Name: Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę SEC-MALS do charakteryzacji białek i kompleksów w roztworze. Ta technika umożliwia bezwzględne oznaczanie masy cząsteczkowej i rozmiaru makrocząsteczek bez konieczności stosowania standardów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied Structural Biology, Hebrew University) za rady i współpracę. Dziękujemy również firmie Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Izrael) za pomoc i stworzenie analitycznego systemu FPLC-MALS wykorzystanego w tym badaniu.

1. Przygotowanie systemu
<ol>
	<li>Podłącz detektory MALS i dRI za detektorem UV FPLC. Pomiń detektory pH i przewodności, ponieważ dodadzą one znaczną objętość między detektorami UV i MALS. Użyć rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,25 mm od kolumny do detektorów i między nimi oraz rurki kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,75 mm na wyjściu detektorów do kolektora odpadów lub frakcji.</li>
	<li>Upewnij się, że zostały ustanowione niezbędne połączenia sygnałowe między FPLC a detektorami, w tym wyjście analogowe z detektora UV do wejścia analogowego MALS oraz wyjście cyfrowe z FPLC do automatycznego wstrzykiwania MALS za pośrednictwem skrzynki I/O FPLC.</li>
	<li>Zainstalować odpowiednią kolumnę analityczną SEC obejmującą zakres frakcjonowania od co najmniej 20 kDa do 500 kDa. Sprawdź informacje o produkcie, aby określić, czy kolumna jest odpowiednia dla zakresu MW, pH i innych właściwości próbki i fazy ruchomej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bufora, płukanie systemu przez noc i sprawdzenie czystości
<ol>
	<li>Używając odczynników klasy HPLC, przygotuj 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 50 - 100 mM NaCl. Przefiltrować bufor do 0,1 μm za pomocą filtra polieterowo-sulfonowego lub podobnego filtra w butelce. Przefiltruj pierwsze 50-100 ml buforu do butelki na odpady i wyrzuć, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów, a następnie przefiltruj resztę do czystej, sterylnej butelki, która została dokładnie umyta przefiltrowaną, zdejonizowaną wodą i zakryta, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu. 
	UWAGA: Inne rozpuszczalniki fazy ruchomej, takie jak bufor Tris, mogą być stosowane, jeśli mają być analizowane dodatkowe białka, które są preferencyjnie rozpuszczone w tych rozpuszczalnikach.</li>
	<li>Przepłukiwać przez noc z natężeniem przepływu 0,5 ml/min lub w inny sposób zalecany przez producenta kolumny, aby zrównoważyć kolumnę w buforze i usunąć cząstki stałe. Użyj trybu ciągłego przepływu FPLC i upewnij się, że przepływ nie zatrzyma się, dopóki wszystkie przebiegi SEC-MALS nie zostaną zakończone.
	<ol>
		<li>Umieść celę przepływową dRI w trybie przedmuchiwania podczas płukania przez noc. Wyłącz przedmuchiwanie przed rozpoczęciem próbnych przebiegów.</li>
		<li>Rozpoczynając płukanie, stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, aby zapobiec efektowi "zrzucania kolumny" (lub uwalnianiu cząstek) spowodowanemu nagłą zmianą ciśnienia w kolumnie.</li>
		<li>Jeśli wiadomo, że system jest dość stabilny i wolny od cząstek stałych oraz znajduje się w równowadze z pożądaną fazą ruchomą, należy wymienić spłukiwanie nocne na krótsze, trwające 2-3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź czystość systemu, lekko stukając w rurkę za kolumną, aby uwolnić nagromadzone cząstki i obserwując sygnał w detektorze 90° na wyświetlaczu na panelu przednim przyrządu MALS. Sprawdź, czy szum międzyszczytowy nie przekracza 50 -100 μV.</li>
	<li>Wykonać "ślepą" próbę wstrzyknięcia, aby sprawdzić, czy wtryskiwacz jest oczyszczony z cząstek stałych. "Ślepa próba" to po prostu bufor do biegania, przygotowany w świeżej, sterylnej fiolce.
	<ol>
		<li>Jeśli pik cząstek nie przekracza objętości 1 ml i nie przekracza 5 mV powyżej linii podstawowej, oznacza to, że system jest gotowy do pobrania próbek. W przeciwnym razie wykonaj dodatkowe ślepe wstrzyknięcia, aż do wyczyszczenia, lub przeprowadź konserwację w celu wyczyszczenia wtryskiwacza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie i załadunek próbki
<ol>
	<li>Przygotować co najmniej 200 μl BSA w stężeniu 1-2 mg/ml w buforze SEC. 
	UWAGA: Aby zapobiec wytrącaniu się osadów, BSA nigdy nie należy rozpuszczać w czystej wodzie.</li>
	<li>Przefiltruj białko do 0,02 μm za pomocą filtra z końcówką strzykawki.</li>
	<li>Wyrzuć kilka pierwszych kropli filtratu, aby wyeliminować cząstki z suchych filtrów.</li>
	<li>Alternatywnie, należy odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 15 minut, aby umożliwić wytrącanie nierozpuszczalnych agregatów i innych dużych cząstek.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl roztworu BSA do pętli. 
	UWAGA: Jest to zalecana ilość materiału i może być wstrzykiwana mniej więcej w zależności od okoliczności próbki, takich jak stabilność lub dostępność. Ilość białka wymagana na wstrzyknięcie zmienia się odwrotnie proporcjonalnie do masy cząsteczkowej - dwa razy więcej masy białka jest potrzebne, jeśli masa cząsteczkowa wynosi 33 kDa, czyli o połowę mniejsza niż BSA.</li>
</ol>
4. Przygotowanie oprogramowania MALS
<ol>
	<li>Otwórz nowy | Eksperymentuj z metody w menu oprogramowania MALS i wybierz metodę online z folderu metod systemu rozpraszania światła. Jeśli detektor DLS jest obecny, wybierz metodę Online z menu Rozpraszanie światła | Z folderem QELS.</li>
	<li>W sekcji Konfiguracja ustaw parametry próbki i fazy ruchomej.
	<ol>
		<li>W widoku Pompa ogólna ustaw natężenie przepływu na używane w FPLC.</li>
		<li>W widoku Pompa ogólna, w polu Solvent branch, Name (Nazwa) wybierz PBS.</li>
		<li>W widoku Wtryskiwacz, gałąź Próbka, wprowadź nazwę jako BSA i ustaw dn/dc = 0,185 (standardowa wartość dla niezmodyfikowanych białek), A2 = 0 i współczynnik ekstynkcji UV = 0,667 ml / (mg-cm). 
		UWAGA: W przypadku innych białek współczynnik ekstynkcji UV280 nm można znaleźć w literaturze lub obliczyć na podstawie jego sekwencji przy użyciu różnych narzędzi oprogramowania z domeny publicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W sekcji Procedury, w widoku Kolekcja podstawowa, zaznacz pole wyboru Wyzwalaj przy automatycznym wstrzykiwaniu i ustaw czas trwania przebiegu na 70 minut, aby dane były zbierane dla całej elucji, aż do osiągnięcia całkowitej objętości przenikania kolumny SEC. 
	UWAGA: Niezbędny czas może się różnić w zależności od kolumny i natężenia przepływu - w przypadku standardowej kolumny HPLC-SEC o wymiarach 7,8 mm x 300 mm przy 0,5 ml/min wymagane jest 35 minut zbierania.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk Uruchom. Odczyt danych rozpocznie się po odebraniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS.</li>
	<li>Wyzeruj sygnał dRI, klikając przycisk Autozero na panelu przednim przyrządu.</li>
</ol>
5. Przygotowanie oprogramowania FPLC
<ol>
	<li>Wstaw nazwę białka i przebieg w oprogramowaniu FPLC, w Podręczniku | Wykonywanie instrukcji ręcznych | Ustaw znak.</li>
	<li>Przełącz zawór wtryskowy z obciążenia ręcznego na Wtrysk w ścieżce przepływu | Zawór wtryskowy.</li>
	<li>Dołączanie sygnału impulsowego poprzez włożenie impulsu 0,5 s pod skrzynkę we/wy | Wyjście cyfrowe impulsu. Spowoduje to rozpoczęcie zbierania danych w oprogramowaniu MALS.</li>
</ol>
6. Wstrzyknij próbkę do pętli. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj) w oprogramowaniu FPLC, aby rozpocząć przebieg eksperymentu.
7.Analiza danych SEC-MALS BSA
<ol>
	<li>Wykonaj analizę krok po kroku w sekcji Procedury w oprogramowaniu MALS.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy piki pojawiają się w przybliżeniu przy tej samej objętości elucji w UV, MALS i RI, sprawdzając widok Kolekcja podstawowa.</li>
		<li>W widoku Linia bazowa zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów (wszystkie detektory LS, UV i dRI). Linie podstawowe powinny być zdefiniowane w taki sposób, aby wskazywały poziom czystego rozpuszczalnika, najlepiej rozciągając się z jednej strony pików próbki na drugą.</li>
		<li>W widoku Szczyty zdefiniuj szczyty, które mają być analizowane, klikając i przeciągając myszą. Wybierz środkowe 50% każdego szczytu. Najpierw wybierz pik monomeru ("Szczyt 1"), a następnie pik dimera ("Szczyt 2"). Sprawdź poprawność wartości dn/dc = 0,185 i współczynnik ekstynkcji UV 280 nm = 0,667 dla BSA pod każdym pikiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj procedury wyrównywania pików, korekcji poszerzenia pasma i normalizacji. 
	UWAGA: Zwykle metoda SEC-MALS jest okresowo kalibrowana pod kątem wyrównania pików, poszerzenia pasma i normalizacji detektorów kątowych do detektora 90° przy użyciu białka monodyspersyjnego o promieniu bezwładności Rg < 10 nm, takiego jak monomer BSA. W tym przykładzie BSA służy zarówno jako cząsteczka kalibracyjna, jak i sama jest przedmiotem analizy MW.
	<ol>
		<li>W sekcji Procedury | Wyrównanie view, wybierz środkowy region szczytów, klikając i przeciągając myszą, kliknij Wyrównaj sygnały, a następnie OK.</li>
		<li>W sekcji Procedury | Poszerzenie pasma, wybierz środkowe 50% piku monomeru. Upewnij się, że detektor RI jest określony jako instrument odniesienia, a następnie kliknij przycisk Wykonaj dopasowanie i zastosuj, aby dopasować sygnały UV i LS do sygnału RI.
		<ol>
			<li>Powiększ szczyty, aby sprawdzić, czy nakładają się one bardzo ściśle w środkowym obszarze 50–70%, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
			<li>Jeśli zakładka nie jest idealna, (może być konieczne) wykonaj dopasowanie i "Zastosuj" jeszcze raz lub dwa razy, aż zakładka będzie idealna.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W sekcji Procedury | Normalizacja view, wybierz Szczyt 1, wprowadź 3,0 nm jako wartość Rg, kliknij Normalizuj, a następnie OK.</li>
		<li>W sekcji Procedury | Masa molowa i Rg z widoku MALS, przejrzyj dane, aby określić, które kąty detekcji, jeśli w ogóle, powinny zostać odznaczone z analizy z powodu nadmiernego szumu. Zazwyczaj będą to dolne kąty, w które cząsteczki pyłu rozpraszają się ze stosunkowo dużą intensywnością. Wybierz poszczególne wycinki w obrębie pików z wykresu po prawej stronie i wyświetl zależność kątową odwrotnego zredukowanego współczynnika Rayleigha na wykresie po lewej stronie. Jeśli najniższe (a czasem najwyższe) kąty stale znacznie odbiegają od pasowania, usuń ich zaznaczenie z listy u dołu widoku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyświetl wykres wyników w widoku Wykres EASI. Wybierz Masę molową z listy rozwijanej Wyświetlanie w górnej części okna. Użyj Ctrl + kliknięcie i przeciągnij, aby powiększyć obszar szczytu.</li>
	<li>Zobacz końcowe tabelaryczne wyniki średniej wagowo-masowej masy molowej dla pików monomerów i dimerów w sekcji Wyniki | Widok raportu (podsumowania) w obszarze Szczytowe wyniki | Momenty masy molowej (g/mol) | Mw. Czystość jest podawana w obszarze Wyniki szczytowe | Ułamek masowy (%). 
	UWAGA: Pokazane są również inne momenty masy molowej; Są one zwykle istotne dla heterogenicznych polimerów, ale nie dla białek o dyskretnych rozmiarach. W raporcie można uwzględnić wiele innych wyników uzyskanych przez oprogramowanie, takich jak procentowy odzysk masy (frakcja białka, która wymywała się przez detektor stężeń w stosunku do ilości wstrzykniętego), statystyki pików, polidyspersyjność, momenty Rg i Rh itp. Miary niepewności, o ile są podane, odzwierciedlają precyzję podanej wartości w oparciu o szum w serii pomiarów i nie powinny być uznawane za reprezentujące dokładność. Rzeczywista dokładność podawanych wartości zależy od różnych czynników, takich jak dokładność podanych wartości dn/dc i współczynnika ekstynkcji, kalibracja przyrządu itp.</li>
	<li>Z menu Plik wybierz opcję Zapisz jako metodę i zapisz analizowane dane BSA jako standardową metodę do przyszłych pomiarów wszystkich typów białek. Parametry normalizacji i poszerzenia pasma wyznaczone dla BSA zostaną przeniesione do analizy.</li>
</ol>

DS jest pracownikiem firmy Wyatt Technology Corporation, której produkty MALS są wykorzystywane w tym protokole. AT jest pracownikiem firmy Danyel Biotech, dystrybutora instrumentów Wyatt MALS i AKTA FPLC.

Eksperyment SEC-MALS dostarczył dobrej separacji monomerów, dimerów i trimerów oraz wyników ilościowych dla mas molowych i rozmiarów hydrodynamicznych każdego piku. To z kolei wyraźnie identyfikuje i charakteryzuje każdy obecny gatunek, a także określa ilościowo czystość. Zazwyczaj uzyskane wyniki są dokładne z dokładnością do 5%, a precyzyjne i powtarzalne z dokładnością do 1-2%3,69. Ten poziom precyzji i powtarzalności umożliwia pewne rozróżnienie gatunków, które mogą być zbliżone pod względem MW, o ile są oddzielone przez SEC (mogą częściowo nakładać się w obrębie tego samego piku). Korzyści dla kontroli jakości białek i podstawowej charakterystyki biofizycznej są oczywiste.
Weryfikacja braku cząstek stałych jest bardzo ważna dla czułych, powtarzalnych pomiarów SEC-MALS. Piki cząstek zazwyczaj pojawiają się jako duże sygnały MALS, którym nie towarzyszą porównywalne sygnały UV lub RI. Faza ruchoma i próbka powinny być starannie przygotowane w celu wyeliminowania takich cząstek. Zaleca się stosowanie odczynników klasy HPLC lub lepszych, filtrację fazy ruchomej i bufor rozcieńczający do 0,1 - 0,2 μm (wstępne mycie filtra w celu wyeliminowania cząstek, które są zawsze obecne na suchych membranach), konserwację ekstra czystych butelek z fazą ruchomą i innych naczyń szklanych do SEC-MALS oraz przedłużoną równowagę kolumny pod przepływem (w celu usunięcia cząstek stałych i kruszyw, które mogły się nagromadzić, gdy przepływ został zatrzymany lub kolumna nie była używana). Próbka powinna być filtrowana do najmniejszego rozmiaru porów, który nie usuwa interesującego go materiału, zwykle nie większego niż 0,1 μm i, jeśli to możliwe, 0,02 μm. Jeśli filtr szybko się zapcha, próbkę można odwirować, przefiltrować w etapach zmniejszającej się wielkości porów i/lub ponownie oczyścić. Gdy systemy są konsekwentnie utrzymywane z wysokiej jakości, świeżą i przefiltrowaną fazą ruchomą, zapobiega się wstrząsom kolumny, próbki są czyste i nie przylegają do kolumny, pomiary nie będą wykazywały wspomnianego wcześniej hałasu cząstek stałych i dostarczą danych wysokiej jakości.
MALS jest niezależny od typowych SEC dla białek; Wiele innych systemów buforowych oprócz PBS może być stosowanych w celu optymalizacji separacji i stabilności, w tym różnych substancji pomocniczych71. MALS jest również niezależny od konkretnej kolumny, którą należy wybrać w celu optymalnego oddzielenia i odzysku. Głównymi problemami dotyczącymi substancji pomocniczych w analizie są znaczące zmiany współczynnika załamania światła, prowadzące do modyfikacji przyrostu specyficznego współczynnika załamania światła dn/dc oraz substancje pomocnicze, które absorbują 280 nm, gdy potrzebna jest analiza UV. Na przykład arginina jest powszechną substancją pomocniczą redukującą agregację, która może dramatycznie wpłynąć na dn/dc typowego białka, nawet wprowadzając je w reżim ujemny (białko o ujemnym dn/dc może być nadal analizowane przez SEC-MALS, jeśli dn/dc zostanie określone empirycznie, ale jeśli dn/dc = 0, intensywność światła rozproszonego przez białko będzie zerowa, a analiza MW będzie niemożliwa). Temat wartości dn/dc dla białek jest szeroko omawiany przez Zhao i wsp.35, gdzie wykazano, że w przypadku standardowych wodnych zdecydowana większość niezmodyfikowanych białek mieści się w zakresie 2-3% wartości wzorcowej (0,185 lub 0,186 ml / g przy = 660 nm), chociaż białka poniżej ~ 10 kDa są bardziej zmienne i istnieje kilka gatunków, które mogą osiągać nawet 0,21 ml / g.
Profile MW w pikach monomeru i dimerów BSA w przedstawionych danych były dość jednorodne z dokładnością do 2% lub mniej, co wskazuje na gatunki monodyspersyjne. Niejednorodne wartości MW w całym szczycie mogą wynikać z niejednorodności lub niewłaściwej analizy. W szczególności profil BSA MW, który jest wklęsły ("uśmiech") lub wypukły ("grymas") może wynikać z nieprawidłowego zastosowania korekcji poszerzenia pasma. W przypadku innych białek profil wypukły może również wynikać z dynamicznej równowagi między monomerami i oligomerami, gdzie stosunek monomeru do oligomeru - a tym samym pozorna wartość MW - zależy od stężenia piku (BSA nie wykazuje tego zachowania i jest często używany jako próbka kontrolna w celu sprawdzenia prawidłowych parametrów poszerzenia pasma). Profil MW, który zmienia się od krawędzi czołowej do krawędzi spływu i nie zmienia się wraz ze stężeniem próbki, jest typowy dla rozkładu gatunków o masie cząsteczkowej, które są częściowo rozwiązane przez SEC. Równowagę dynamiczną można łatwo odróżnić od innych źródeł pozornie niejednorodnych rozkładów poprzez wstrzyknięcie różnych całkowitych ilości białka - rozkład będzie się zmieniał wraz z równowagą dynamiczną, ale nie z ustalonym rozkładem lub nieprawidłową korektą poszerzenia pasma.
Biorąc pod uwagę ograniczenia opisane powyżej, SEC-MALS nie nadaje się do różnych zadań. Nie nadaje się do analizy próbek surowych; Próbki powinny być dobrze oczyszczone standardowymi metodami powinowactwa i polerowania. Nie ma wystarczającej dokładności ani zdolności rozdzielczej, aby zidentyfikować mutanty i warianty białka lub mAb o tej samej lub bardzo bliskiej masie i nie może być stosowany z analitami, które nie eluują lub nie rozdzielają się na kolumnie SEC, chociaż ostatnio wykazano, że chromatografia jonowymienna lub chromatografia z odwróconymi fazami może być połączona z MALS w celu oddzielenia i scharakteryzowania gatunków, które nie są rozwiązane przez SEC72, Rozdział 73,74. Tam, gdzie ilości białka są poważnie ograniczone, SEC-MALS może nie być wykonalny, ponieważ zwykle wymaga 10 - 200 μg3, a nawet więcej może być wymagane przez system FPLC z wewnętrzną średnicą rurki większą niż 0,25 mm; jednak mniejsze ilości mogą być analizowane przez UHPLC-SEC-MALS. Wysoce niestabilne białka, które agregują się po wprowadzeniu do fazy ruchomej, nie nadają się do analizy SEC-MALS, chociaż optymalizacja bufora przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła off-line może rozwiązać ten problem75.
Pomimo dodatkowego wysiłku, jaki wiąże się z SEC-MALS, jest on nieoceniony w badaniach nad białkami i jest szeroko stosowany przez społeczności akademickie i biofarmaceutyczne. Oprócz charakterystyki monomerów, oligomerów i agregatów zgodnie z opisem w powyższym protokole, SEC-MALS może charakteryzować zmodyfikowane białka, takie jak glikoproteiny (określając MW składników białka i glikanów indywidualnie), białka błonowe rozpuszczone w środkach powierzchniowo czynnych lub lipidach (określające MW składników białka i solubilizatora indywidualnie), zespoły białek, takie jak cząstki wirusopodobne, kompleksy białko-białko i białko-kwas nukleinowy, polisacharydy, koniugaty białko-polisacharydy, peptydy i wiele innych biomakrocząsteczek.

Niezawodna analiza masy cząsteczkowej (MW) białek w roztworze jest niezbędna w badaniach biomolekularnych1,2,3,4. Analiza MW informuje naukowca, czy wyprodukowano właściwe białko oraz czy nadaje się ono do dalszych eksperymentów5,6. Jak opisano na stronach internetowych sieci badawczych nad białkami P4EU7 oraz ARBRE-Mobieu8, kontrola jakości białek musi charakteryzować nie tylko czystość produktu końcowego, ale także jego stan oligomeryczny, homogeniczność, tożsamość, konformację, strukturę, modyfikacje potranslacyjne i inne właściwości.
Pomiar MW w roztworze niedenaturującym pozwala zidentyfikować formę białka występującą w środowisku wodnym, tzn. czy jest ono monomerem, czy oligomerem. Podczas gdy w przypadku wielu białek celem jest uzyskanie formy monomerycznej, dla innych kluczem do aktywności biologicznej jest konkretny natywny oligomer9,10,1,12. Inne oligomery oraz agregaty nienatywne są niepożądane i prowadzą do błędów w wyznaczaniu struktury za pomocą krystalografii, rezonansu magnetycznego jądra (NMR) lub małokątnego rozpraszania promieni rentgenowskich, a także do artefaktów lub niedokładności w testach funkcjonalnych służących do ilościowego określania wiązania metodą izotermicznej kalorymetrii miareczkowania lub powierzchniowego rezonansu plazmonowego2,13.
W przypadku leków bioterapeutycznych, takich jak przeciwciała monoklonalne (mAbs), analiza MW w roztworze służy podobnemu celowi kontroli jakości i charakterystyki produktu. Nadmierna obecność agregatów i fragmentów świadczy o niestabilności produktu, co czyni go nieprzydatnym do stosowania u ludzi. Organy regulacyjne wymagają dokładnej charakterystyki nie tylko samej cząsteczki terapeutycznej, ale także potencjalnych produktów degradacji, które mogą występować w końcowym produkcie14,15,16,17.
Niektórymi z najpowszechniejszych metod analizy masy cząsteczkowej (MW) białek są elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), elektroforeza kapilarna (CE), natywna elektroforeza PAGE, spektrometria mas (MS), chromatografia wykluczania sterycznego (SEC) oraz analityczna ultrawirowanie (AUC). Spośród nich SDS-PAGE, CE i MS nie są przeprowadzane w stanie natywnym i zazwyczaj prowadzą do dysocjacji oligomerów oraz agregatów, w związku z czym nie nadają się do wyznaczania natywnego oligomeru ani do ilościowego określania agregatów. Choć natywna elektroforeza PAGE teoretycznie zachowuje stan natywny, w naszym doświadczeniu jej optymalizacja dla wielu białek jest trudna, a wyniki nie są zbyt wiarygodne. AUC, niezależnie od tego, czy opiera się na prędkości sedymentacji, czy na równowadze sedymentacyjnej, jest metodą ilościową i pozwala wyznaczyć MW na podstawie zasad podstawowych, jednak jest ona dość uciążliwa, wymagając dużego nakładu pracy ręcznej, znacznej wiedzy specjalistycznej w interpretacji danych, długiego czasu trwania eksperymentu oraz bardzo drogiego urządzenia.
Analityczna SEC jest ilościową, stosunkowo odporną i prostą metodą, która rozdziela makrocząsteczki podczas przepływu przez kolumnę z wypełnieniem. Zasady i zastosowania SEC zostały szczegółowo opisane w kilku przeglądach literatury18,19,20 oraz w podręczniku „Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods”21. Różnice w retencji wynikają z różnego czasu dyfuzji cząsteczek do porów fazy stacjonarnej i z powrotem przed ich wymyciem z końca kolumny. Różnice te wynikają (nominalnie) z wzglbowych rozmiarów oraz współczynników dyfuzji cząsteczek2. Krzywa kalibracyjna jest konstruowana przy użyciu serii cząsteczek referencyjnych, wiążąc masę cząsteczkową (MW) cząsteczki z objętością elucji. W przypadku białek jako cząsteczki referencyjne stosuje się zazwyczaj stabilne białka globularne, które nie oddziałują z kolumną poprzez ładunek lub hydrofobowe reszty powierzchniowe. Objętość elucji mierzy się za pomocą detektora absorbancji w ultrafiolecie (UV). Jeśli znany jest współczynnik ekstynkcji UV – często obliczany na podstawie sekwencji – można również wyznaczyć całkowitą masę piku białka.
Warto zauważyć, że analiza MW za pomocą SEC opiera się na dwóch kluczowych założeniach dotyczących charakteryzowanych białek: 1) posiadają one tę samą konformację i objętość właściwą co standardy referencyjne (innymi słowy, ten sam związek między właściwościami dyfuzyjnymi a MW) oraz 2) podobnie jak standardy referencyjne, nie wchodzą one w interakcje z kolumną poza właściwościami sterycznymi – nie przylegają do wypełnienia kolumny poprzez oddziaływania elektrostatyczne lub hydrofobowe. Odstępstwa od tych założeń unieważniają krzywą kalibracyjną i prowadzą do błędnego wyznaczania MW. Ma to miejsce w przypadku białek wewnętrznie nieuporządkowanych, które mają duże promienie Stokesa ze względu na rozległe obszary nieustrukturyzowane23,24 lub niesferycznych/liniowych kompleksów oligomerycznych10. Białka glikozylowane zazwyczaj mają większy promień Stokesa niż forma nieglikozylowana, nawet przy uwzględnieniu dodanej masy węglowodanów19. Białka błonowe solubilizowane detergentami eluują inaczej niż białka kalibracyjne, ponieważ ich elucja w SEC zależy od całkowitej wielkości kompleksu polipeptyd-detergent-lipidy, a nie od stanu oligomerycznego i masy molowej białka25,26. Chemia kolumny, pH oraz warunki zasolenia wpływają na objętości elucji białek z naładowanymi lub hydrofobowymi resztami powierzchniowymi27,28.
SEC staje się znacznie bardziej wszechstronny i niezawodny w określaniu MW, gdy jest połączony z detektorami wielkątnego rozpraszania światła (MALS) i różnicowego współczynnika załamania (dRI)3,4,1,29,30,31,32. Detektor dRI określa stężenie na podstawie zmiany współczynnika załamania roztworu spowodowanej obecnością analizatu. Detektor MALS mierzy proporcję światła rozpraszanego przez analizat pod wieloma kątami w stosunku do padającej wiązki lasera. Ta konfiguracja aparatury, znana jako SEC-MALS, pozwala wyznaczyć MW niezależnie od czasu elucji, ponieważ MW można obliczyć bezpośrednio z zasad pierwszych, korzystając z równania 1,
<img alt="Wzór na wyznaczanie masy cząsteczkowej, M=R(0)/Kc(dn/dc)^2, równanie do analizy polimerów." src="/files/ftp_upload/59615/59615eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">  (1)
gdzie M to masa cząsteczkowa analizatu, R(0) to zredukowany stosunek Rayleigha (tj. ilość światła rozproszonego przez analizat w stosunku do natężenia lasera) wyznaczony przez detektor MALS i ekstrapolowany do kąta zero, c to stężenie masowe wyznaczone przez detektor UV lub dRI, dn/dc to przyrost współczynnika załamania analizatu (w istocie różnica między współczynnikiem załamania analizatu a buforu), a K to stała optyczna zależna od właściwości układu, takich jak długość fali i współczynnik załamania rozpuszczalnika29.
W metodzie SEC-MALS kolumna SEC służy wyłącznie do rozdzielenia poszczególnych form w roztworze, aby mogły one pojedynczo trafiać do cel detektora MALS i detektora stężenia. Rzeczywisty czas retencji nie ma znaczenia dla analizy, poza stopniem, w jakim pozwala on na rozdzielenie form białkowych. Instrumenty są kalibrowane niezależnie od kolumny i nie opierają się na standardach referencyjnych. W związku z tym SEC-MALS jest uważana za metodę „bezwzględną” wyznaczania MW na podstawie podstawowych równań fizycznych. Jeśli próbka jest heterogenna i nie została całkowicie rozdzielona przez kolumnę, wartość podana dla każdego objętości elucji będzie średnią wagową cząsteczek w każdej objętości elucji przepływającej przez cel pomiarową w danym przedziale czasowym, wynoszącym około 75 μL.
Dzięki analizie zmienności kątowej intensywności rozpraszania, MALS może również określić rozmiar (promień żyzności, Rg) makrocząsteczek i nanocząsteczek o promieniu geometrycznym większym niż około 12,5 nm29. W przypadku mniejszych cząsteczek, takich jak białka monomeryczne i oligomery, do urządzenia MALS można dodać moduł dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w celu pomiaru promieni hydrodynamicznych od 0,5 nm wzwyż3.
Choć analiza stężenia metodą UV lub dRI może dostarczyć wartości c w równaniu 1, preferowane jest użycie dRI z dwóch powodów: 1) dRI jest uniwersalnym detektorem stężenia, odpowiednim do analizy cząsteczek takich jak cukry lub polisacharydy, które nie zawierają chromoforu UV34; oraz 2) odpowiedź stężeniowa dn/dc niemal wszystkich czystych białek w buforze wodnym jest taka sama z dokładnością do jednego lub dwóch procent (0.185 mL/g)35, zatem nie ma potrzeby znania współczynnika ekstynkcji UV.
Zastosowanie SEC-MALS w badaniach białek jest bardzo szerokie. Do najczęstszych zastosowań należy ustalanie, czy oczyszczone białko występuje w formie monomeru czy oligomeru, określanie stopnia oligomeryzacji oraz ocena agregacji3,10,1,17,31,36,37,38. Szczególnie ceniona jest możliwość prowadzenia takich analiz dla białek błonowych solubilizowanych detergentami, których nie można scharakteryzować tradycyjnymi metodami; opublikowano już szczegółowe protokoły dla tego typu badań31,39,40,41,42,43. Inne powszechne zastosowania obejmują ustalanie stopnia modyfikacji potranslacyjnych oraz polidyspersyjności glikoprotein, lipoprotein i podobnych koniugatów4,31,4,45,46,47; badanie formowania się (lub jego braku) oraz absolutnej stechiometrii (w przeciwieństwie do stosunku stechiometrycznego) heterokompleksów, w tym kompleksów białko-białko, białko-kwas nukleikowy oraz białko-polisacharyd24,46,48,49,50,51,52; wyznaczanie stałej dysocjacji równowagi monomer-dimer49,53,54; a także ocena konformacji białek5,56. Poza białkami, SEC-MALS jest nieoceniony w charakterystyce peptydów57,58, szeroko heterogenicznych polimerów naturalnych, takich jak heparyny59 i chitosan60,61, małych wirusów62 oraz większości rodzajów polimerów syntetycznych lub przetworzonych63,64,65,6. Obszerna bibliografia dostępna jest w literaturze przedmiotu67 oraz online (pod adresem http://www.wyatt.com/bibliography).
W niniejszym materiale przedstawiamy standardowy protokół przeprowadzania i analizy eksperymentu SEC-MALS. Jako przykład rozdziału i charakterystyki monomerów oraz oligomerów białek posłużyła albumina surowicy bydlęcej (BSA). Protokół z użyciem BSA pozwala wyznaczyć określone stałe systemu, które stanowią podstawę do dalszych analiz SEC-MALS, w tym badań kompleksów, glikoprotein i białek błonowych związanych z surfaktantem.
Zauważamy, że metodę SEC-MALS można przeprowadzić przy użyciu standardowego sprzętu do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) wielu producentów. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu FPLC powszechnie spotykanego w laboratoriach zajmujących się produkcją białek na potrzeby badań i rozwoju (patrz Tabela materiałów). Przed rozpoczęciem protokołu należy zainstalować system FPLC oraz detektory MALS i dRI, wraz z odpowiednimi pakietami oprogramowania do sterowania, akwizycji i analizy danych, zgodnie z instrukcjami producentów; w oprogramowaniu należy wprowadzić wszelkie wymagane stałe kalibracyjne lub inne ustawienia. Pomiędzy pompą a injektorem należy umieścić filtr przepływowy z hydrophiliczną, 0.1 µm Zainstalowano membranę porowatą.

<table><tbody><tr><td>AKTA pure</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-26</td><td>szybki chromatograf cieczowy białek (FPLC)&nbsp;</td></tr><tr><td>AKTA UNICORN</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Oprogramowanie sterujące FPLC</td></tr><tr><td>ASTRA</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>Oprogramowanie do pozyskiwania i analizy danych MALS</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (czystość >97%)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Analit A1900</td><td></td></tr><tr><td>DAWN lub miniDAWN</td> Wyatt Technology <td>Detektor wielokątowego rozpraszania światła (MALS)</td><td>Wyatt Technology</td><td>WH2 lub WTREOS</td></tr><tr><td>Zwiększ 200 10/300</td><td>GE Kolumna</td><td>wykluczająca rozmiar opieki zdrowotnej, 200 i Aring; pory, średnica wewnętrzna 10 mm, długość 300 mm</td>Optilab Wyatt Technology Detektor różnicowego indeksu refrakcji (RI) WTREX Chlorek sodu NaCl Sigma&<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> nbsp;</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy NaCl Stericup klasy HPLC sulfon polieterowy 0,1 i mikro; m 1000 ml&nbsp;</td><td>Ruchomy filtr fazowy</td> <td>Millipore</td><td>SCVPU11RE</td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy Whatman Anotop 10 0,02 i mikro; m</td><td>Filtr do próbek</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1002</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 10, 0,1 i mikro; m porów, średnica 10 mm</td><td>Filtr do próbek</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1012</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 25 0,1 i mikro; m</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-2012</td><td>mobilny filtr fazowy</td></tr><tr><td>WyattQELS</td><td>Wyatt Technology</td><td>WIQ</td><td>detektor dynamicznego rozpraszania światła</td></tr></tbody></table>

charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (sec-mals)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analityczna chromatografia wykluczania wielkości (SEC), powszechnie używana do oznaczania masy cząsteczkowej białek i kompleksów białko-białko w roztworze, jest techniką względną, która opiera się na objętości elucji analitu w celu oszacowania masy cząsteczkowej. Gdy białko nie jest kuliste lub ulega nieidealnym interakcjom kolumnowym, krzywa kalibracyjna oparta na wzorcach białka jest nieważna, a masa cząsteczkowa określona na podstawie objętości elucji jest nieprawidłowa. Rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MALS) to technika absolutna, która określa masę cząsteczkową analitu w roztworze na podstawie podstawowych równań fizycznych. Połączenie SEC do separacji z MALS do analizy stanowi wszechstronny, niezawodny sposób charakteryzowania roztworów jednego lub więcej gatunków białek, w tym monomerów, natywnych oligomerów lub agregatów oraz heterokompleksów. Ponieważ pomiar jest wykonywany przy każdej objętości elucji, SEC-MALS może określić, czy pik eluujący jest jednorodny czy niejednorodny i odróżnić stały rozkład masy cząsteczkowej od równowagi dynamicznej. Możliwa jest również analiza zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny lub lipoproteiny, lub koniugatów, takich jak białka błonowe rozpuszczone w detergentach. W związku z tym SEC-MALS jest kluczowym narzędziem dla chemików białek, którzy muszą potwierdzić właściwości biofizyczne i zachowanie roztworu cząsteczek wytwarzanych do badań biologicznych lub biotechnologicznych. Ten protokół dla SEC-MALS analizuje masę cząsteczkową i wielkość czystych monomerów i agregatów białkowych. Uzyskane dane służą jako podstawa do dalszych analiz SEC-MALS, w tym dotyczących kompleksów, glikoprotein i białek błonowych związanych z surfaktantami.

Rysunek 1a,b pokazują, że trzy formy oligomeryczne BSA: monomer, dimer i trimer, zostały dobrze rozdzielone na kolumnie z porami 20 Å z rozdzielczością linii podstawowej dla monomeru i dimeru, podczas gdy Rysunek 2a pokazuje, że rozdzielenie na kolumnie z porami 75 Å nie pozwoliło na uzyskanie dobrej rozdzielczości między monomerem a dimerem. Ten drugi przykład został zamieszczony w celu zilustrowania „słabego” wyniku; różnice w rozdzieleniu dla tych dwóch kolumn mogą w rzeczywistości być spodziewane zgodnie z zakresami rozdzielania podanymi przez producenta. Trimer nie jest w pełni oddzielony od dimeru, a wyższe oligomery nie są dobrze rozdzielone od trimeru ani od siebie nawzajem. Rysunek 2b przedstawia przykład zaszumionego sygnału rozpraszania światła z cząstkami obecnymi w całym chromatogramie, co uniemożliwia dokładne oznaczenie MW.
W dalszej części skupiamy się na Rysunku 1b. Monomer, który eluował w 13,8 min, wykazuje średnią masę molową Mw wynoszącą 64,1 ± 0,4 kDa wyznaczoną metodą MALS oraz promień hydrodynamiczny Rh wynoszący 3,54 ± 0,01 nm. Wyniki te są zgodne z masą sekwencyjną i znanym promieniem hydrodynamicznym BSA, odpowiednio 66,4 kDa i 3,5 nm68, w granicach typowej dokładności metody SEC-MALS, wynoszącej 5%3,69. Dimer, który eluował w 12 min, wykazał wartość Mw wynoszącą 127 ± 1 kDa wyznaczoną metodą MALS – co było spodziewane, gdyż jest to dwukrotność masy monomeru w granicach precyzji eksperymentalnej – oraz Rh wynoszący 5,68 ± 0,06 nm. Zaobserwowano również pik trimeru w 1 min z wartością Mw wynoszącą 194 ± 9 kDa wyznaczoną metodą MALS, co zgodnie z oczekiwaniami stanowi trzykrotność masy monomeru w granicach precyzji eksperymentalnej. Wartości Rh trimeru nie udało się wyznaczyć ze względu na niską intensywność sygnału DLS.
Wartości masy molowej obliczone w obrębie piku monomeru są jednolite w zakresie 2-5%, co wskazuje na homogeniczność. Niezwykłe jest stwierdzenie śladu ramienia z masą molową w zakresie 38-50 kDa, odpowiadającego fragmentom BSA70. Wartości masy molowej w obrębie pików dimeru i trimeru nie są jednolite, co świadczy o heterogeniczności. Pik dimeru jest nieco heterogeniczny ze względu na ślady trimeru przenikające do piku dimeru, natomiast pik trimeru jest heterogeniczny z powodu współelucji słabo rozdzielonych wyższych oligomerów.
Poziom sygnału do szumu dla piku monomeru jest w pełni akceptowalny we wszystkich trzech sygnałach i wynosi powyżej 10:1, podobnie jak w przypadku piku dimeru, gdzie stosunek sygnału do szumu wynosi 40:1. Obszary chromatogramu poza pikami białek są płaskie, z wyjątkiem piku spowodowanego obecnością cząstek w pobliżu objętości całkowitego wykluczenia (objętości martwej) w śladzie LS oraz (dodatniego) piku soli i (ujemnego) piku rozpuszczonego powietrza w śladzie dRI, w pobliżu objętości całkowitej przenikalności. Zostały one wskazane na Ryc. 1a.
Poziom czystości można obliczyć również w eksperymencie SEC-MALS: ułamek masowy piku monomeru w raporcie reprezentuje procent czystości formy monomerycznej. Dla monomeru BSA obliczona czystość wynosi 88%.
<img alt="Schemat analizy danych chromatografii wykluczania rozmiarów przedstawiający piki analitów, masę molową w funkcji czasu elucji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Analiza SEC-MALS albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z wykorzystaniem kolumny do chromatografii wykluczania z porami o rozmiarze 20 Å. Przebiegi chromatogramów zostały znormalizowane do piku monomeru i przesunięte w celu zwiększenia przejrzystości.AWskazano typowe artefakty, które można zignorować, w tym piky cząsteczkowe w pobliżu początku sygnału rozpraszania światła, a także piki soli i rozpuszczonego powietrza w pobliżu całkowitej objętości przenikania w sygnale współczynnika refrakcji.B) Chromatogram wykazuje doskonały rozdział monomeru, dimeru i trimeru, a sygnał rozpraszania światła charakteryzuje się wysokim stosunkiem sygnału do szumu. Wartości masy cząsteczkowej (MW) monomeru i dimeru wykazują wysoką homogeniczność. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres chromatografii wykluczania; rozdział monomerów, detekcja LS/UV/RI, analiza masy molowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Przykłady analiz SEC-MALS o niskiej jakości. Ślady chromatogramów zostały znormalizowane do piku monomeru i przesunięte dla przejrzystości.A) Niewystarczająca separacja na kolumnie do chromatografii wykluczania z rozmiarem porów 75 Å; pik cząsteczek w czasie od 8 do 9 min nie jest dobrze oddzielony od białek.B) W sygnale rozpraszania światła (LS) widoczny jest niewystarczający stosunek sygnału do szumu oraz obecność licznych cząsteczek w sąsiedztwie białek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje połączenie chromatografii wykluczającej rozmiar z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) dla absolutnej charakterystyki białek i kompleksów w roztworze. SEC-MALS określa masę cząsteczkową i wielkość czystych białek, natywnych oligomerów, heterokompleksów i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny.

Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

SEC-MALS to ilościowa metoda określania masy cząsteczkowej, wielkości i konformacji makrocząsteczek w roztworze. Może identyfikować oligomery i kompleksy oraz charakteryzować trudne próbki, takie jak glikoproteiny i białka błonowe. SEC-MALS jest metodą bezwzględną.Opiera się na podstawowej fizyce i nie zależy od współpracy w zakresie standardów molekularnych, konformacji cząsteczki ani tego, jak oddziałujemy z ośrodkiem separacyjnym. SEC-MALS może być stosowany do wielu systemów, które są oddzielone przez sec. Od peptydów i małych polimerów po białka, nukleokapsydy, polisacharydy, polimery syntetyczne, cząsteczki wirusopodobne i małe wirusy.Ważne jest, aby sprawdzić, czy system i nie są zgodne z zaleceniami dostawcy dotyczącymi niskiej zawartości cząstek stałych. Aby się upewnić, skonsultuj się z przedstawicielem pomocy technicznej dostawcy. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania systemu SEC-MALS zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Używając każdego odczynnika klasy PLC, przygotuj jeden litr soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 50 do 100 milimolowym chlorkiem sodu. Przefiltruj bufor do 0,1 mikrona za pomocą butelkowanego filtra piankowego z ogniw polieterowych lub podobnego. Przefiltruj pierwsze 50 do 100 mililitrów buforu do butelki na odpady, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów.Następnie przefiltruj pozostałą część do czystej, sterylnej butelki, która została wcześniej umyta przefiltrowaną, dejonizowaną wodą i przechowywana, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu. Przepłukać kolumnę przez noc z natężeniem przepływu 0,5 mililitra na minutę, aby zrównoważyć kolumnę w buforze i usunąć cząstki stałe. Użyj trybu ciągłego przepływu FPLC i upewnij się, że przepływ nie zatrzyma się, dopóki wszystkie przebiegi SEC-MALS nie zostaną zakończone.Przełącz komorę przepływową DRI w tryb przedmuchiwania podczas płukania przez noc. Rozpoczynając spłukiwanie, stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, aby zapobiec efektowi zrzucania kolumny, spowodowanemu nagłą zmianą ciśnienia w kolumnie. Wyłącz przedmuchiwanie przed rozpoczęciem próbnych przebiegów.Sprawdź czystość systemu, lekko stukając w rurkę za kolumną, aby uwolnić nagromadzone cząstki. Obserwuj sygnał w detektorze 90 stopni na wyświetlaczu na panelu przednim przyrządu MALS. Sprawdź, czy hałas międzyszczytowy nie przekracza 50-100 mikrowoltów.Sprawdź również, czy współczynnik załamania światła lub sygnał RI jest stabilny z dokładnością mniejszą niż 1 razy dziesięć do minus siedem jednostek indeksu załamania światła. Wykonać ślepe wstrzyknięcie, aby sprawdzić, czy wtryskiwacz jest oczyszczony z cząstek stałych. Ślepa próba to po prostu bufor do biegania przygotowany w świeżej, sterylnej fiolce.Jeśli pik cząstek ma objętość nie większą niż jeden mililitr i nie większą niż pięć miliwoltów powyżej linii podstawowej, system jest gotowy na próbki. W przeciwnym razie wykonaj dodatkowe ślepe wstrzyknięcia, aż do wyczyszczenia, lub przeprowadź konserwację w celu wyczyszczenia wtryskiwacza. Teraz przygotuj co najmniej 200 mikrolitrów BSA w ilości od jednego do dwóch miligramów na mililitr w buforze SCC.Przefiltruj białko do 02 mikronów za pomocą filtra z końcówki strzykawki. Wyrzuć kilka pierwszych kropli filtratu, aby wyeliminować cząstki z suchych filtrów. Alternatywnie, należy odwirować próbkę w temperaturze 10 000 razy G przez piętnaście minut, aby umożliwić wytrącanie nierozpuszczalnych agregatów i innych dużych cząstek.Następnie wstrzyknąć 100 mikrolitrów roztworu BSA do pętli. Otwórz nowy eksperyment z metody w menu oprogramowania MALS. Następnie wybierz metodę online z folderu metod systemu rozpraszania światła.Jeśli detektor DLS jest obecny, wybierz metodę online z folderu rozpraszanie światła za pomocą QELS. Ustaw parametry próbki i fazy ruchomej w sekcji konfiguracji. W ogólnym widoku pompy ustaw natężenie przepływu na takie, jakie jest używane w FPLC.Następnie przejdź do ogólnego widoku pompy, gałęzi rozpuszczalnika, pola nazwy i wybierz PBS. W widoku wtryskiwacza, przykładowa gałąź, wprowadź nazwę jako BSA. Ustaw dn/dc na 0,185, ustaw A2 na 0 i ustaw współczynnik ekstynkcji UV na 0,667 mililitra na miligram centymetra.W sekcji procedur, w podstawowym widoku kolekcji, zaznacz pole wyboru wyzwalacz automatycznego wstrzykiwania. Ustaw czas trwania przebiegu na 70 minut, tak aby dane były zbierane dla całej aluzji, aż do osiągnięcia całkowitej objętości przenikania kolumny SEC. Rozpocznij eksperyment w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk uruchom.Odczyt danych rozpocznie się po odebraniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS. Wyzeruj sygnał DRI, klikając przycisk automatycznego zerowania na przednim panelu instrumentu. Pracując w oprogramowaniu FPLC, przejdź do instrukcji, wykonaj instrukcje ręczne, ustaw znacznik i wstaw nazwę białka i biegu.Przełącz zawór wtryskowy z obciążenia ręcznego na wtrysk, ścieżkę przepływu, zawór wtryskowy. Dołącz sygnał impulsowy, wstawiając impuls 0,5-sekundowy pod wyjściem cyfrowym impulsu IO box. Spowoduje to rozpoczęcie zbierania danych w oprogramowaniu MALS.Teraz wstrzyknij próbkę do pętli. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj) w oprogramowaniu FPLC, aby rozpocząć przebieg eksperymentu. Przeprowadź analizę krok po kroku, w sekcji procedur w oprogramowaniu MALS.Sprawdź, czy piki pojawiają się w przybliżeniu przy tej samej objętości aluzji w UV, MALS i RI, sprawdzając podstawowy widok kolekcji. W widoku linii bazowej zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów. W widoku szczytów zdefiniuj szczyty, które mają być analizowane, klikając i przeciągając myszą.Wybierz środkowe 50% każdego szczytu. Najpierw wybierz pik monomeru, a następnie pik dimera. Pod każdym pikiem sprawdź poprawność wartości dn/dc i współczynnika ekstynkcji przy 280 nanometrach dla BSA.W procedurach, widoku wyrównania, wybierz środkowy region szczytów, klikając i przeciągając myszą. Kliknij pozycję Wyrównaj sygnały, a następnie kliknij przycisk OK. W procedurach, widok poszerzania pasma, wybierz środkowe 50% piku monomeru.Upewnij się, że detektor indeksu refrakcji jest określony jako przyrząd odniesienia. Następnie kliknij wykonaj dopasowanie i zastosuj, aby dopasować sygnały UV i rozpraszania światła do sygnału indeksu załamania światła. Powiększ szczyty, aby sprawdzić, czy bardzo ściśle pokrywają się w środkowym zakresie od 50 do 70%, a następnie kliknij przycisk OK.W procedurach, widoku normalizacji wybierz pik jeden. Wprowadź 3,0 nanometra jako wartość RG, kliknij przycisk normalizuj, a następnie kliknij przycisk OK. Wyświetl wykres wyników w widoku wykresu EASI.Wybierz masę molową z listy rozwijanej wyświetlacza w górnej części okna. Użyj Control, kliknij i przeciągnij, aby powiększyć obszar szczytu. Aby wyświetlić końcowe tabelaryczne wyniki średniej masy molowej dla pików monomeru i dimera, przejdź do wyników pików, momentów masy molowej, MW i wybierz do wyników, podsumowanie raportu.Czystość jest podawana pod wynikami pików, ułamek masowy. Z menu pliku wybierz opcję Zapisz jako metodę i zapisz analizowane dane BSA jako standardową metodę do przyszłych pomiarów wszystkich typów białek. Parametry normalizacji i poszerzenia pasma wyznaczone dla BSA zostaną przeniesione do analizy.Poniżej przedstawiono analizy SEC-MALS BSA przy użyciu kolumny wykluczającej wielkość porów 200 angstremów. Ślady chromatogramu są znormalizowane do piku monomeru i przesunięte w celu uzyskania klarowności. Wskazano typowe artefakty, które można zignorować, w tym pik cząstek w pobliżu początku sygnału rozpraszania światła, a także piki soli i rozpuszczonego powietrza w pobliżu całkowitej objętości przenikania w sygnale współczynnika załamania światła.Chromatogram wykazuje doskonałą separację monomerów, dimerów i trimerów, a sygnał rozpraszania światła wykazuje wysoki stosunek sygnału do szumu. Średnie wartości masy molowej monomeru i dimeru wykazują wysoką jednorodność. Oto przykłady niskiej jakości analiz SEC-MALS.W tym przykładzie nieodpowiednia separacja w kolumnie wykluczającej wielkość porów 75 angstremów powoduje pik cząstek między ośmioma a dziewięcioma minutami, które nie są dobrze oddzielone od białek. W tym przypadku stosunek sygnału do szumu jest niewystarczający, a w sygnale rozpraszania światła widoczne są rozległe cząstki przylegające do białek. Kluczem do dobrych wyników SEC-MALS jest wybór odpowiedniej kolumny, upewnienie się, że system jest skalibrowany przy niskim poziomie szumów rozpraszania światła oraz wstępne filtrowanie lub odwirowanie próbek w celu usunięcia cząstek.Po badaniu SEC-MALS próbki białek mogą być dalej analizowane pod kątem powinowactwa wiązania, biolizy, powierzchniowego rezonansu plazmonowego, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej, forometrii biolerydów, termoforezy w mikroskali lub gradientu składu, wielokątowego rozpraszania światła. Strukturę białka można określić za pomocą krystalografii rentgenowskiej, błędnej krioelektronowej cysterkopii lub NMR.

characterization-proteins-size-exclusion-chromatography-coupled-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Ten film opisuje SEC-MALS, który wykorzystuje możliwości chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) i wielokątowego rozpraszania światła (MALS). W SEC-MALS SEC-MALS SEC rozdziela białka lub kompleksy białkowe na podstawie ich wielkości, a detektor MALS określa średnią masę cząsteczkową, mierząc intensywność światła rozproszonego przez cząsteczkę pod różnymi kątami.

Chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła dla oligomerów białkowych

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Określenie struktury roztworu białka za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wymaga próbek monodyspersyjnych. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwości zapewnienia minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych: chromatografia wykluczania wielkości online (SEC) i chromatografia jonowymienna online (IEC).

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

Ten protokół opisuje użycie chromatografii jonowymiennej o wysokiej specyficzności z wielokątowym rozpraszaniem światła do dokładnego wyznaczania masy molowej białek, kompleksów białkowych i peptydów w heterogenicznej próbce. Metoda ta jest cenna dla oceny jakości, a także dla scharakteryzowania natywnych oligomerów, wariantów ładunku i próbek białek mieszanych.

Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Niniejszy protokół opisuje procedurę przeprowadzenia chromatografii wykluczenia rozmiaru fluorescencyjnego (FSEC) białek błonowych w celu oceny ich jakości na potrzeby dalszej analizy funkcjonalnej i strukturalnej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki FSEC zebrane dla kilku receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) w warunkach rozpuszczalnych w detergentach i bezdetergentowych.

Szybka ocena jakości białka błonowego za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiaru fluorescencyjnego

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Poznaj metodę SEC-MALS do charakteryzacji białek i kompleksów w roztworze. Ta technika umożliwia bezwzględne oznaczanie masy cząsteczkowej i rozmiaru makrocząsteczek bez konieczności stosowania standardów.

Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

Przeglądaj więcej filmów