Name: Ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę oceny stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z użyciem glukuronidazy jako markera. Protokół wykorzystuje frakcjonowanie AF4 do porównania pęcherzyków z różnych komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Program NanoMatFutur Junior Research z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych w Niemczech (grant numer 13XP5029A) wspierał tę pracę. Maximilian Richter otrzymał wsparcie od Studienstiftung des Deutschen Volkes (Niemieckiej Fundacji Stypendiów Akademickich) w ramach stypendium doktoranckiego.

1. Hodowla komórkowa i produkcja pożywki kondycjonowanej przez komórkę
<ol>
	<li>Ogólnie rzecz biorąc, hoduj komórki w indywidualnych warunkach wymaganych dla danej linii komórkowej.</li>
	<li>Hodować komórki przez 24-72 godziny w warunkach bez surowicy lub w pożywce zawierającej płodową surowicę bydlęcą zubożoną w EV (FBS). 
	UWAGA: Jeśli używany jest FBS zubożony w EV, należy zastosować metodę o udowodnionej skuteczności wyczerpywania surowicy, aby zapobiec zanieczyszczeniu EVs pochodzących z surowicy bydlęcej26.</li>
	<li>Zebrać pożywkę z kolb. Wirować przy 300 x g przez 10 minut, aby granulować komórki. Ostrożnie zebrać pożywkę kondycjonowaną komórkowo (CCM), nie naruszając granulowanych komórek. Zaleca się stosowanie CCM bezpośrednio lub przechowywanie go przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zawsze zaleca się stosowanie świeżo wyprodukowanego CCM. Jeżeli nie można obejść przechowywania przez dłuższy czas, wszystkie istotne parametry należy zapisać zgodnie z wytycznymi MISEV201826, przy czym należy wziąć pod uwagę potencjalne odchylenia uzyskanych wyników.</li>
	<li>Przykładowy protokół dla HUVEC
	<ol>
		<li>Hodować komórki HUVEC przez 120 godzin w pożywce EGM-2 zawierającej FBS i inne suplementy.</li>
		<li>Hodować komórki HUVEC przez 48 godzin w pożywce podstawowej EBM-2 bez żadnych dodatkowych suplementów.</li>
		<li>Zebrać pożywkę z kolb i przeprowadzić etap wirowania, jak wskazano powyżej (krok 1.3). Zazwyczaj używa się 100 ml pożywki na jedną izolację EV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ultrawirowanie CCM
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed ultrawirowaniem (UC) należy odwirować CCM przez 15 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i dużych aglomeratów.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść supernatant do probówek UC. Jeśli używasz wirnika o stałym kącie, zaznacz orientację probówek w wirówce, aby ułatwić pobieranie granulatu EV po UC. Wirować przez 2 godziny przy 120 000 x g, ze współczynnikiem k 259,4.</li>
	<li>Po UC ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej, aby uniknąć zakłócenia granulowanych EVs. 
	UWAGA: Śrut może być niewidoczny.</li>
	<li>Dodać 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z filtrem 0,2 μm do pierwszej probówki i użyć PBS oraz pozostałego supernatantu do ponownego zawieszenia osadu przez pipetowanie w górę i w dół. Przenieść otrzymaną zawiesinę EV do następnej probówki odpowiedniej próbki i użyć jej do ponownego zawieszenia. Postępuj w ten sposób, aby ponownie zawiesić wszystkie EV próbki w końcowej objętości około 300-350 μl.</li>
	<li>Po ponownym zawieszeniu potwierdzić obecność cząstek za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Użyj ustawień zoptymalizowanych dla danego typu EV, takich jak ustawienia poniżej (krok 2.5.1). 
	UWAGA: Artykuły Gardinera i wsp.27 oraz Vestad et al.28 zawierają cenne informacje na temat optymalizacji parametrów pomiaru EV.
	<ol>
		<li>Aby odtworzyć wyniki opisane poniżej, użyj przyrządów (np. NanoSight LM14) wyposażonych w zielony laser. Nagraj trzy filmy trwające 30 s z przyrostem ekranu 1,0 i poziomem kamery 13. Do analizy należy użyć wzmocnienia ekranu 1,0 i progu wykrywania 5.</li>
	</ol>
	</li>
	Jeśli <li>to możliwe, należy natychmiast zużyć granulki, w przeciwnym razie przechowywać je w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
3. Kapsułkowanie glukuronidazy do EV
<ol>
	<li>Do zawieszonego osadu dodać beta-glukuronidazę (10 mg/ml w PBS) do końcowego stężenia 1,5 mg/ml i saponinę (10 mg/ml w H2O) do końcowego stężenia 0,1 mg/ml. Dobrze wymieszaj, wirując przez 3 sekundy.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z przerywanym mieszaniem, delikatnie przesuwając probówkę. Po inkubacji oczyścić bezpośrednio metodą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) (patrz sekcja 5). 
	UWAGA: Nie zamrażaj ponownie próbek glukuronidazy po rozmrożeniu, aby zapobiec degradacji enzymów w wyniku zamrożenia.</li>
</ol>
4. Produkcja liposomów
<ol>
	<li>Aby przygotować liposomy do porównania z EV, rozpuścić 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DMPC) i 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC) w stosunku molowym 2:3 w chloroformie do końcowego stężenia 5 mM. Przygotować 1 ml porcji w fiolkach do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i pozostawić do wyschnięcia przez noc, aby utworzyć film lipidowy. 
	UWAGA: Chloroform jest toksyczny i podejrzewa się, że jest rakotwórczy. Podejmij odpowiednie środki ostrożności podczas obchodzenia się z nim.</li>
	<li>Ponownie uwodnić warstwę lipidową za pomocą 1 ml PBS zawierającego 1,5 mg/ml glukuronidazy. Podgrzej do 42 °C i wiruj przez 1 minutę. Podgrzej zespół wytłaczarki do 42 °C i wytłacz zawiesinę lipidową 11x przez membranę poliwęglanową o długości fali 200 nm. Oczyszczanie bezpośrednie przez SEC (patrz sekcja 5).</li>
</ol>
5. Oczyszczanie przez SEC
<ol>
	<li>Przygotuj kolumnę SEC przy użyciu następującego protokołu.
	<ol>
		<li>Używaj tylko świeżej oczyszczonej wody i świeżo przygotowanych. Przefiltrować wszystkie przez filtr membranowy 0,2 μm i odgazować je, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w kolumnie.</li>
		<li>Do przygotowania kolumny SEC należy użyć matrycy na bazie filtracji w żelu agarozowym (np. Sepharose Cl-2b) lub innej pożywki SEC odpowiedniej do oddzielenia EV i liposomów od zanieczyszczeń białkowych i nadmiaru enzymu. Najpierw usuń 20% roztwór EtOH, w którym przechowywane jest medium, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w kolumnie. W tym celu należy odwirować pożywkę SEC o sile 3 000 x g przez 10 minut, usunąć EtOH i zastąpić go odgazowaną wodą.</li>
		<li>Napełnić szklaną kolumnę (o średnicy wewnętrznej 10 mm) podłożem SEC do oznaczenia 15 ml. 
		UWAGA: Objętości będą się różnić w przypadku kolumn o różnych wymiarach. Upewnij się, że żel całkowicie osiada</li>.
		<li>Przed uruchomieniem należy zrównoważyć kolumnę z co najmniej dwoma woluminami kolumn PBS. Aby przechowywać kolumnę, najpierw umyj ją jedną objętością kolumny wody, a następnie co najmniej dwiema objętościami kolumny po 20% EtOH. Po przechowywaniu najpierw umyj kolumnę jedną objętością wody, a następnie wyrównaj PBS.</li>
		<li>Użyj do 400 μl EV lub zawiesiny liposomowej w jednej separacji. Zbierz frakcje po 1 ml. Po SEC należy przechowywać oczyszczone EV (patrz sekcja 7) lub poddać je testowi glukuronidazy (patrz punkt 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź oddzielenie EV i liposomów od zanieczyszczających białek i wolnej glukuronidazy. W tym celu należy skorelować stężenia cząstek pobranych frakcji ze stężeniem białka i aktywnością glukuronidazy.
	<ol>
		<li>Ocenić stężenie cząstek za pomocą NTA (patrz 2.5)</li>
		<li>Ocenić zawartość białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) lub innego odpowiedniego testu ilościowego oznaczania białka. Wykonaj test zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Ocenić aktywność glukuronidazy za pomocą testu glukuronidazy (patrz punkt 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalnie można ocenić morfologię EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
	<ol>
		<li>W celu przygotowania próbek TEM należy dodać 10 μl zawiesiny EV do siatki TEM, inkubować przez 10 minut, a następnie usunąć nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej. Wykonuj utrwalanie przez 10 minut z 10 μl 4% paraformaldehydu i zetrzyj nadmiar. Umyć 3x wodą. Zabarwić pęcherzyki przez 20-sekundową inkubację z 30 μl 1% hydratu kwasu fosforowo-wolframowego. Po osuszeniu nadmiaru wysusz pęcherzyki przez noc. Wizualizacja za pomocą TEM. 
		UWAGA: Kwas fosfowolframowy jest silnie; W ten sposób chroń skórę i oczy.</li>
		<li>W przypadku SEM należy umieścić wcześniej przygotowane próbki TEM na krążkach węglowych i napylić je warstwą złota o grubości 50 nm. Wizualizacja za pomocą SEM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Test glukuronidazy
<ol>
	<li>Aby umożliwić porównanie różnych próbek i warunków przechowywania poprzez skorelowanie liczby cząstek i aktywności enzymu, należy najpierw zmierzyć stężenie cząstek w próbce za pomocą NTA (patrz krok 2.5).</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy di-β-D-glukuronidu fluoresceiny, dodając 1 μl związku (10 mg/ml wH2O) do 199 μl PBS. Dodaj 25 μl tego roztworu do 125 μl oczyszczonych EV, aby uzyskać końcowe stężenie 8,3 μg/ml. Odpipetować próbkę do czarnej płytki 96-dołkowej. Zmierz punkt czasowy 0 h za pomocą czytnika płytek, używając 480 nm jako wzbudzenia i 516 nm jako długości fali emisji.</li>
	<li>Przykryć szczelnie płytkę (np. przezroczystą folią z tworzywa sztucznego używaną do płytek PCR) w celu zminimalizowania parowania i inkubować w ciemności przez 18 godzin w temperaturze 37 °C. Zmierzyć produkcję fluoresceiny przy użyciu parametrów czytnika płytek wymienionych w kroku 6.2.</li>
</ol>
7. Przechowywanie EV i liposomów
UWAGA: Do wszystkich celów przechowywania, zaleca się używanie rurek o niskim stopniu wiązania, aby zmniejszyć straty EV spowodowane adsorpcją.
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z parametrami w tej sekcji, aby odtworzyć reprezentatywne wyniki podane poniżej. Należy użyć próbek składających się z 400 μl zawiesiny EV.
	<ol>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C lub -80 °C lub postępować zgodnie z poniższymi krokami.</li>
		<li>Liofilizacja pojazdów elektrycznych.
		<ol>
			<li>Dodać trehalozę (40 mg/ml wH2O) do końcowego stężenia 4 mg/ml do oczyszczonych EVs. Zamrażać próbki w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
			<li>Liofilizować próbki, stosując następujące parametry. W przypadku suszenia głównego należy ustawić temperaturę półki na 15 °C i ciśnienie na 0,180 mbar i pozostawić próbki do wyschnięcia na 46 godzin. W celu końcowego suszenia należy ustawić temperaturę półki na 25 °C i ciśnienie na 0,0035 mbar i pozostawić próbki do wyschnięcia na 2 godziny. Przechowywać liofilizowane próbki w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Aby ponownie uwodnić próbki, dodać H2O, równą ilości zawiesiny EV obecnej na początku (zwykle 400 μL). Nie używaj żadnego buforu do ponownego wypełniania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza po przechowywaniu
<ol>
	<li>Aby ocenić aktywność enzymu, należy najpierw usunąć wolną glukuronidazę, która mogła wycieknąć z EV podczas przechowywania. Osiąga się to poprzez dodatkowy etap oczyszczania, który przeprowadza się albo za pomocą SEC (patrz krok 5), albo frakcjonowania z przepływem asymetrycznym (AF4) (patrz krok 8.1.2). 
	UWAGA: Należy pamiętać, że obie metody prowadzą do rozcieńczenia próbki EV; w związku z tym przed przechowywaniem należy stosować wystarczające stężenia EV, aby uniknąć przekroczenia poniżej limitu kwantyfikacji NTA. Spodziewaj się rozcieńczenia cząstek w stosunku 1:10 ze względu na SEC lub AF4.
	<ol>
		<li>W celu oczyszczenia SEC postępuj zgodnie z protokołem opisanym powyżej (patrz sekcja 5).</li>
		<li>Wykonaj oczyszczanie AF4.
		<ol>
			<li>Ustaw instrument za pomocą małego kanału z przekładką 350 μm i membraną celulozową o masie cząsteczkowej 30 kD. Umieść filtr o wielkości porów 0,1 μm między pompą HPLC a kanałem AF4. Użyj świeżo przygotowanego PBS przefiltrowanego przez 0,1 μm jako fazy ruchomej, aby zmniejszyć obciążenie cząstkami i szum w detektorach rozpraszania światła.</li>
			<li>Wykrywanie białek za pomocą detektora UV ustawionego na 280 nm. Do wykrywania cząstek należy stosować wielokątowe rozpraszanie światła z laserem ustawionym na 658 nm.</li>
			<li>Użyj następującej metody uruchamiania. Wstępne ustawianie ostrości przez 1 minutę z przepływem ostrości 1 ml/min; następnie wstrzyknąć 300 μl próbki z szybkością 0,2 ml/min i utrzymać przepływ ostrości przez 10 minut. Po wstrzyknięciu eluować próbkę z prędkością 1 ml/min, stosując przepływ krzyżowy, który zmniejsza się z 2 ml/min do 0,1 ml/min w ciągu 8 minut. Elucja przez kolejne 10 minut bez przepływu krzyżowego. Zbieraj frakcje po 1 ml, zaczynając po 12,5 min i kontynuując do 27 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonać test glukuronidazy zgodnie z powyższym opisem (patrz punkt 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ocenić wielkość i stężenie, należy użyć NTA, jak opisano powyżej (patrz krok 2.5).</li>
	<li>Opcjonalnie należy przeprowadzić TEM i SEM w celu oceny morfologii EV po przechowywaniu (patrz 5.3).</li>
</ol>

<ol><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).</li>
<li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li>
<li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li>
<li>György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles%3A+Clinical+Promise+and+Open+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li>
<li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450(2017).</li>
<li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746(2017).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4%28%2B%29+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li>
<li>Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356(2014).</li>
<li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li>
<li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259(2017).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).</li>
<li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).</li>
<li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+things+come+in+small+packages%3A+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li>
<li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190(2017).</li>
<li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).</li>
<li>Lőrincz, ÁM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465(2014).</li>
<li>Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377(2018).</li>
<li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Protect+and+to+Preserve%3A+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li>
<li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li>
<li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671(2013).</li>
<li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis%3A+a+variation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162(2016).</li>
<li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509(2015).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym manuskrypcie przedstawiamy kompleksowy protokół badania stabilności pojazdów elektrycznych w różnych warunkach przechowywania. Dzięki połączeniu kapsułkowanej glukuronidazy jako odczytu funkcjonalnego i oceny parametrów fizykochemicznych EV, protokół pozwala na prostą ocenę stabilności przechowywania EV i porównanie EV z różnych linii komórkowych. SEM i TEM jako metody uzupełniające pozwalają na wgląd w zmiany EV na poziomie pojedynczych cząstek. Przedstawione tutaj wyniki wykazały tendencję EV i liposomów do agreg...

EV to związane z błoną nanocząstki wytwarzane przez prawie wszystkie typy komórek. W przypadku komórek ssaków EV można podzielić na dwie główne grupy o różnych ścieżkach produkcji1,2. Pęcherzyki błonowe o wielkości od około 100 do 1,000 nm są wytwarzane przez bezpośrednie pączkowanie z błony komórkowej. Egzosomy o wielkości 30-200 nm pochodzą z ciał wielopęcherzykowych utworzonych przez pączkowanie do wewnątrz w endosomy, które następnie łączą się z błoną komórkową, uwalniając wiele egzosomów jednocześnie. Główną funkcją tych pęcherzyków jest transport informacji między komórkami3. W tym celu ładunki, takie jak RNA, DNA i białka, są w nich aktywnie sortowane. Pojazdy elektryczne mogą wywierać różnorodny wpływ na swoje cele, co ma wpływ zarówno na zdrowie, jak i stan chorobowy. Z jednej strony pośredniczą w pozytywnych efektach, takich jak regeneracja tkanek, prezentacja antygenu lub działanie antybiotykowe, co czyni je pomyślnymi celami dla ich rozwoju jako terapeutyki4,5. Z drugiej strony, EV mogą sprzyjać unaczynieniu nowotworu6, wywoływać efekty osób postronnych w reakcjach na stres7 i mogą odgrywać rolę w chorobach autoimmunologicznych8 i chorobach zapalnych9. W związku z tym mogą być kluczowym elementem lepszego zrozumienia wielu patologicznych skutków. Jednak obecność zmienionych EV w różnych chorobach, takich jak rak10,11,12 i zaburzenia sercowo-naczyniowe13, oraz ich łatwa dostępność we krwi i moczu sprawiają, że są idealnymi biomarkerami. Wreszcie, ich dobra biokompatybilność14 i ich wrodzona zdolność do celowania sprawiają, że EV są również interesujące dla dostarczania leków15. W tym manuskrypcie opisujemy protokół oceny stabilności przechowywania EV pochodzących z komórek ssaków, ważnej właściwości, która wciąż jest mało zbadana.
Dla klinicznego rozwoju pojazdów elektrycznych, nadal istnieje wiele przeszkód do pokonania16, w tym ocena ich efektów terapeutycznych, produkcja, oczyszczanie i przechowywanie17. Chociaż temperatura -80 °C jest powszechnie postrzegana jako złoty standard w przechowywaniu pojazdów elektrycznych18, wymagane zamrażarki są drogie, a utrzymanie wymaganego łańcucha chłodniczego od produkcji do pacjenta może być wyzwaniem. Co więcej, niektóre raporty wskazują, że przechowywanie w temperaturze -80 °C nadal nie pozwala optymalnie konserwować pojazdów elektrycznych i powoduje utratę funkcjonalności pojazdów elektrycznych19,20. Inne metody, takie jak liofilizacja21,22 lub suszenie rozpyłowe23, zostały zaproponowane jako potencjalne alternatywy dla przechowywania pojazdów elektrycznych w stanie surowym.
Optymalnym sposobem oceny stabilności przechowywania byłoby przetestowanie EV w testach funkcjonalnych lub poprzez ocenę konkretnego markera, na przykład ich aktywności przeciwbakteryjnej19. Jest to możliwe, gdy znany jest pożądany efekt pęcherzyków i gdy ma być badana jedna odrębna grupa EV. Jeśli EV z różnych źródeł komórkowych mają być porównywane (np. w celu kapsułkowania leków) lub jeśli nie jest znany odczyt funkcjonalny, nie jest już możliwa bezpośrednia ocena zmian spowodowanych przechowywaniem.
Z drugiej strony, prosta ocena zmian w ich parametrach fizykochemicznych, takich jak wielkość, odzysk cząstek i stężenie białka, nie zawsze przewiduje zmiany w aktywności EV, jak wykazano w niedawnym patencie20.
Tutaj udostępniamy łatwy do zastosowania protokół pomiaru stabilności przechowywania pojazdów elektrycznych, oceniając ich parametry fizykochemiczne w połączeniu z aktywnością kapsułkowanego enzymu beta-glukuronidazy jako substytutu ładunku pojazdów elektrycznych. Ładowanie enzymu odbywa się za pomocą inkubacji saponin, łagodnej metody opracowanej dla EV z różnych źródeł21,24,25. Saponina tworzy przejściowe pory w błonie EV, co umożliwia wychwyt enzymu do pęcherzyka. Ponieważ enzymy są podatne na utratę swojej aktywności, jeśli zostaną poddane niekorzystnym warunkom przechowywania, są idealnym substytutem do oceny zachowania funkcjonalnych ładunków pojazdów elektrycznych.
Wykazaliśmy, że zastosowanie tego protokołu do EV pochodzących z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i ludzkich komórek nabłonka gruczolakoraka pęcherzyków płucnych (A549) rzeczywiście powoduje duże różnice w stabilności przechowywania między różnymi liniami komórkowymi, co powinno być brane pod uwagę przy wyborze źródła EV21.

<table><tbody><tr><td>1,2 dimyrystoilo-sn glicero-3-fosfocholina (DMPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfo-cholina (DPPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&sup2; kolby do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>Używany z 25 ml pożywki</td></tr><tr><td>30 kDa membrana z regenerowanej celulozy</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 i mikro; m dystans</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny kolektor frakcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-glukuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher scientific</td><td>C/4966/17</td><td></td></tr><tr><td>Piec kolumnowy</td><td>Hitachi High-Technologies Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehaloza dwuwodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>- DAWN HELEOS II - Wielokątny detektor rozpraszania światła</td><td>&nbsp; Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy Durapore, PVDF,&nbsp; 0,1&nbsp; &mikro; m, 47&nbsp; mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td><td>Służy do przygotowania dla AF4</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3156</td><td>Podłoże podstawowe do wzrostu komórek śródbłonka, stosowane do hodowli komórek HUVEC bez surowicy</td></tr><tr><td>Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162</td><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka, stosowana do normalnej hodowli komórek HUVEC</td></tr><tr><td>Uszczelniacze płytkowe ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY992</td><td>służy do uszczelniania 96-dołkowych płytek do testu glukuronidazy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher scientific</td><td>E/0665DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wytłaczarki z uchwytem/blokiem grzewczym</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Wspornik filtra</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td><td>używany do otrzymywania liposomów</td></tr><tr><td>Di-&beta;-D-glukoronid</td> <td>fluoresceinyThermo Fisher Scientific</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS-tabletki+CA10:F36</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Universal 320 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Służy do peletek przy 300 g</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Służy do granulowania większych zanieczyszczeń przy 3000 g</td></tr><tr><td>ogniw HUVEC</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>Kimble&nbsp; FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator ALPHA 2-4</td><td></td> Probówki do mikrowirówek LSC Christ<td></td><td></td></tr><tr><td>, polipropylen</td><td>VWR international</td><td>525-0255</td><td>rurki używane do wszystkich pojazdów elektrycznych, uznane za korzystniejsze niż porównywalne produkty innych dostawców pod względem odzysku cząstek</td></tr><tr><td>Nanosight LM14 wyposażony w zielony laser</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Nanosight w wersji 3.1</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 200 nm membrany poliwęglanowe</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>110406</td><td>używane do przygotowania liposomów</td></tr><tr><td>PEEK Uchwyt filtra liniowego</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrat kwasu fosfowolframowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>Butelki poliwęglanowe do ultrawirowania</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy QuantiPro BCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowa mikroskopia elektronowa Zeiss EVO HD 15</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cl-2b</td><td>GE Healthcare</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>SEM miedź siatki z folią węglową</td><td>Plano</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>Mały kanał AF4</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Napylarka Q150R ES</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa JEOL JEM 2011</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówkowy typu 45 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Automatyczny podajnik próbek Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Pompa izokratyczna Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex odgazowywacz próżniowy online</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka OptimaTM L-90 K</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detektor UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 & mikro; m Filtr z mieszanej celulozy o wielkości porów</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>Służy do filtracji wszystkich stosowanych w pojazdach elektrycznych i w SEC</td></tr></tbody></table>

ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są obiecującymi celami w obecnych badaniach, mogą być używane jako leki, nośniki leków i biomarkery. Dla ich rozwoju klinicznego ważna jest nie tylko ich aktywność farmaceutyczna, ale także ocena potrzeb produkcyjnych. W tym kontekście badania koncentrują się na izolacji pojazdów elektrycznych, ich charakterystyce i przechowywaniu. Niniejszy manuskrypt ma na celu zapewnienie łatwej procedury oceny wpływu różnych warunków przechowywania na pojazdy elektryczne, bez manipulacji genetycznych lub specyficznych testów funkcjonalnych. Dzięki temu możliwe jest szybkie uzyskanie pierwszego wrażenia na temat stabilności pojazdów elektrycznych w danych warunkach przechowywania, a pojazdy elektryczne pochodzące z różnych źródeł ogniw można łatwo porównać. Pomiar stabilności opiera się na parametrach fizykochemicznych pojazdów elektrycznych (wielkość, stężenie cząstek i morfologia) oraz zachowaniu aktywności ich ładunku. To ostatnie ocenia się za pośrednictwem saponin, w której enzym beta-glukuronidaza jest wprowadzany do EV. Glukuronidaza działa jako substytut i pozwala na łatwą kwantyfikację poprzez rozszczepienie fluorescencyjnej cząsteczki reporterowej. Obecny protokół może być narzędziem dla naukowców poszukujących warunków przechowywania, które optymalnie zachowują właściwości EV, aby posunąć badania nad EV w kierunku zastosowań klinicznych.

Rysunek 1 przedstawia charakterystykę przechowywania EV wyizolowanych z HUVEC. EV wyizolowano metodą UC, enkapsulowano glukuronidazę, a następnie po SEC oczyszczone EV oceniono pod kątem właściwości fizykochemicznych za pomocą NTA. Próbkę pęcherzyków poddano następnie oczyszczaniu metodą AF4 i zmierzono aktywność glukuronidazy.
Pęcherzyki przechowywano następnie przez 7 d w temperaturze 4 °C lub -80 °C, a także w 4 °C w formie liofilizowanej, przy czym w tym ostatnim przypadku...

Tutaj prezentujemy łatwy do zastosowania protokół do oceny stabilności przechowywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, grupy naturalnie występujących nanocząsteczek wytwarzanych przez komórki. Pęcherzyki są obciążone glukuronidazą jako enzymem modelowym i przechowywane w różnych warunkach. Po przechowywaniu oceniane są ich parametry fizykochemiczne oraz aktywność kapsułkowanego enzymu.

Ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Stabilność magazynowania pęcherzyków pozakomórkowych jest ważnym parametrem dla ich potencjalnego zastosowania terapeutycznego. Nasz protokół zapewnia łatwe do zastosowania narzędzie do oceny, w jaki sposób przechowywanie wpływa na pęcherzyki. Główną zaletą naszej techniki jest to, że dzięki wprowadzeniu glukuronidazy jako markera egzogennego, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z różnych komórek rodzicielskich można łatwo porównać pod względem ich zdolności do przechowywania.Frakcjonowanie przepływu w asymetrycznym polu przepływu (AF4) jest łagodną alternatywą dla oczyszczania metodą chromatografii wykluczającej wielkość dla bardzo wrażliwych związków. Ponieważ związki napotykają mniej czystego naprężenia w kanale. Ponieważ glukuronidaza jest wrażliwym enzymem, jakość rezydowania zależy na dokładnym zaplanowaniu i przeprowadzeniu kolejnych etapów oczyszczania i analizy.Po wyhodowaniu linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania zgodnie ze standardowymi warunkami dla tych komórek, zastąp supernatant pożywką wolną od surowicy lub pożywką pozbawioną pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i zwróć komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe 24 do 72 godzin. Pod konie

evaluation-of-the-storage-stability-of-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.

Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytkowego w celu monitorowania ich migracji i pobierania w eksplantatach chrząstek, używanych jako model choroby zwyrodnieniowej stawów.

Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Przedstawiamy protokół izolacji i zamrażania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z nowotworowych komórek urotelialnych. Technika zamrażania i pękania ujawniła średnicę i kształt pojazdów elektrycznych oraz – jako unikalną cechę – wewnętrzną organizację membran pojazdów elektrycznych. Mają one ogromne znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób pojazdy elektryczne oddziałują z błonami biorczymi.

Mikroskopia elektronowa zamrażalno-pękająca do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Poznaj metodę oceny stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z użyciem glukuronidazy jako markera. Protokół wykorzystuje frakcjonowanie AF4 do porównania pęcherzyków z różnych komórek macierzystych.

Ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów