Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych
23 sierpnia 2019
Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych. hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.
Wyizolowanie komórek progenitorowych mięśni ludzkich, które regulują regenerację mięśni szkieletowych, pozwala nam badać procesy, które leżą u podstaw procesu regeneracyjnego przy jednoczesnym zachowaniu zmienności dawcy. Technika ta pozwala na uzyskanie dużych plonów komórek progenitorowych ludzkich mięśni z niewielkich ilości tkanek i ich analizę fenotypową przy użyciu niewielkiej liczby komórek. Metoda ta została specjalnie zaprojektowana do izolowania ludzkich komórek progenitorowych mięśni w celu śledzenia ich zdolności do proliferacji i różnicowania oraz powiązania tych danych z procesem regeneracji mięśni szkieletowych.
Najtrudniejszym aspektem tej dość prostej techniki jest zapewnienie, że każdy krok jest wykonywany w sposób powtarzalny, aby zoptymalizować wydajność i czystość komórek. Istnieje wiele kroków, które należy wykonać, aby pomyślnie wyizolować komórki. Niektóre kroki są łatwiejsze do zrozumienia, jeśli są obserwowane wizualnie.
Aby wyizolować komórki progenitorowe ludzkich mięśni z tkanki biopsyjnej, umieść tkankę mięśniową na sterylnej szalce Petriego w sterylnych warunkach i użyj sterylnego skalpela, aby zmielić tkankę na jednomilimetrowe kawałki sześcienne. Gdy cała tkanka zostanie zmielona, przenieś kawałki do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów PBS i pozwól tkankom osiąść grawitacyjnie przed ostrożnym zasysaniem supernatantu bez naruszania tkanki. Po umyciu fragmentów po raz drugi, jak właśnie pokazano, zastąp PBS 10 mililitrami zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco o niskiej zawartości glukozy.
Usunąć supernatant po ustabilizowaniu tkanek i ponownie zawiesić kawałki w trzech mililitrach pożywki wytrawiającej. Umieść tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, z rozcieraniem fragmentów mięśni co 10 minut za pomocą jednomililitrowej pipety serologicznej. Pod koniec inkubacji dodać do próbek 83 mikrolitry dodatkowej pożywki wytrawiającej i 24 mikrolitry roztworu dyspazy i rozcierać tkanki co pięć do 10 minut za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze, aż do uzyskania jednolitej zawiesiny.
Jednolita zawiesina jest ważna dla maksymalnego odzysku komórek progenitorowych ludzkich mięśni. Kontynuuj trawienie, jeśli gnojowica nie przejdzie przez standardową końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Aby wyizolować komórki Pax7-dodatnie, wybarwić i zabramować komórki zgodnie z protokołem.
Posortuj podwójnie dodatnie komórki progenitorowe mięśni ludzkich CD56, CD29 na cytometrze przepływowym z dyszą 100 mikrometrów pod ciśnieniem 20 funtów na cal kwadratowy do probówek zbiorczych zawierających 300-mikrolitrową poduszkę buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Następnie zasiej posortowane komórki progenitorowe ludzkich mięśni na pokrytych kolagenem 24-dołkowych płytkach zawierających wstępnie podgrzaną pożywkę wzrostową o stężeniu 3,5 razy 10 do czwartej komórki na centymetr kwadratowy. Aby wykonać skany konfluencji, załaduj płytkę do cytometru obrazowego i wybierz opcję Utwórz nowy skan oraz Kategoria płytki, Profil płytki i ID płytki. W obszarze Zastosowanie wybierz opcję Confluence i Confluence 1, a następnie wybierz studzienkę do wyświetlenia.
Zlokalizuj płaszczyznę ostrości, w której komórki wydają się białe w porównaniu z tłem, a następnie wybierz opcję Zarejestruj ręcznie. Użyj myszy, aby podświetlić wszystkie studzienki, które należy zeskanować, a następnie wybierz opcję Rozpocznij skanowanie. Cały obszar studni zostanie automatycznie przeskanowany.
Wybierz ustawienia analizy, które są optymalne dla typu płyty i komórki, a następnie wybierz opcję Rozpocznij analizę. Użyj cytometru obrazowego, aby początkowo zmierzyć zbieg. Następnie, aby policzyć komórki na cytometrze obrazującym, zastąp pożywkę w każdej studzience 200 mikrolitrami roztworu barwiącego.
Po 15 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zastąp roztwór barwiący 100 mikrolitrami świeżej szynki F12. Umieść płytkę z powrotem na cytometrze obrazującym, a następnie w obszarze Application (Zastosowanie) wybierz Cell Viability (Żywotność komórek) i Live Dead Total (Całkowita liczba żywych trupów). Kanał Live będzie obrazem w jasnym polu, kanał Dead będzie pokazywał barwienie jodkiem propidyny, a kanał Total będzie barwieniem Hoechst 33342.
W obszarze Focus Setup (Ustawienia ostrości) kliknij opcję Register Auto (Zarejestruj automatycznie). W obszarze Łączna liczba kanałów ustaw kanał na niebieski. Użyj narzędzia Znajdź ostrość, aby ustawić ostrość na jądrach, a następnie kliknij przycisk Ustaw przesunięcie, aby wybrać fokus.
Pod kanałem Dead (Martwy) ustaw kanał na czerwony i użyj funkcji Znajdź punkt skupienia, aby ustawić ostrość na martwych komórkach. Kliknij przycisk Ustaw przesunięcie, aby wybrać fokus, a następnie wybierz opcję Rozpocznij skanowanie, aby rozpocząć skanowanie. Następnie wybierz parametry analizy, które są odpowiednie dla typu płyty i komórki, a następnie wybierz opcję Rozpocznij analizę, aby rozpocząć analizę.
Po zakończeniu analizy sprawdź wzrokowo, czy analiza prawidłowo policzyła komórki. Jeśli skan i analiza są zadowalające, włóż płytkę z powrotem do inkubatora, w przeciwnym razie ponownie zeskanuj lub zmodyfikuj parametry analizy. Ludzkie komórki progenitorowe mięśni można zidentyfikować najpierw przez zdarzenia bramkowania oparte na obszarze rozpraszania bocznego i przedniego w celu wyeliminowania martwych komórek lub szczątków, a następnie wybierając tylko te komórki, które są ujemne dla 7-AAD i dlatego są żywotne.
Komórki, które są dodatnie zarówno dla markerów powierzchniowych komórek CD56, jak i CD29, reprezentują następnie populację komórek progenitorowych mięśni ludzkich. Ludzkie komórki progenitorowe mięśni można również zidentyfikować na podstawie ich ekspresji Pax7. Rzeczywiście, Pax7 jest wzbogacony w całej populacji po FACS i jest utrzymywany przez wiele pasaży.
W tym miejscu pokazany jest reprezentatywny skan zbiegu. Zielone kontury zostały wygenerowane przez cytometr obrazujący i pokazują, w jaki sposób cytometr obrazujący określił zbieg na podstawie wybranych ustawień analizy. Niejednorodność i liczba jąder jest powszechna wśród dawców.
Odkrycie i dokładne scharakteryzowanie tej niejednorodności jest kluczowym zastosowaniem cytometru obrazowego. Pomiary konfluencji i liczba jąder od unikalnych dawców są jednak silnie skorelowane. Ludzkie komórki progenitorowe mięśni zróżnicowane w celu utworzenia miotub można odróżnić na podstawie embrionalnej ekspresji ciężkiego łańcucha miozyny.
Ważne jest, aby być konsekwentnym przy doborze parametrów bramkowania na cytometrze przepływowym, aby wyizolować tę samą populację komórek od każdego dawcy. Po wyizolowaniu ludzkie komórki progenitorowe mięśni mogą być wykorzystywane do wielu celów, w tym do identyfikacji unikalnych wymagań metabolicznych proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych mięśni ludzkich. Izolacja komórek progenitorowych mięśni ludzkich pozwoliła na rozróżnienie różnic w ekspresji markerów powierzchniowych komórek na komórkach progenitorowych mięśni ludzkich i myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia techniki izolacji i charakteryzacji ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPCs) z tkanki pobranej podczas biopsji mięśnia szkieletowego. Metody te umożliwiają badaczom analizę ludzkiej miogenezy oraz regeneracji mięśni szkieletowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Ludzkie komórki progenitorowe mięśni odgrywają kluczową rolę w regeneracji mięśni szkieletowych.
- Izolacja tych komórek umożliwia badanie procesów regeneracyjnych z uwzględnieniem zmienności między dawcami.
- Techniki izolacji komórek muszą być powtarzalne, aby zapewnić optymalną wydajność i czystość.
- Obserwacja wizualna etapów izolacji może zwiększyć zrozumienie procesu.
Cel badania
- Izolacja ludzkich komórek progenitorowych mięśni do badań nad regeneracją mięśni.
- Analiza zdolności tych komórek do proliferacji i różnicowania.
- Powiązanie wyników z ogólnym procesem regeneracji mięśni szkieletowych.
Zastosowane metody
- Izolacja hMPC z tkanki pobranej podczas biopsji mięśnia szkieletowego.
- Charakterystyka wyizolowanych komórek.
- Analiza fenotypowa z wykorzystaniem niewielkich ilości komórek.
- Monitorowanie zdolności do proliferacji i różnicowania.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja hMPC z minimalnych próbek tkanki.
- Charakterystyka komórek wykazuje ich potencjał do zastosowań badawczych.
- Powtarzalność metody zapewnia wiarygodne wyniki.
- Uzyskano wiedzę na temat procesu regeneracji mięśni szkieletowych.
Wnioski
- Przedstawione techniki są skuteczne w izolacji i badaniu hMPCs.
- Metody te mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia regeneracji mięśni.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zbadania zastosowań terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Izolacja i charakterystyka ludzkich komórek progenitorowych mięśni (hMPCs) z biopsji mięśni szkieletowych umożliwiają mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów regeneracji mięśni. Podejście to wspiera przesiewy fenotypowe oraz opracowywanie testów, zapewniając system istotny z punktu widzenia choroby, z heterogenicznością dawców odzwierciedlającą zmienność kliniczną. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie zdolności do ekspansji komórkowej z wynikami regeneracji mięśni szkieletowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących szlaków regeneracji mięśni szkieletowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację proliferacji i różnicowania hMPC.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez powiązanie fenotypów komórkowych z procesami regeneracyjnymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zstandaryzowany, powtarzalny system przygotowania zwalidowanych próbek biologicznych do dalszych badań przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ilościowy pomiar konfluencji oraz liczby jąder komórkowych przy użyciu cytometrii obrazowej w celu standaryzacji testu.
- Wartość naukowa: Wspiera skalowalność testu i ponowne wykorzystanie platformy dzięki spójnym protokołom izolacji i wysiewania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje system istotny z punktu widzenia choroby do badania zmienności w zdolności do ekspansji u poszczególnych dawców, co pozwala na dostosowanie translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez utrzymanie ekspresji Pax7 oraz potencjału różnicowania w miotuby.
- Wartość naukowa: Wspiera decyzje o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację mechanizmów leżących u podstaw heterogeniczności potencjału regeneracyjnego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – dostarczając mierzalnych fenotypów komórkowych z rozróżnieniem na dawców.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie śledzenia proliferacji i różnicowania izolowanych hMPC.
- Screening: Zapewnia gotowość i powtarzalność analiz dzięki standaryzowanemu trawieniu tkanek, sortowaniu FACS i wysiewowi na płytki powlekane kolagenem.
- Analityka: Generuje ilościowe skany konfluencji i zliczenia jąder komórkowych, co pozwala na porównania między różnymi dawcami oraz ocenę warunków doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki zachowaniu zdolności do różnicowania miogennego oraz ekspresji embrionalnego ciężkiego łańcucha miozyny w uformowanych miotubach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku schemat izolacji i charakterystyki, który można zastosować w wielu próbkach od różnych dawców oraz w różnych warunkach eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez powiązanie ekspansji komórkowej z potencjałem regeneracyjnym.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność uzysku oraz czystości komórek dzięki zoptymalizowanym etapom trawienia i sortowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji typu go/no-go dzięki umożliwieniu oceny funkcjonalności komórek progenitorowych mięśni z podziałem na grupy dawców.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów regeneracyjnych w oparciu o analizę ryzyka z wykorzystaniem mierników potencjału ekspansji uwzględniających heterogeniczność.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu pracy z tkankami pierwotnymi, cytometrii przepływowej oraz cytometrii obrazowej w celu izolacji i analizy żywych komórek.
- Procedura jest zależna od infrastruktury do sterylnej hodowli tkanek, sprzętu do sortowania komórek metodą FACS oraz zautomatyzowanych platform obrazowania.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów bramkowania dla CD56/CD29 i Pax7 pomiędzy zespołami, aby zapewnić spójną identyfikację hMPC u różnych dawców.
- Należy uwzględnić konieczność adaptacji metod do różnej jakości tkanek od dawców i rozmiarów biopsji w celu utrzymania wydajności izolacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależną od dawcy zmienność w uzysku komórkowym i kinetyce ekspansji, co wymaga większych prób w celu uzyskania mocy statystycznej.
