Name: Badanie zakażenia Cryptosporidium w 3D systemach hodowli organoidów ludzkich pochodzących z tkanek za pomocą mikroiniekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Poznaj metody mikroiniekcji i oczyszczania sporozoitów Cryptosporidium parvum w ludzkich organoidach jelitowych i oddechowych. Techniki te umożliwiają badanie interakcji patogen-gospodarz w modelach 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Deborah A. Schaefer ze Szkoły Nauk Biomedycznych i Porównawczych, Kolegium Rolnictwa i Nauk Przyrodniczych, University of Arizona, Tucson, AZ, USA za pomoc w produkcji i analizie oocyst. Dziękujemy również Franceschi Microscopy and Imaging Center oraz D.L. Mullendore z Washington State University za przygotowanie TEM i obrazowanie izolowanych oocyst organoidów.
D.D. jest odbiorcą grantu VENI od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. jest laureatem grantu VENI od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO-ALW, 863.14.002) i był wspierany przez stypendia Marie Curie od Komisji Europejskiej (Propozycja 330571 7 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach ERBN Advanced Grant Agreement nr 67013 oraz od NIH NIAIH w ramach R21 AT009174 do RMO. Praca ta jest częścią Instytutu Oncode, który jest częściowo finansowany przez Holenderskie Towarzystwo Onkologiczne i został sfinansowany z grantu Holenderskiego Towarzystwa Onkologicznego.

<ol><li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+global+burden%2C+novel+diagnostics%2C+therapeutics%2C+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li>
<li>Bones, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+and+future+trends+of+Cryptosporidium+in+vitro+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research.</a> Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).</li>
<li>Muller, J., Hemphill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+systems+for+the+study+of+apicomplexan+parasites+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals.</a> International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).</li>
<li>Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Cryptosporidium+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Cryptosporidium in vitro culture.</a> International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).</li>
<li>Morada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+culture+of+Cryptosporidium+parvum+using+hollow+fiber+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology.</a> International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).</li>
<li>DeCicco RePass, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li>
<li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li>
<li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+infections%3A+molecular+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li>
<li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li>
<li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cpgp40%2F15+in+Toxoplasma+gondii%3A+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li>
<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowla pasożytów Cryptosporidium w organoidach jelitowych i oddechowych stanowi dokładny model do badania interakcji gospodarz-pasożyt10 , ale ma również wiele innych zastosowań. Na przykład obecne metody selekcji i rozmnażania genetycznie zmodyfikowanych pasożytów Cryptosporidium wymagają przejścia u myszy19 , co nie pozwala na izolację pasożytów, które mają modyfikacje niezbędne do infekcji in vivo. Hodowla organoidów Cryptosporidium stanowi al...

Rozwój leków lub szczepionek do leczenia i zapobiegania zakażeniu Cryptosporidium został utrudniony przez brak systemów in vitro, które dokładnie naśladują sytuację in vivo u ludzi1,2. Wiele z obecnie dostępnych systemów pozwala tylko na krótkotrwałą infekcję (<5 dni) lub nie obsługuje pełnego cyklu życia pasożyta3,4. Inne systemy, które umożliwiają pełny rozwój pasożyta, opierają się na unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub liniach komórek nowotworowych, które nie oddają wiernie sytuacji fizjologicznej u ludzi5,6,7. Organoidy lub "mininarządy" to struktury 3D pochodzące z tkanki, które są hodowane w macierzy zewnątrzkomórkowej uzupełnionej różnymi specyficznymi dla tkanki czynnikami wzrostu. Organoidy zostały opracowane z różnych narządów i tkanek. Są one stabilne genetycznie i podsumowują większość funkcji narządów, z których pochodzą, i mogą być utrzymywane w kulturze przez dłuższy czas. Opracowaliśmy metodę infekowania organoidów jelitowych i płuc człowieka Cryptosporidium, która zapewnia dokładny model in vitro do badania interakcji gospodarz-pasożyt istotnych dla kryptosporydiozy jelitowej i oddechowej8,9,10,11,12,13. W przeciwieństwie do innych opublikowanych modeli hodowli, system organoidów jest reprezentatywny dla rzeczywistych interakcji pasożyta żywiciela, pozwala na zakończenie cyklu życiowego, dzięki czemu można badać wszystkie etapy cyklu życiowego pasożyta, i utrzymuje rozmnażanie pasożyta przez okres do 28 dni10.
Cryptosporidium parvum to pasożyt apicomplexanu, który infekuje nabłonek dróg oddechowych i jelitowych, powodując przedłużającą się biegunkę. Odpornym etapem środowiskowym jest oocysta, znajdująca się w skażonej żywności i wodzie14. Po spożyciu lub wdychaniu oocysta wydziela się i uwalnia cztery sporozoity, które przyczepiają się do komórek nabłonka. Sporozoity ślizgają się po komórkach gospodarza i angażują receptory komórek gospodarza, ale pasożyt nie atakuje w pełni komórki i wydaje się, że skłania komórkę gospodarza do jej pochłonięcia15. Pasożyt, który jest internalizowany w wewnątrzkomórkowym, ale pozacytoplazmatycznym kompartmencie, pozostaje na wierzchołkowej powierzchni komórki, replikując się w parazytoforycznej wakuoli. Przechodzi dwie rundy rozmnażania bezpłciowego - proces zwany merogonią. Podczas merogonii rozwijają się meronty typu I, które zawierają osiem merozoitów, które są uwalniane w celu inwazji na nowe komórki. Te merozoity atakują nowe komórki, aby przekształcić się w meronty typu II zawierające cztery merozoity. Te merozoity po uwolnieniu infekują komórki i przekształcają się w makrogamonty i mikrogamonty. Uwalniane są mikrogamety, które zapładniają makrogamety, wytwarzając zygoty, które dojrzewają do oocyst. Dojrzałe oocysty są następnie uwalniane do światła. Oocysty są albo cienkościenne, które natychmiast ekscytują, aby ponownie zainfekować nabłonek, albo grubościenne, które są uwalniane do środowiska, aby zainfekować następnego hosta14. Wszystkie etapy cyklu życiowego Cryptosporidium zostały zidentyfikowane w systemie hodowli organoidów opracowanym wcześniej przez naszą grupę10.
Ponieważ ludzkie organoidy wiernie odwzorowują ludzkie tkanki9,11,13, i wspierają wszystkie etapy replikacji Cryptosporidium10, są idealnym systemem hodowli tkankowej do badania biologii Cryptosporidium i interakcji gospodarz-pasożyt. W tym miejscu opisujemy procedury infekowania organoidów zarówno oocystami Cryptosporidium, jak i wycyzowanymi sporozoitami oraz izolowania nowych oocyst wytwarzanych w tym systemie hodowli tkankowej.

<table><tbody><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej (macierz zewnątrzkomórkowa)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Przeciwciało Crypt-a-Glo (przeciwciało specyficzne dla oocysty)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>Stężenie końcowe = Użyj 2-3 kropli/slajd</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne pokryte Crypto-Grab IgM</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stojak Dynamag 15</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stojak Dynamag 2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp; Filtry membranowe z poliwęglanu izoporowego - 3 i mikro; m</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szybki zielony barwnik</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz Femtojet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapilary szklane o średnicy 1 mm</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel (macierz zewnątrzkomórkowa)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówka do mikrofuge 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet P-97</td><td>Przyrząd do przesłony</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hikloryt sodu (stosować 5%)</td><td>Clorox</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie Super Stick</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm Uchwyt filtra z poliwęglanu</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas taurocholowy sól sodowa hydrat</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Środek montażowy Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Przemysł naukowy, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>Ilość końcowa</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml bulionu w 500 ml DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 ml bulionu w 500 ml DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5 ml bulionu w 500 ml DMEM</td></tr><tr><td><silny> ORGANOID JELITOWY MEDIA-OME (Pożywka ekspandująca)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0,5 &mikro; M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>uzupełnić do 100 ml</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>karta sieciowa</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>W domu*</td><td>&nbsp;</td><td>10%</td></tr><tr><td>Inhibitor P38 (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &mikro; M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL</td></tr><tr><td>Media RSpoI CM</td><td>W domu*</td><td>&nbsp;</td><td>20%</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>W domu*</td><td>&nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>Na miejscu* - linie komórkowe zostaną dostarczone na życzenie</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>INTESTINGENAL ORGANOID MEDIA-OMD (Pożywka różnicująca)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Aby rozróżnić organoidy, ekspandujące organoidy jelita cienkiego hodowano w pożywce bogatej w Wnt przez sześć do siedmiu dni po rozszczepieniu, a następnie hodowano w pożywce różnicującej (wycofanie Wnt, nikotynamidu SB202190, w pożywce różnicującej (wycofanie Wnt, nikotynamidu SB202190, prostaglandyny E2 z pożywki bogatej w Wnt lub OME)</td></tr><tr><td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Pożywka różnicująca)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>uzupełnić do 100 ml</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0,0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express Skontaktuj</td><td>się bezpośrednio z firmą</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &mikro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2,5 i mikro; m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express Skontaktuj</td><td>się bezpośrednio z firmą</td><td>10%</td></tr><tr><td><silny>bufor redukujący (do ponownego zawieszania oocyst i sporozoitów do wstrzykiwań)</silny></td><td><silny>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>L-Glutation zredukowany</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L of OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td>0,5 &MU; g/&mu; L of OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>168149-2.5G</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L kwasu linolowego OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6,8 &mu; g / ml OME / OMD / LOM</td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T0625-10MG</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L buforu blokującego OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td> (do barwienia immunofluorescencyjnego)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Surowica dla osła/kozy</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>70011044</td><td>Uzupełnij do 100 ml</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0,1</td></tr><tr><td>%Lista stosowanych przeciwciał </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Alexa 568 kozia anty-królik</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Rozcieńczenie-1:500; RRID: AB_143157</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Przeciwciało znakowane fluoresceiną Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLK</td><td>Rozcieńczenie- 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS Beads- Kulki magnetyczne pokryte reaktywnym przeciwciałem monoklonalnym</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>Rozcieńczenie-1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Rozcieńczenie-1:1,000; RRID : AB_2629482</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Rozcieńczenie-1:1,000; RRID: AB_2620155</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-gp15 wytwarzane przez R. M. O' Connor (współautor).</td><td>Na życzenie</td><td>Na żądanie</td><td>Rozcieńczenie-1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>Rozcieńczenie- 1:200</td></tr></tbody></table>

badanie zakażenia cryptosporidium w 3d systemach hodowli organoidów ludzkich pochodzących z tkanek za pomocą mikroiniekcji

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum jest jedną z głównych przyczyn biegunki u ludzi. Aby zrozumieć patologię pasożyta i opracować skuteczne leki, potrzebny jest system hodowli in vitro, który podsumowuje warunki panujące w żywicielu. Organoidy, które bardzo przypominają tkanki, z których pochodzą, są idealne do badania interakcji gospodarz-pasożyt. Organoidy to trójwymiarowe (3D) struktury tkankowe, które pochodzą z dorosłych komórek macierzystych i rosną w hodowli przez dłuższy czas bez poddawania się aberracji genetycznej lub transformacji. Mają dobrze zdefiniowaną polaryzację zarówno z powierzchniami wierzchołkowymi, jak i podstawnymi. Organoidy mają różne zastosowania w testowaniu leków, bankowaniu biologicznym oraz modelowaniu chorób i badaniach interakcji gospodarz-mikroorganizm. Tutaj przedstawiamy krok po kroku protokół, jak przygotować oocysty i sporozoity Cryptosporidium do infekowania organoidów jelitowych i oddechowych człowieka. Następnie pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać mikroiniekcje do wstrzykiwania drobnoustrojów do światła organoidu. Istnieją trzy główne metody, za pomocą których organoidy mogą być wykorzystywane do badań interakcji gospodarz-mikroorganizm - mikroiniekcja, mechaniczne ścinanie i powlekanie oraz tworzenie monowarstw. Mikroiniekcja umożliwia utrzymanie struktury 3D i pozwala na precyzyjną kontrolę objętości pasożytów oraz bezpośredni kontakt boczny wierzchołkowy dla drobnoustrojów. Dostarczamy szczegółów dotyczących optymalnego wzrostu organoidów do obrazowania lub produkcji oocyst. Na koniec pokazujemy również, w jaki sposób nowo wygenerowane oocysty można wyizolować z organoidu w celu dalszego przetwarzania i analizy.

Przedstawione tutaj protokoły pozwalają na wydajne oczyszczanie oocyst i sporozoitów (Rysunek 1A), przygotowując je do mikroiniekcji. Protokół ekscystacji prowadzi do uwolnienia sporozoitów z około 70–80% oocyst, dlatego niezbędne jest odfiltrowanie pozostałych oocyst i otoczek przez filtr 3 µm. Filtracja pozwala na niemal 10% oczyszczenie sporozoitów (Rysunek 1B). Ponadto dodanie zielonego barwnika pomaga zapewnić iniekcję wszystkich organoidów i umożliwia ich ...

Opisujemy protokoły przygotowania oocyst i oczyszczania sporozoitów do badania infekcji organoidów ludzkich jelit i dróg oddechowych przez Cryptosporidium parvum. Przedstawiono procedury mikroiniekcji pasożytów do światła organoidów jelitowych oraz barwienia immunologicznego organoidów. Na koniec opisujemy izolację wygenerowanych oocyst od organoidów.

Badanie zakażenia Cryptosporidium w 3D systemach hodowli organoidów ludzkich pochodzących z tkanek za pomocą mikroiniekcji

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Korzystając z tej procedury oczyszczania sporozoitu i mikroiniekcji, zasadniczo każdy mikrob gospodarza może być badany w dowolnym układzie narządów pochodzącym z tkanki. Za pomocą tej techniki możemy kontrolować ilość czystych sporozoitów wstrzykiwanych do światła organoidu lub wierzchołkowej strony organoidu. Aby oczyścić sporozoity C.parvum, przenieś oocystę do 15-mililitrowej probówki i ponownie zawieś komórki w stężeniu od jednego do 10 do siódmego oocysty na mililitr pożywki.Po 60 do 90 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza wymieszaj 14 mililitrów odpowiedniego roztworu do płukania z oocystami i osadnij komórki przez odwirowanie. Ostrożnie odessać supernatant, aby uniknąć utraty oocyst i ponownie zawiesić sporozoiczny osad w trzykrotnym stężeniu od 10 do siódmego oocysty na jeden do dwóch mililitrów stężenia DMEM. Aby usunąć wszelkie pozostałe oocysty i muszle, umieść 10-mililitrową strzykawkę wyposażoną w 47-mililitrowy uchwyt filtracyjny wyposażony w trzymikrometrowy filtr poliwęglanowy w 15-mililitrowej probówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza.Dodaj 7,5 mililitra zawiesiny sporozoitu do zespołu filtra. Gdy cała objętość przejdzie przez sitko grawitacyjnie, przemyj przez nie wszelkie pozostałe komórki kolejnymi 7,5 mililitrami DMEM. Gdy cały popłuczyn przejdzie przez sitko, zebrać przefiltrowaną zawiesinę sporozoitu przez wirowanie przez 10 minut i oznaczyć osad w 50 do 100 mikrolitrach odpowiedniego podłoża do hodowli organoidów, uzupełnionego 0,05% szybkim zielonym barwnikiem i buforem redukującym zawierającym L-glutation, betainę, L-cysteinę, kwas linolowy i taurynę.Aby wprowadzić pasożyty do wierzchołkowej strony organoidu 3D, należy najpierw użyć ściągacza do mikropipet w celu przygotowania szklanych kapilar iniekcyjnych. Użyj kleszczyków, aby przyciąć końcówkę kapilary do średnicy od dziewięciu do 12 mikrometrów, aby umożliwić łatwy przepływ sporozoitów lub oocyst, jeśli zdecydujesz się na bezpośrednie wstrzykiwanie oocyst, i użyj końcówek mikroładowacza, aby wypełnić każdą kapilarę szybką zieloną zawiesiną oocysty lub sporozoitu oznaczoną zielonym barwnikiem. Następnie załaduj pierwszą kapilę wypełnioną sporozoitem do mikrowstrzykiwacza i użyj odwróconego mikroskopu przy 5-krotnym powiększeniu i stałym ciśnieniu, aby wprowadzić mikroiniekcję od 100 do 200 nanolitrów zawiesiny do każdego organoidu.Protokół ekscystacji powoduje uwolnienie sporozoitów z około 70 do 80% oocyst. Dlatego ważne jest, aby odfiltrować pozostałe otoczki oocyst przez filtrację trzymikrometrową. Usuń prawie 100% nieusuniętych oocyst.Co więcej, dodatek zielonego barwnika pomaga zapewnić wstrzyknięcie wszystkich organoidów i umożliwia wizualizację wstrzykniętych organoidów przez co najmniej 24 godziny po wstrzyknięciu. Chociaż jest to dobrze praktykowana metoda, skaningowa mikroskopia elektronowa może być stosowana w celu upewnienia się, że proces ekscystacji nie uszkodził sporozoitów ani oocyst. Wstrzyknięcie równych ilości oocyst do światła organoidu można wizualnie potwierdzić za pomocą prostego obrazowania mikroskopowego.Testy immunofluorescencyjne mogą być również wykorzystywane do badania typów komórek zakażonych przez Cryptosporidium. Po zakażeniu zróżnicowanych organoidów przez pięć dni, obecność sporozoitów w oocystach można potwierdzić poprzez wysuszenie części oocyst na szkiełku adhezyjnym, utrwalenie oocyst metanolem i połączenie barwienia DAPI z odpowiednim przeciwciałem specyficznym dla oocysty. Aby uzyskać maksymalne rezultaty, należy stosować świeże oocysty, używać tej samej kapilary do wszystkich wstrzyknięć i zmieniać podłoże codziennie po wstrzyknięciu.Korzystając z tej techniki, różne laboratoria zaczynają teraz używać organoidów do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm. Badamy komensale, a także inne patogeny w podobnych warunkach mikrokultur organoidowych. Ponieważ Cryptosporidium jest pasożytem ludzkim, ważne jest, aby przeprowadzać te eksperymenty zgodnie z przepisami bezpieczeństwa poziomu 2.

studying-cryptosporidium-infection-3d-tissue-derived-human-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy metodę in vitro do oczyszczania sporozoitów z grubościennych oocyst patogennego pasożyta Cryptosporidium parvum. Wyizolowane sporozoity mogą być wykorzystane do badań nad infekcjami.

Izolacja sporozoitu in vitro z oocyst Cryptosporidium parvum

Ten film demonstruje technikę mikroiniekcji w celu opracowania modelu infekcji organoidów jelitowych u ludzi. Zakaźne stadium sporozoitowe pasożyta Cryptosporidium parvum jest mikrowstrzykiwane do światła organoidu. Po inwazji na komórki nabłonkowe organoidu przechodzi rozmnażanie bezpłciowe i płciowe, aby zakończyć swój cykl życiowy i rozprzestrzeniać infekcję.

Technika rozwoju infekcji pasożytniczej w organoidach jelitowych za pomocą mikroiniekcji

Ten protokół wyjaśnia pierwotną hodowlę organoidów z dodatnim Lgr5 i późniejszą transdukcję retrowirusową. Umożliwia to indukowaną przez Cre nadekspresję lub knockdown dostarczonego transgenu i umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w nowym systemie modeli organotypowych in vitro.

Protokół wideo infekcji retrowirusowej w pierwotnej hodowli organoidów jelitowych

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Kultury pochodzące z komórek macierzystych kryją w sobie ogromny potencjał do modelowania chorób zakaźnych. W tym miejscu opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy są mikrowstrzykiwane z patogenem żołądkowym Helicobacter pylori.

Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Organoidy jelitowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) oferują ekscytujące możliwości modelowania chorób jelitowych in vitro. Wykazano różnicowanie hiPSC w organoidy jelitowe (iHO), stymulację tych iHO cytokinami oraz mikroiniekcję Salmonella Typhimurium do światła iHO, umożliwiając badanie inwazji nabłonka przez ten patogen.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Poznaj metody mikroiniekcji i oczyszczania sporozoitów Cryptosporidium parvum w ludzkich organoidach jelitowych i oddechowych. Techniki te umożliwiają badanie interakcji patogen-gospodarz w modelach 3D.

Badanie zakażenia Cryptosporidium w 3D systemach hodowli organoidów ludzkich pochodzących z tkanek za pomocą mikroiniekcji

Przeglądaj więcej filmów