Wytwarzanie mikrogranulek alginianu wydzielających β amyloid do wykorzystania w modelowaniu choroby Alzheimera

Protokół ten wyjaśnia wytwarzanie mikrogranulek, które będą wykorzystywane do kontrolowania szybkości uwalniania i ilości amyloidu, który jest białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Mikrogranulki unieruchamiają komórki w odpowiednim biomateriale i chronią je przed otaczającym środowiskiem, a także umożliwiają wymianę produktów ubocznych i składników odżywczych z otaczającym je środowiskiem. Kapsułkowanie komórek przy użyciu tej techniki zapewnia ścisłą kontrolę wielkości mikrogranulek, a także liczby komórek, a robimy to poprzez dostosowywanie różnych parametrów produkcyjnych.

Tak więc zamknięcie komórek opisanych w tym protokole da nam bardziej chroniczne uwalnianie amyloidu do stosowania zarówno w systemach in vitro, jak i in vivo, a pomysł polega na tym, że pozwoli nam to lepiej zrozumieć mechanizmy choroby, a także pozwoli nam przetestować nowe metody leczenia. Metoda ta może być wykorzystana do sformułowania kontrolowanego systemu i zbadania uwalniania dowolnych biomolekuł dla wielu typów komórek, zarówno pojedynczo, jak i w połączeniu. Aby rozpocząć, wyjmij z inkubatora kolbę prawie zlewającą się.

Potraktuj komórki 0,25% roztworem trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 C przez pięć do 10 minut, aby odłączyć komórki. Po dodaniu pożywki DMEM/F12 zbierz komórki do 50-mililitrowej probówki. Odwirować komórki z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w buforowanym roztworze soli fizjologicznej HEPES, aby podwoić końcowe pożądane stężenie komórek. W 50-mililitrowej probówce wirówkowej wymieszaj tę zawiesinę komórek w stosunku jeden do jednego z 4% wagowym i objętościowym roztworem alginianu, aby uzyskać końcową zawiesinę zawierającą pożądane stężenie komórek w 2% wagowym i objętościowym roztworze alginianu. Aby ustawić parametry enkapsulacji, ustaw prędkość enkapsulatora na maksymalną prędkość wytłaczania, a następnie ustaw napięcie i częstotliwość.

Aby wytworzyć mikrogranulki, w strzykawce o pojemności 20 mililitrów załaduj pięć mililitrów zawiesiny alginianu komórkowego i podłącz strzykawkę do enkapsulatora. Aby uruchomić enkapsulator, aktywuj przepływ, który przepchnie zawiesinę alginianu komórkowego przez podajnik, a strumień kropelek zostanie wytłoczony przez dyszę. Zebrać pierwszy mililitr w zlewce na odpady, aby uniknąć początkowego niejednorodnego strumienia.

Następnie kontynuuj uruchamianie pozostałych czterech mililitrów, pozwalając, aby kropelki wpadły do kąpieli żelującej z chlorkiem wapnia. W kontakcie z kąpielą żelacyjną alginian w kropelkach natychmiast łączy się z jonami wapnia w kąpieli żelowej, tworząc kuliste mikrokulki. Po jednej minucie wyjmij zlewkę żelującą z platformy magnetycznej i pozwól mikrokulkom odpocząć przez kolejne cztery minuty bez mieszania, aby zakończyć żelowanie w temperaturze pokojowej.

Aby odzyskać mikrogranulki, najpierw użyj sterylnej pęsety, aby usunąć wszelkie duże resztki lub artefakty alginianowe. Po odcięciu końcówki plastikowej pipety należy jej użyć do przeniesienia mikrogranulek z kąpieli żelującej do filtra siatkowego o wielkości 74 mikrometrów umieszczonego nad zlewką na odpady. Aby zapewnić sukces, zawsze odcinamy końcówkę plastikowej pipety, aby uniknąć uszkodzenia mikrogranulek i robimy to za każdym razem, gdy przenosimy kulki z jednego naczynia do drugiego po enkapsulacji.

Odwróć filtr siatkowy nad probówką wirówkową. Odpipetować odpowiednią pożywkę hodowlaną, aby zmyć kulki w probówce i pozostawić je do zrównoważenia w tym pożywce przez pięć minut. Następnie przenieść je do kolby uprzednio wypełnionej odpowiednią pożywką do inkubacji i dalszych eksperymentów.

Aby ocenić żywotność komórek po enkapsulacji i hodowli, dodaj mieszaninę rozpuszczającą, aby delikatnie rozbić mikrogranulki i uwolnić zamknięte komórki. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych uzupełnionym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C przez 10 minut, delikatnie mieszając. Oszacuj żywotność tych komórek, barwiąc je błękitem trypanowym i używając komory hemocytometru.

Aby ocenić stabilność mikrogranulek, zmierz średnią średnicę próbki z każdej populacji mikrogranulek w czasie za pomocą mikroskopu i oprogramowania do obrazowania. Po przygotowaniu udało się wygenerować jednolite i kuliste mikrogranulki alginianowe przy użyciu tego protokołu. Po jednym dniu w standardowych warunkach hodowli komórkowej kapsułkowane komórki 7PA2 zostały równomiernie rozmieszczone w mikrogranulkach.

Kiedy proliferacja komórek 7PA2 została przetestowana za pomocą testu MTS, nie było znaczącej różnicy między zachowaniem komórek 7PA2 hodowanych z alginianem lub bez niego w okresie siedmiu dni. Kondycjonowane pożywki analizowane z kultur 2D i 3D komórek 7PA2 wykazały stały wzrost poziomów amyloidu-beta 1-42 w obu kulturach. Szybkość uwalniania beta-amyloidu 1-42 z mikrogranulek lub hodowli 3D jest podobna w profilu do tej uwalnianej z hodowli 2D.

Komórki 7PA2 zamknięte w mikrogranulkach alginianowych mogą być skutecznie wykorzystywane do przedłużonego uwalniania beta-amyloidu. Mikrogranulki do wszczepienia do mózgu szczura muszą być na tyle małe, aby można je było zagnieździć bez tworzenia dużej zmiany. Wszczepienie kulki o milimetrowej skali do mózgu w celach in vivo nie zadziała, podczas gdy mikrokulka wytworzona przy użyciu tego protokołu ma odpowiedni rozmiar do wprowadzenia do hipokampa szczura.

Aby upewnić się, że mamy równomierny rozkład komórek w produkcie końcowym, ważne jest, aby dokładnie wymieszać komórki w zawiesinie alginianu komórkowego, a to gwarantuje równomierne uwalnianie amyloidu z każdej mikrogranulki.