Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9
5 września 2019
Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.
Reaktywne formy tlenu lub ROT to wysoce reaktywne formy tlenu, które są wytwarzane przez komórki i wpływają na ich zachowanie. Chociaż nadmiar ROS może również powodować rozległe spustoszenie w komórkach, a w ciężkich przypadkach śmierć komórki. Tak więc utrzymanie homeostazy ROS ma fundamentalne znaczenie dla funkcji i przeżycia komórek.
Przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na pomiarze określonego rodzaju ROS, który jest generowany przez mitochondria, głównie jako produkt uboczny metabolizmu w żywych, normalnych lub zdrowych populacjach hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, a także w komórkach białaczkowych z mysiego modelu raka krwi, ostrej białaczki szpikowej lub AML. Protokół ten może być również wykorzystany do oceny, w jaki sposób manipulacje genetyczne, takie jak delecja lub nadekspresja genów, wpływają na mitochondrialne ROS w kilku zdrowych i złośliwych populacjach krwiotwórczych. W rezultacie, potencjalnie dostarczyć wnikliwych informacji na temat stanu redux i być może metabolizmu komórek.
Technika ta upoważnia do analizy metrycznej osiadania przepływu sondy protogenicznej w celu monitorowania produkcji mitochondrialnych ROS w żywych, zdrowych i złośliwych subpopulacjach krwiotwórczych łodyg i progenitorów. Ten protokół jest prosty i można go ukończyć w ciągu kilku godzin. Ponadto nadaje się do analizy żywych komórek i pozwala na rozróżnianie i analizowanie mitochondrialnych ROS w populacji komórek macierzystych w szpiku kostnym, za pomocą powierzchniowego znacznika barwienia.
Po zebraniu jednojądrzastych komórek szpiku kostnego od dzikich myszy ciasnych i myszy białaczkowych MLL-AF9, zgodnie z manuskryptem, podajcie 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej z dziewięciu pojedynczych probówek kontrolujących kolor. Pozostałe komórki podzielić na inne probówki eksperymentalne, każda po 200 mikrolitrów. Następnie umieścić w wirówce dwie probówki eksperymentalne zawierające odpowiednio komórki szpiku kostnego i komórki białaczkowe oraz jedną probówkę kontrolną.
Wirować przy 300 razy G przez pięć minut. Następnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w temperaturze pokojowej F-PBS z barwieniem żywych/martwych komórek, zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
Następnie dodaj 1 mililitr F-PBS o temperaturze pokojowej do trzech żywych/martwych barwionych probówek i jednej pojedynczej probówki kontrolującej kolor do mitochondrialnego barwienia barwnikiem ROS. Umieścić probówki w wirówce o temperaturze 300 razy G na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie uzyskaj 5-milimolowy mitochondrialny roztwór podstawowy barwnika ROS, ponownie zawieszając 50 mikrogramów mitochondrialnego barwnika ROS w 13 mikrolitrach DMSO.
Następnie dodaj 13 mililitrów F-PBS o temperaturze pokojowej do 13-mikrolitrowego mitochondrialnego barwnika ROS, aby rozcieńczyć do końcowego stężenia pięciu mikromolowców. W razie potrzeby dodaj 13 mikrolitrów 50-milimolowego Verapamilu do roztworu, aby zahamować mitochondrialne pompy wypływu. Pobrać probówki z wirówki i odessać z popłuczyny z barwienia żywych/martwych komórek.
Dodaj 200 mikrolitrów F-PBS do kontroli barwienia żywego/martwego i trzymaj ją w lodzie, aż będzie gotowa do rozpoczęcia analizy. Dodaj 200 mikrolitrów mitochondrialnego barwnika barwnikowego ROS zawierającego Werapamil do każdej probówki eksperymentalnej, a także probówki kontrolnej barwienia mitochondrialnego ROS. Wirować mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności.
Następnie dodaj 1 mililitr F-PBS o temperaturze pokojowej do probówek kontrolnych i eksperymentalnych. Odwirować przez pięć minut w temperaturze 300 razy G w temperaturze pokojowej. Odessać supernatent i przemyć komórki dodatkowym jednym mililitrem F-PBS o temperaturze pokojowej.
Wirować ponownie przez pięć minut w temperaturze 300 razy G, w temperaturze pokojowej. Najpierw przygotuj dwa koktajle przeciwciał dla zdrowych i białaczkowych komórek szpiku kostnego. Odessać supernatant z eksperymentalnej probówki zawierającej zdrowe komórki szpiku kostnego i dodać 200 mikrolitrów koktajlu przeciwciał numer jeden do probówki.
Wirować do mieszania. Przygotuj również jednokolorowe probówki kontrolne, dodając 200 mikrolitrów F-PBS i jeden mikrolitr odpowiedniego przeciwciała. Inkubować przez 60 minut na lodzie w ciemności.
Odessać supernatant z eksperymentalnej probówki zawierającej szpik kostny białaczki i dodać 200 mikrolitrów koktajlu przeciwciał numer dwa do probówki. Wirować do mieszania. Inkubować przez 60 minut na lodzie w ciemności.
Następnie umyj wszystkie probówki 1 mililitrem zimnego F-PBS i odwiruj przez pięć minut w temperaturze 300 razy G w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś ogniwa w 500 mikrolitrach zimnego F-PBS. Przenieść zawiesinę komórek do każdej probówki cytometru przepływowego z filtrem 40 mikrometrów w celu wykluczenia agregatów.
Najpierw włóż jedną rurkę do cytometrii przepływowej i rozpocznij akwizycję, aby skompensować maszynę do cytometrii przepływowej. Powtórz tę czynność dla innych probówek kontrolnych. Następnie przeczytaj eksperymentalne probówki, aby ustawić bramki.
Aby przeanalizować rozmiar i złożoność populacji komórek, najpierw dla HSPC w dobrej kondycji ustaw populacje wykresów obszaru rozproszenia do przodu i obszaru rozproszonego z boku. Naciśnij przycisk Square Gate, aby usunąć obce zanieczyszczenia z przodu i bocznego wykresu punktowego. Następnie, na wykresie obszaru rozproszenia i wysokości do przodu, użyj podwójnego dyskryminatora, aby wyprowadzić dublety.
Wybierz żywe komórki, niskie komórki pochodzenia i różne zdrowe HSPC. Dla każdej populacji będącej przedmiotem zainteresowania przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji kanału TRPE na wykresie histagramu, aby ocenić różnice w mitochondrialnym sygnale ROS. Powtórz tę samą procedurę analizy wielkości, bramkowania i wykreślania histogramu dla populacji białaczki.
Komórki szpiku kostnego wyizolowane od zdrowych myszy wybarwiono żywym/martwym barwnikiem i mitochondrialnym barwnikiem ROS, a następnie wybarwiono przeciwciałami rozpoznającymi markery rodowe: plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 i CD150. Ponadto komórki szpiku kostnego myszy z białaczką były również barwione CD45.2 w celu odróżnienia komórek białaczkowych MLL-AF9 od zdrowych komórek szpiku kostnego biorcy wybarwionych CD45.1. Porównanie barwienia mitochondrialnego ROS między zdrowym CD48 ujemnym LSK a przodkami szpiku pokazuje, że przodkowie szpiku wykazują znacznie wyższy poziom barwienia mitochondriów ROS.
Co więcej, prekursorzy wysokiej białaczki c-Kit wykazują znacznie wyższy poziom barwienia mitochondriów ROS w porównaniu z pośrednimi komórkami o niskiej białaczce c-Kit, zdrowymi CD48 ujemnymi LSK i przodkami szpiku. Pośrednie komórki białaczkowe C-Kit o niskiej białaczce również wykazywały znacznie wyższą wartość w porównaniu z komórkami LSK CD48 ujemnymi, ale nie z przodkami szpiku. Mitochondrialne barwniki ROS są wysoce reaktywne i potrzebne są odpowiednie etapy mycia, aby upewnić się, że nadmiar barwnika został usunięty przed rozpoczęciem kolejnych kroków.
Istnieje kilka chemicznie odrębnych barwników fluorogenicznych ROS, które można zastosować w tym protokole, aby uzyskać trochę wiedzy na temat statusu redux w żywych komórkach krwiotwórczych. Technika ta jest szeroko stosowana w literaturze i może dostarczyć użytecznych informacji na temat szlaków metabolicznych i sygnałowych, które są różnie regulowane w komórkach białaczkowych w porównaniu z ich normalnymi odpowiednikami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPCs) oraz w komórkach białaczki. Głównym celem jest zrozumienie roli ROS w funkcjonowaniu i przeżywalności komórek, szczególnie w kontekście ostrej białaczki szpikowej (AML).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Onkologia
Wstęp
- Reaktywne formy tlenu (ROS) są wytwarzane przez komórki i wpływają na ich zachowanie.
- Nadmiar ROS może prowadzić do uszkodzeń i śmierci komórek.
- Utrzymanie homeostazy ROS jest kluczowe dla funkcjonowania komórek.
- Badanie koncentruje się na mitochondrialnych ROS generowanych w populacjach krwiotwórczych.
Cel badania
- Pomiar poziomu mitochondrialnych ROS w zdrowych komórkach oraz komórkach białaczkowych.
- Ocena wpływu manipulacji genetycznych na poziom mitochondrialnych ROS.
- Uzyskanie informacji na temat stanu redoks i metabolizmu komórek.
Zastosowane metody
- Wieloparametryczna cytometria przepływowa do detekcji ROS.
- Analiza zdrowych mysich HSPC oraz komórek białaczkowych.
- Ocena wpływu manipulacji genetycznych na poziom ROS.
- Wykorzystanie mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML).
Główne wyniki
- Skuteczna detekcja mitochondrialnych ROS zarówno w komórkach zdrowych, jak i białaczkowych.
- Wgląd w wpływ zmian genetycznych na poziomy ROS.
- Zrozumienie roli ROS w metabolizmie komórkowym.
- Potencjalne implikacje dla strategii terapeutycznych w AML.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia wiarygodny sposób badania mitochondrialnych ROS.
- Wyniki mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad metabolizmem komórkowym w białaczkach.
- Zrozumienie dynamiki ROS może prowadzić do opracowania lepszych podejść terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Monitorowanie mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych zapewnia ilościowy odczyt stanu redoks oraz aktywności metabolicznej komórek, które są krytycznymi parametrami w wczesnej walidacji celów i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w przypadku nowotworów hematologicznych. To podejście z wykorzystaniem cytometrii przepływowej umożliwia rozróżnienie poziomów ROS w różnych zdrowych i nowotworowych subpopulacjach, co wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w przedklinicznych procesach odkrywania leków. Kompatybilność tej metody z analizą żywych komórek oraz krótki czas realizacji ułatwiają jej integrację z potokami przesiewowymi i rozwojem testów w celu identyfikacji związków wiodących oraz budowania pewności prognostycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie poziomu mitochondrialnych ROS jako funkcjonalnego wskaźnika przeprogramowania metabolicznego w białkowych komórkach macierzystych i progenitorowych białaczki.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednie porównanie sygnalizacji ROS pomiędzy zdrowymi HSPC a progenitorami białaczki indukowanymi przez MLL-AF9, co pozwala na wyjaśnienie zmian metabolicznych związanych z chorobą.
- Wartość prognostyczna: Dostarcza ilościowych pomiarów mitochondrialnych ROS, które zwiększają pewność co do wyboru celu i pomagają w selekcji projektów w portfolio poprzez powiązanie stanu redox z kondycją komórek białaczkowych i szlakami przeżycia.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych i powtarzalnych odczytów mitochondrialnych ROS za pomocą cytometrii przepływowej, co umożliwia wiarygodny screening związków będących modulatorami funkcji mitochondriów w komórkach krwiotwórczych.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza danych o medianie intensywności fluorescencji z histogramów kanału TRPE, zapewniając skalowalną metrykę do analizy zależności dawka-odpowiedź oraz walidacji hitów w kampaniach odkrywania leków.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Ustanawia wielokrotnego użytku schemat pracy w cytometrii przepływowej do oceny mitochondrialnego stresu oksydacyjnego w różnych modelach przedklinicznych, wspierając spójność międzyprojektową w badaniach mechanistycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Pozwala uchwycić różnice w zawartości mitochondrialnych ROS pomiędzy zdrowymi podzbiorami HSPC a progenitorami białaczki, tworząc system zgodny z biomarkerami do badania patogenezy AML.
- Ciągłość translacyjna: Łączy metaboliczne spostrzeżenia z fazy odkrywczej z walidacją przedkliniczną, umożliwiając podłużny monitoring dynamiki ROS w odpowiedzi na perturbacje genetyczne lub farmakologiczne.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez identyfikację podatności zależnych od ROS w komórkach macierzystych białaczki, co zmniejsza niepewność mechanistyczną przed badaniami skuteczności in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, szczególnie w projektach skoncentrowanych na reprogramowaniu metabolicznym w nowotworach hematologicznych. Umożliwia ona wczesną redukcję ryzyka biologicznego poprzez dostarczenie odczytów funkcjonalnych, które uzupełniają dane z przesiewów genetycznych i fenotypowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez pomiar mitochondrialnych ROS jako efektora downstream sygnalizacji onkogennej w modelach białaczki indukowanej przez MLL-AF9.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych pomiarów mitochondrialnych ROS, które wspierają ocenę związków oraz modelowanie zależności struktura-aktywność w badaniach przesiewowych modulatorów metabolicznych.
- Analityka: Generuje wyniki mediany intensywności fluorescencji w formie histogramów, co pozwala na statystyczne porównanie poziomów ROS w różnych warunkach doświadczalnych i tłach genetycznych.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy metaboliczne obserwowane in vitro z przedklinicznymi modelami chorób poprzez spójną detekcję mitochondrialnych ROS w pierwotnych komórkach białaczki mysiej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako zestandaryzowana, modułowa platforma analityczna applicable do wielu celów hematopoetycznych i modeli chorób, co redukuje nadmiarowy rozwój testów w różnych obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez powiązanie produkcji mitochondrialnych ROS z tożsamością i stanem metabolicznym komórek macierzystych białaczki, co zmniejsza niejednoznaczność w mechanizmie celowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym procedurom barwienia, przemywania i bramowania, co umożliwia porównywalność danych między laboratoriami w projektach wieloośrodkowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania metabolicznie aktywnych subpopulacji białaczki, co pozwala na priorytetyzację celów o wysokim potencjale indeksu terapeutycznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację postępów z uwzględnieniem ryzyka poprzez dostarczenie biomarkerów mechanistycznych korelujących z kondycją komórek macierzystych białaczki, co usprawnia podejmowanie decyzji w optymalizacji wiodących związków.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w kompensacji cytometrii przepływowej, barwieniu żywych komórek oraz w doborze paneli markerów powierzchniowych komórek krwiotwórczych w celu dokładnego rozróżnienia subpopulacji.
- Zależne od dostępu do cytometrów przepływowych wyposażonych w odpowiednie lasery i filtry do wykrywania fluorogennych barwników ROS mitochondrialnych (np. kanał TRPE).
- Wymaga standaryzacji stężenia barwnika, czasu inkubacji oraz etapów płukania pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania zmienności w detekcji sygnału ROS.
- Należy uwzględnić reaktywność barwnika oraz aktywność pomp eflluksu, z opcjonalnym zastosowaniem inhibitorów, takich jak Verapamil, aby zapewnić specyficzną detekcję sygnału mitochondrialnego.
- Ograniczone do względnej kwantyfikacji ROS; oznaczenie stężeń bezwzględnych wymaga kalibracji za pomocą metod ortogonalnych, co należy uwzględnić podczas interpretacji danych porównawczych między badaniami.
