Name: Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich komórkach hematopoetycznych i białaczce MLL-AF9. Technika ta pozwala analizować homeostazę ROS i metabolizm komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Radę Dyrektorów Fox Chase Cancer Center (DDM), American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) oraz Departament Obrony (Award#: W81XWH-18-1-0472).

Wszystkie procedury opisane w tym protokole dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Fox Chase Cancer Center.
UWAGA: Przebieg pracy protokołu jest podzielony na 4 części, jak pokazano w Rysunek 1, a wymagane odczynniki są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja szpiku kostnego (BM)
UWAGA: Myszy z białaczką MLL-AF9 zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem11.
<ol>
	<li>Odzyskaj jednojądrzaste komórki szpiku kostnego, jak opisano wcześniej12,13,14,15, od myszy C57.Bl6 typu dzikiego (które wyrażają marker kongenny CD45.2), a także od myszy C57.Bl6-SJL (które wyrażają marker kongenny CD45.1), którym przeszczepiono komórki białaczkowe z ekspresją MLL-AF9 (CD45.2+). 
	nuta: BM można odzyskać od myszy przez crushing12,13 lub przez spłukiwanie bones14,15. W przedstawionych tutaj eksperymentach BM został odzyskany zarówno od myszy zdrowych, jak i myszy chorych na białaczkę poprzez zaczerwienienie.</li>
</ol>
2. Mitochondrialne barwienie barwnikiem fluorogennym ROS
<ol>
	<li>Po odzyskaniu jednojądrzastych komórek szpiku kostnego od zdrowych i/lub myszy chorych na białaczkę, należy wybarwić podwielokrotność komórek błękitem trypanowym i policzyć za pomocą hemocytometru w celu określenia początkowej liczby całkowitych komórek BM.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w F-PBS (PBS uzupełniony 2% płodową surowicą bydlęcą i 1% koktajlem penicyliny/streptomycyny) do stężenia 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Porcjować 200 μl zawiesiny komórek na probówkę do 9 jednokolorowych probówek kontrolnych oznaczonych w następujący sposób: 
	Bez barwienia, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (tylko dla zdrowych HSPC), CD45.2-APC (tylko dla komórek białaczkowych), CD34-FITC, mitochondrialny barwnik ROS i barwienie żywymi/martwymi komórkami. 
	UWAGA: (Opcjonalnie) Pozytywną kontrolę indukcji mitochondrialnych ROS można przygotować, traktując 2 x 105 komórek w 200 μl 20 μM wodorosiarczynu sodu menadionu (MSB) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Drugą kontrolę w celu odwrócenia indukcji mitochondrialnych ROS za pośrednictwem MSB można przygotować, traktując 2 x 105 komórek w 200 μl 20 μM MSB plus 100 μM N-acetylo-L-cysteiny (NAC) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Pozostałe komórki podzielić na porcje w probówce (probówce doświadczalnej) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić ogniwa w F-PBS z barwieniem żywych/martwych komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Pamiętaj, aby dodać żywą/martwą plamę do jednokolorowej probówki kontrolnej.</li>
	<li>Dodaj 1,0 ml f-pbs o temperaturze pokojowej (RT) F-PBS zarówno do probówek jednokolorowych, jak i eksperymentalnych barwionych żywym/martwym barwnikiem. Wirować 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić 50 μg mitochondrialnego barwnika ROS w 13 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), aby otrzymać 5 mM roztwór podstawowy.</li>
	<li>Rozcieńczyć mitochondrialny barwnik ROS do końcowego stężenia 5 μM w RT F-PBS z lub bez Werapamilu (50 μM).</li>
	<li>Odessać popłuczkę z plamy z żywych/martwych komórek. Dodaj 200 μl mitochondrialnego barwnika barwnikowego ROS zawierającego Werapamil do każdej probówki eksperymentalnej, a także jednokolorowej probówki kontrolnej mitochondrialnego barwnika ROS.</li>
	<li>Wirować do mieszania i inkubacji przez 10 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Dodaj 1,0 ml RT F-PBS do jednokolorowych probówek kontrolnych i eksperymentalnych barwionych mitochondrialnymi ROS. Wirować 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i przemyć komórki dodatkowym 1,0 ml RT F-PBS. Wirować 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciał rodowych
<ol>
	<li>Przygotować koktajle przeciwciał wymienione w tabeli 1. 
	nuta: Te koktajle przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane14,15,16.</li>
	<li>Odessać supernatant z końcowego mitochondrialnego płukania barwnikiem ROS z eksperymentalnych probówek zawierających zdrowy BM i dodać 200 μl koktajlu przeciwciał #1 do każdej probówki. Wirować do mieszania. Przygotuj również jednokolorowe probówki kontrolne. Inkubować przez 60 minut na lodzie w ciemności.</li>
	<li>Odessać supernatant z końcowego mitochondrialnego płukania barwnikiem ROS z eksperymentalnych probówek zawierających białaczkę BM i dodać 200 μl koktajlu przeciwciał #2 do każdej probówki. Wirować do mieszania. Inkubować przez 60 minut na lodzie w ciemności.</li>
	<li>Przemyć 1,0 ml zimnego F-PBS i odwirować 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl zimnego F-PBS i przefiltrować komórki w probówce cytometru przepływowego za pomocą filtra 40 μm w celu wykluczenia agregatów.</li>
</ol>
4. Akwizycja i analiza cytometrii przepływowej
UWAGA: Kilka podzbiorów krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych jest rzadkich, takich jak długoterminowe hematopoetyczne komórki macierzyste. W związku z tym idealnie byłoby, gdyby podczas akwizycji cytometrii przepływowej zebrano 3-5 milionów zdarzeń dla każdej probówki eksperymentalnej, aby uzyskać wystarczającą analizę mitochondrialnych ROS w różnych podzbiorach HSPC.
<ol>
	<li>Użyj rurki kontrolnej bez plam, aby ustawić wykresy punktowe do przodu (FSC-A) i z boku (SSC-A) w oparciu o rozmiar i złożoność analizowanej populacji komórek.</li>
	<li>Użyj bezplamnych i jednokolorowych probówek kontrolnych, aby skompensować cytometr przepływowy.</li>
	<li>Odsuń obce szczątki od przedniego i bocznego wykresu punktowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B, pierwszy panel od lewej).</li>
	<li>Bramki wyjściowe dublety za pomocą podwójnego dyskryminatora, takiego jak dyskryminator do przodu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B, drugi panel od lewej).</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze strategią bramkowania zaproponowaną na rysunku 2A, B, aby wybrać żywe komórki, niskie komórki linii i różne podzbiory HSPC i białaczki.</li>
	<li>Dla każdej populacji będącej przedmiotem zainteresowania przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji (MFI) kanału TRPE (oś x) na wykresie histogramu, aby ocenić różnice w mitochondrialnym sygnale ROS (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A-C, lewe panele). Poziomy mitochondrialnych ROS można ocenić na poziomie pojedynczej komórki, porównując barwienie mitochondrialnych ROS z określonymi markerami linii na wykresie punktowym.</li>
</ol>

<ol><li>Dröse, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li>
<li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li>
<li>Höhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Happily+%28n%29ever+after%3A+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress%2C+proteostasis+loss+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li>
<li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+inflammation%2C+and+cancer%3A+how+are+they+linked%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li>
<li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+cell+state+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).</li>
<li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li>
<li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li>
<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
<li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li>
<li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li>
<li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT%2FFOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776(2008).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li>
<li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Barwniki fluorogenne, które zostały opracowane do wykrywania ROS, są często oceniane w utrwalonych komórkach za pomocą mikroskopii lub w żywych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej22. Ocena cytometryczna mitochondrialnego ROS w komórkach BM przy użyciu mitochondrialnych barwników fluorogenicznych ROS ma dwie główne zalety: 1) jest to szybka i prosta technika, która nadaje się do analizy żywych komórek oraz 2) pozwala na rozróżnianie i analizowanie rzadkich populacji na poziomie pojedynczej ...

Reaktywne formy tlenu (ROS) są wysoce reaktywnymi cząsteczkami pochodzącymi z tlenu cząsteczkowego. Najbardziej dobrze zdefiniowaną lokalizacją komórkową produkcji ROS są mitochondria, w których elektrony przechodzące przez łańcuch transportu elektronów (ETC) podczas fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) są absorbowane przez tlen cząsteczkowy, co prowadzi do powstania określonego typu ROS zwanego ponadtlenkami1. Poprzez działanie szeregu enzymów, zwanych dysmutazami ponadtlenkowymi lub SOOD, ponadtlenki są przekształcane w nadtlenki wodoru, które są następnie neutralizowane do wody przez enzymy, takie jak katalaza lub peroksydazy glutationowe (GPX). Zaburzenia w mechanizmach regulacyjnych RFS mogą prowadzić do nadmiernej produkcji ROS, często określanej jako stres oksydacyjny, który ma szkodliwe i potencjalnie śmiertelne konsekwencje komórkowe, takie jak uszkodzenie makrocząsteczek (tj. DNA, białka, lipidów). Co więcej, stres oksydacyjny jest związany z kilkoma patologiami, takimi jak cukrzyca, choroby zapalne, starzenie się i nowotwory2,3,4. Aby utrzymać homeostazę redoks i zapobiec stresowi oksydacyjnemu, komórki posiadają różne mechanizmy regulujące ROS5.
Fizjologiczne poziomy niektórych ROS są niezbędne do prawidłowej hematopoezy embrionalnej i dorosłej6. Jednak nadmiar ROS jest związany z uszkodzeniem DNA, różnicowaniem komórkowym i wyczerpaniem puli krwiotwórczej pnia i progenitorów. Istnieją również dowody na to, że zmiany w biologii redoks mogą różnić się między białaczką a zdrowymi komórkami. Na przykład poziomy ROS są zwykle wyższe w komórkach ostrej białaczki szpikowej (AML) w porównaniu z ich zdrowymi odpowiednikami, a inne badania sugerują, że komórki macierzyste białaczki utrzymują niski poziom ROS w stanie stacjonarnym dla przeżycia7,8. Co ważne, strategie terapeutycznego wykorzystania tych różnic redoks okazały się obiecujące w kilku przypadkach raka u ludzi9,10. Dlatego testy, które pozwalają na ocenę poziomów ROS w modelach mysich, mogą poprawić nasze zrozumienie, w jaki sposób te gatunki przyczyniają się do fizjologii komórkowej i patogenezy choroby, a także potencjalnie stanowić platformę do oceny skuteczności nowatorskich terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na redoks.

<table><tbody><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td><td>97068-085</td><td>Nośnik</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>Podłoże</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>15 ml Probówka stożkowa</td><td>BD falcon</td><td>352096</td><td>Materiały do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa</td><td>BD falcon</td><td>352098</td><td>Tissue Materiały do hodowli</td></tr><tr><td>40 &mu; m Sitka komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Materiały do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-9751</td><td>Materiały do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Wodorosiarczyn sodu menadionu</td><td>Sigma aldrich</td><td>M5750</td><td>Pro-oksydant</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma aldrich</td><td>A7250</td><td>Przeciwutleniacz</td></tr><tr><td>CD3 PE-Cy5 klon 145-2c11</td><td>Biolegend</td><td>100310</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>Klon CD4 PE-Cy5 RM4-5</td><td>eBioscience</td><td>15-0041-81</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>CD8 PE-Cy5 klon 53-6.7</td><td>eBioscience</td><td>15-0081-81</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy5 6D5</td><td>Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>115510</td></tr><tr><td>B220 PE-Cy5 klon RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103210</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Gr1 PE-Cy5 klon RB6-8C5</td><td>Przeciwciało Biolegend</td><td>108410</td><td></td></tr><tr><td>Klon Ter119 PE-Cy5 Ter-119</td><td>Biolegend</td><td>116210</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>CD48 PE-Cy5 klon HM48-1</td><td>Biolegend</td><td>103420</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>CD117&nbsp; Klon APC-Cy7 2B8</td><td>Przeciwciało Biolegend</td><td>105825</td><td></td></tr><tr><td>Sca1 peacific Niebieski klon D7</td><td>Biolegend</td><td>108120</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>CD150 Klon APC TC15-12F12.2</td><td>Biolegend</td><td>115909</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>CD34 FITC Przeciwciało RAM34</td><td>BD Bioscience</td><td>553733</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2 Klon APC 104</td><td>Przeciwciało Biolegend</td><td>1098313</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Czerwony</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td>Barwnik</td></tr><tr><td>Mitotracker Zielony</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Barwnik</td></tr><tr><td>żywy/martwy Żółty barwnik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34967</td><td>Barwnik</td></tr></tbody></table>

analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez mll-af9

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Prezentujemy podejście cytometryczne do analizy mitochondrialnych ROS w różnych populacjach komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z żywego szpiku kostnego (BM) od zdrowych myszy, jak również myszy z AML napędzanym przez MLL-AF9. W szczególności opisujemy dwuetapowy proces barwienia komórek, w którym zdrowe lub białaczkowe komórki BM są najpierw barwione barwnikiem fluorogennym, który wykrywa nadtlenki mitochondrialne, a następnie barwione przeciwciałami monoklonalnymi związanymi z fluorochromem, które są używane do rozróżniania różnych zdrowych i złośliwych populacji progenitorów układu krwiotwórczego. Zapewniamy również strategię pozyskiwania i analizy próbek za pomocą cytometrii przepływowej. Cały protokół może zostać zrealizowany w czasie zaledwie 3-4 godzin. Podkreślamy również kluczowe zmienne, które należy wziąć pod uwagę, a także zalety i ograniczenia monitorowania produkcji ROS w przedziale mitochondrialnym żywych subpopulacji macierzystych i progenitorowych hematopoetycznych i białaczkowych przy użyciu barwników fluorogennych za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto przedstawiamy dane, że liczebność mitochondrialnych ROS różni się między odrębnymi zdrowymi subpopulacjami HSPC i prekursorami białaczki oraz omawiamy możliwe zastosowania tej techniki w badaniach hematologicznych.

Przedstawiono metodę analizy ROS w mitochondriach wielu zdrowych populacji prekursorów białaczki oraz populacji wykazujących ekspresję MLL-AF9. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przebieg procedury, która składa się z 4 głównych etapów: 1) izolacja szpiku kostnego z myszy; 2) barwienie komórek szpiku kostnego barwnikiem fluorogenicznym rozpoznającym mitochondrialne ROS, w szczególności ponadtlenki; 3) barwienie przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym w celu wyodrębnienia różnych zd...

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Reaktywne formy tlenu lub ROT to wysoce reaktywne formy tlenu, które są wytwarzane przez komórki i wpływają na ich zachowanie. Chociaż nadmiar ROS może również powodować rozległe spustoszenie w komórkach, a w ciężkich przypadkach śmierć komórki. Tak więc utrzymanie homeostazy ROS ma fundamentalne znaczenie dla funkcji i przeżycia komórek.Przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na pomiarze określonego rodzaju ROS, który jest generowany przez mitochondria, głównie jako produkt uboczny metabolizmu w żywych, normalnych lub zdrowych populacjach hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, a także w komórkach białaczkowych z mysiego modelu raka krwi, ostrej białaczki szpikowej lub AML. Protokół ten może być również wykorzystany do oceny, w jaki sposób manipulacje genetyczne, takie jak delecja lub nadekspresja genów, wpływają na mitochondrialne ROS w kilku zdrowych i złośliwych populacjach krwiotwórczych. W rezultacie, potencjalnie dostarczyć wnikliwych informacji na temat stanu redux i być może metabolizmu komórek.Technika ta upoważnia do analizy metrycznej osiadania przepływu sondy protogenicznej w celu monitorowania produkcji mitochondrialnych ROS w żywych, zdrowych i złośliwych subpopulacjach krwiotwórczych łodyg i progenitorów. Ten protokół jest prosty i można go ukończyć w ciągu kilku godzin. Ponadto nadaje się do analizy żywych komórek i pozwala na rozróżnianie i analizowanie mitochondrialnych ROS w populacji komórek macierzystych w szpiku kostnym, za pomocą powierzchniowego znacznika barwienia.Po zebraniu jednojądrzastych komórek szpiku kostnego od dzikich myszy ciasnych i myszy białaczkowych MLL-AF9, zgodnie z manuskryptem, podajcie 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej z dziewięciu pojedynczych probówek kontrolujących kolor. Pozostałe komórki podzielić na inne probówki eksperymentalne, każda po 200 mikrolitrów. Następnie umieścić w wirówce dwie probówki eksperymentalne zawierające odpowiednio komórki szpiku kostnego i komórki białaczkowe oraz jedną probówkę kontrolną.Wirować przy 300 razy G przez pięć minut. Następnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w temperaturze pokojowej F-PBS z barwieniem żywych/martwych komórek, zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować na lodzie przez 30 minut.Następnie dodaj 1 mililitr F-PBS o temperaturze pokojowej do trzech żywych/martwych barwionych probówek i jednej pojedynczej probówki kontrolującej kolor do mitochondrialnego barwienia barwnikiem ROS. Umieścić probówki w wirówce o temperaturze 300 razy G na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie uzyskaj 5-milimolowy mitochondrialny roztwór podstawowy barwnika ROS, ponownie zawieszając 50 mikrogramów mitochondrialnego barwnika ROS w 13 mikrolitrach DMSO.Następnie dodaj 13 mililitrów F-PBS o temperaturze pokojowej do 13-mikrolitrowego mitochondrialnego barwnika ROS, aby rozcieńczyć do końcowego stężenia pięciu mikromolowców. W razie potrzeby dodaj 13 mikrolitrów 50-milimolowego Verapamilu do roztworu, aby zahamować mitochondrialne pompy wypływu. Pobrać probówki z wirówki i odessać z popłuczyny z barwienia żywych/martwych komórek.Dodaj 200 mikrolitrów F-PBS do kontroli barwienia żywego/martwego i trzymaj ją w lodzie, aż będzie gotowa do rozpoczęcia analizy. Dodaj 200 mikrolitrów mitochondrialnego barwnika barwnikowego ROS zawierającego Werapamil do każdej probówki eksperymentalnej, a także probówki kontrolnej barwienia mitochondrialnego ROS. Wirować mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności.Następnie dodaj 1 mililitr F-PBS o temperaturze pokojowej do probówek kontrolnych i eksperymentalnych. Odwirować przez pięć minut w temperaturze 300 razy G w temperaturze pokojowej. Odessać supernatent i przemyć komórki dodatkowym jednym mililitrem F-PBS o temperaturze pokojowej.Wirować ponownie przez pięć minut w temperaturze 300 razy G, w temperaturze pokojowej. Najpierw przygotuj dwa koktajle przeciwciał dla zdrowych i białaczkowych komórek szpiku kostnego. Odessać supernatant z eksperymentalnej probówki zawierającej zdrowe komórki szpiku kostnego i dodać 200 mikrolitrów koktajlu przeciwciał numer jeden do probówki.Wirować do mieszania. Przygotuj również jednokolorowe probówki kontrolne, dodając 200 mikrolitrów F-PBS i jeden mikrolitr odpowiedniego przeciwciała. Inkubować przez 60 minut na lodzie w ciemności.Odessać supernatant z eksperymentalnej probówki zawierającej szpik kostny białaczki i dodać 200 mikrolitrów koktajlu przeciwciał numer dwa do probówki. Wirować do mieszania. Inkubować przez 60 minut na lodzie w ciemności.Następnie umyj wszystkie probówki 1 mililitrem zimnego F-PBS i odwiruj przez pięć minut w temperaturze 300 razy G w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś ogniwa w 500 mikrolitrach zimnego F-PBS. Przenieść zawiesinę komórek do każdej probówki cytometru przepływowego z filtrem 40 mikrometrów w celu wykluczenia agregatów.Najpierw włóż jedną rurkę do cytometrii przepływowej i rozpocznij akwizycję, aby skompensować maszynę do cytometrii przepływowej. Powtórz tę czynność dla innych probówek kontrolnych. Następnie przeczytaj eksperymentalne probówki, aby ustawić bramki.Aby przeanalizować rozmiar i złożoność populacji komórek, najpierw dla HSPC w dobrej kondycji ustaw populacje wykresów obszaru rozproszenia do przodu i obszaru rozproszonego z boku. Naciśnij przycisk Square Gate, aby usunąć obce zanieczyszczenia z przodu i bocznego wykresu punktowego. Następnie, na wykresie obszaru rozproszenia i wysokości do przodu, użyj podwójnego dyskryminatora, aby wyprowadzić dublety.Wybierz żywe komórki, niskie komórki pochodzenia i różne zdrowe HSPC. Dla każdej populacji będącej przedmiotem zainteresowania przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji kanału TRPE na wykresie histagramu, aby ocenić różnice w mitochondrialnym sygnale ROS. Powtórz tę samą procedurę analizy wielkości, bramkowania i wykreślania histogramu dla populacji białaczki.Komórki szpiku kostnego wyizolowane od zdrowych myszy wybarwiono żywym/martwym barwnikiem i mitochondrialnym barwnikiem ROS, a następnie wybarwiono przeciwciałami rozpoznającymi markery rodowe: plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 i CD150. Ponadto komórki szpiku kostnego myszy z białaczką były również barwione CD45.2 w celu odróżnienia komórek białaczkowych MLL-AF9 od zdrowych komórek szpiku kostnego biorcy wybarwionych CD45.1. Porównanie barwienia mitochondrialnego ROS między zdrowym CD48 ujemnym LSK a przodkami szpiku pokazuje, że przodkowie szpiku wykazują znacznie wyższy poziom barwienia mitochondriów ROS.Co więcej, prekursorzy wysokiej białaczki c-Kit wykazują znacznie wyższy poziom barwienia mitochondriów ROS w porównaniu z pośrednimi komórkami o niskiej białaczce c-Kit, zdrowymi CD48 ujemnymi LSK i przodkami szpiku. Pośrednie komórki białaczkowe C-Kit o niskiej białaczce również wykazywały znacznie wyższą wartość w porównaniu z komórkami LSK CD48 ujemnymi, ale nie z przodkami szpiku. Mitochondrialne barwniki ROS są wysoce reaktywne i potrzebne są odpowiednie etapy mycia, aby upewnić się, że nadmiar barwnika został usunięty przed rozpoczęciem kolejnych kroków.Istnieje kilka chemicznie odrębnych barwników fluorogenicznych ROS, które można zastosować w tym protokole, aby uzyskać trochę wiedzy na temat statusu redux w żywych komórkach krwiotwórczych. Technika ta jest szeroko stosowana w literaturze i może dostarczyć użytecznych informacji na temat szlaków metabolicznych i sygnałowych, które są różnie regulowane w komórkach białaczkowych w porównaniu z ich normalnymi odpowiednikami.

flow-cytometric-analysis-mitochondrial-reactive-oxygen-species-murine

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten manuskrypt zawiera procedurę techniczną, która może być użyta do scharakteryzowania hodowli komórek C1498 in vitro oraz ostrej białaczki wywołanej u myszy po ich wstrzyknięciu. Analizy fenotypowe i funkcjonalne wykonywane są za pomocą cytometrii przepływowej, mikroskopii immunofluorescencyjnej, cytochemii i barwienia Maya-Grünwalda Giemsy.

Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich komórkach hematopoetycznych i białaczce MLL-AF9. Technika ta pozwala analizować homeostazę ROS i metabolizm komórek.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9 (Wideo) | JoVE Journal

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Przeglądaj więcej filmów