mikrolitry roztworu dyspazy i rozcierać tkanki co pięć do 10 minut za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze, aż do uzyskania jednolitej zawiesiny.Jednolita zawiesina jest ważna dla maksymalnego odzysku komórek progenitorowych ludzkich mięśni. Kontynuuj trawienie, jeśli gnojowica nie przejdzie przez standardową końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Aby wyizolować komórki Pax7-dodatnie, wybarwić i zabramować komórki zgodnie z protokołem.Posortuj podwójnie dodatnie komórki progenitorowe mięśni ludzkich CD56, CD29 na cytometrze przepływowym z dyszą 100 mikrometrów pod ciśnieniem 20 funtów na cal kwadratowy do probówek zbiorczych zawierających 300-mikrolitrową poduszkę buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Następnie zasiej posortowane komórki progenitorowe ludzkich mięśni na pokrytych kolagenem 24-dołkowych płytkach zawierających wstępnie podgrzaną pożywkę wzrostową o stężeniu 3,5 razy 10 do czwartej komórki na centymetr kwadratowy. Aby wykonać skany konfluencji, załaduj płytkę do cytometru obrazowego i wybierz opcję Utwórz nowy skan oraz Kategoria płytki, Profil płytki i ID płytki. W obszarze Zastosowanie wybierz opcję Confluence i Confluence 1, a następnie wybierz studzienkę do wyświetlenia.Zlokalizuj płaszczyznę ostrości, w której komórki wydają się białe w porównaniu z tłem, a następnie wybierz opcję Zarejestruj ręcznie. Użyj myszy, aby podświetlić wszystkie studzienki, które należy zeskanować, a następnie wybierz opcję Rozpocznij skanowanie. Cały obszar studni zostanie automatycznie przeskanowany.Wybierz ustawienia analizy, które są optymalne dla typu płyty i komórki, a następnie wybierz opcję Rozpocznij analizę. Użyj cytometru obrazowego, aby początkowo zmierzyć zbieg. Następnie, aby policzyć komórki na cytometrze obrazującym, zastąp pożywkę w każdej studzience 200 mikrolitrami roztworu barwiącego.Po 15 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zastąp roztwór barwiący 100 mikrolitrami świeżej szynki F12. Umieść płytkę z powrotem na cytometrze obrazującym, a następnie w obszarze Application (Zastosowanie) wybierz Cell Viability (Żywotność komórek) i Live Dead Total (Całkowita liczba żywych trupów). Kanał Live będzie obrazem w jasnym polu, kanał Dead będzie pokazywał barwienie jodkiem propidyny, a kanał Total będzie barwieniem Hoechst 33342.W obszarze Focus Setup (Ustawienia ostrości) kliknij opcję Register Auto (Zarejestruj automatycznie). W obszarze Łączna liczba kanałów ustaw kanał na niebieski. Użyj narzędzia Znajdź ostrość, aby ustawić ostrość na jądrach, a następnie kliknij przycisk Ustaw przesunięcie, aby wybrać fokus.Pod kanałem Dead (Martwy) ustaw kanał na czerwony i użyj funkcji Znajdź punkt skupienia, aby ustawić ostrość na martwych komórkach. Kliknij przycisk Ustaw przesunięcie, aby wybrać fokus, a następnie wybierz opcję Rozpocznij skanowanie, aby rozpocząć skanowanie. Następnie wybierz parametry analizy, które są odpowiednie dla typu płyty i komórki, a następnie wybierz opcję Rozpocznij analizę, aby rozpocząć analizę.Po zakończeniu analizy sprawdź wzrokowo, czy analiza prawidłowo policzyła komórki. Jeśli skan i analiza są zadowalające, włóż płytkę z powrotem do inkubatora, w przeciwnym razie ponownie zeskanuj lub zmodyfikuj parametry analizy. Ludzkie komórki progenitorowe mięśni można zidentyfikować najpierw przez zdarzenia bramkowania oparte na obszarze rozpraszania bocznego i przedniego w celu wyeliminowania martwych komórek lub szczątków, a następnie wybierając tylko te komórki, które są ujemne dla 7-AAD i dlatego są żywotne.Komórki, które są dodatnie zarówno dla markerów powierzchniowych komórek CD56, jak i CD29, reprezentują następnie populację komórek progenitorowych mięśni ludzkich. Ludzkie komórki progenitorowe mięśni można również zidentyfikować na podstawie ich ekspresji Pax7. Rzeczywiście, Pax7 jest wzbogacony w całej populacji po FACS i jest utrzymywany przez wiele pasaży.W tym miejscu pokazany jest reprezentatywny skan zbiegu. Zielone kontury zostały wygenerowane przez cytometr obrazujący i pokazują, w jaki sposób cytometr obrazujący określił zbieg na podstawie wybranych ustawień analizy. Niejednorodność i liczba jąder jest powszechna wśród dawców.Odkrycie i dokładne scharakteryzowanie tej niejednorodności jest kluczowym zastosowaniem cytometru obrazowego. Pomiary konfluencji i liczba jąder od unikalnych dawców są jednak silnie skorelowane. Ludzkie komórki progenitorowe mięśni zróżnicowane w celu utworzenia miotub można odróżnić na podstawie embrionalnej ekspresji ciężkiego łańcucha miozyny.Ważne jest, aby być konsekwentnym przy doborze parametrów bramkowania na cytometrze przepływowym, aby wyizolować tę samą populację komórek od każdego dawcy. Po wyizolowaniu ludzkie komórki progenitorowe mięśni mogą być wykorzystywane do wielu celów, w tym do identyfikacji unikalnych wymagań metabolicznych proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych mięśni ludzkich. Izolacja komórek progenitorowych mięśni ludzkich pozwoliła na rozróżnienie różnic w ekspresji markerów powierzchniowych komórek na komórkach progenitorowych mięśni ludzkich i myszy.

isolation-culture-characterization-differentiation-human-muscle

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej.  Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych.  Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Ten protokół opisuje solidną, powtarzalną i prostą metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych mioblastów z mięśni szkieletowych osób dorosłych i starszych. Wykorzystywane tutaj mięśnie obejmują mięśnie stóp i nóg. Takie podejście umożliwia wyizolowanie wzbogaconej populacji pierwotnych mioblastów do badań funkcjonalnych.

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj izolację i charakterystykę ludzkich komórek progenitorowych mięśni z biopsji tkanki mięśniowej. Ta metoda umożliwia badanie proliferacji, różnicowania i regeneracji mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów