Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

SEC-MALS to ilościowa metoda określania masy cząsteczkowej, wielkości i konformacji makrocząsteczek w roztworze. Może identyfikować oligomery i kompleksy oraz charakteryzować trudne próbki, takie jak glikoproteiny i białka błonowe. SEC-MALS jest metodą bezwzględną.

Opiera się na podstawowej fizyce i nie zależy od współpracy w zakresie standardów molekularnych, konformacji cząsteczki ani tego, jak oddziałujemy z ośrodkiem separacyjnym. SEC-MALS może być stosowany do wielu systemów, które są oddzielone przez sec. Od peptydów i małych polimerów po białka, nukleokapsydy, polisacharydy, polimery syntetyczne, cząsteczki wirusopodobne i małe wirusy.

Ważne jest, aby sprawdzić, czy system i nie są zgodne z zaleceniami dostawcy dotyczącymi niskiej zawartości cząstek stałych. Aby się upewnić, skonsultuj się z przedstawicielem pomocy technicznej dostawcy. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania systemu SEC-MALS zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Używając każdego odczynnika klasy PLC, przygotuj jeden litr soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 50 do 100 milimolowym chlorkiem sodu. Przefiltruj bufor do 0,1 mikrona za pomocą butelkowanego filtra piankowego z ogniw polieterowych lub podobnego. Przefiltruj pierwsze 50 do 100 mililitrów buforu do butelki na odpady, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów.

Następnie przefiltruj pozostałą część do czystej, sterylnej butelki, która została wcześniej umyta przefiltrowaną, dejonizowaną wodą i przechowywana, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu. Przepłukać kolumnę przez noc z natężeniem przepływu 0,5 mililitra na minutę, aby zrównoważyć kolumnę w buforze i usunąć cząstki stałe. Użyj trybu ciągłego przepływu FPLC i upewnij się, że przepływ nie zatrzyma się, dopóki wszystkie przebiegi SEC-MALS nie zostaną zakończone.

Przełącz komorę przepływową DRI w tryb przedmuchiwania podczas płukania przez noc. Rozpoczynając spłukiwanie, stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, aby zapobiec efektowi zrzucania kolumny, spowodowanemu nagłą zmianą ciśnienia w kolumnie. Wyłącz przedmuchiwanie przed rozpoczęciem próbnych przebiegów.

Sprawdź czystość systemu, lekko stukając w rurkę za kolumną, aby uwolnić nagromadzone cząstki. Obserwuj sygnał w detektorze 90 stopni na wyświetlaczu na panelu przednim przyrządu MALS. Sprawdź, czy hałas międzyszczytowy nie przekracza 50-100 mikrowoltów.

Sprawdź również, czy współczynnik załamania światła lub sygnał RI jest stabilny z dokładnością mniejszą niż 1 razy dziesięć do minus siedem jednostek indeksu załamania światła. Wykonać ślepe wstrzyknięcie, aby sprawdzić, czy wtryskiwacz jest oczyszczony z cząstek stałych. Ślepa próba to po prostu bufor do biegania przygotowany w świeżej, sterylnej fiolce.

Jeśli pik cząstek ma objętość nie większą niż jeden mililitr i nie większą niż pięć miliwoltów powyżej linii podstawowej, system jest gotowy na próbki. W przeciwnym razie wykonaj dodatkowe ślepe wstrzyknięcia, aż do wyczyszczenia, lub przeprowadź konserwację w celu wyczyszczenia wtryskiwacza. Teraz przygotuj co najmniej 200 mikrolitrów BSA w ilości od jednego do dwóch miligramów na mililitr w buforze SCC.

Przefiltruj białko do 02 mikronów za pomocą filtra z końcówki strzykawki. Wyrzuć kilka pierwszych kropli filtratu, aby wyeliminować cząstki z suchych filtrów. Alternatywnie, należy odwirować próbkę w temperaturze 10 000 razy G przez piętnaście minut, aby umożliwić wytrącanie nierozpuszczalnych agregatów i innych dużych cząstek.

Następnie wstrzyknąć 100 mikrolitrów roztworu BSA do pętli. Otwórz nowy eksperyment z metody w menu oprogramowania MALS. Następnie wybierz metodę online z folderu metod systemu rozpraszania światła.

Jeśli detektor DLS jest obecny, wybierz metodę online z folderu rozpraszanie światła za pomocą QELS. Ustaw parametry próbki i fazy ruchomej w sekcji konfiguracji. W ogólnym widoku pompy ustaw natężenie przepływu na takie, jakie jest używane w FPLC.

Następnie przejdź do ogólnego widoku pompy, gałęzi rozpuszczalnika, pola nazwy i wybierz PBS. W widoku wtryskiwacza, przykładowa gałąź, wprowadź nazwę jako BSA. Ustaw dn/dc na 0,185, ustaw A2 na 0 i ustaw współczynnik ekstynkcji UV na 0,667 mililitra na miligram centymetra.

W sekcji procedur, w podstawowym widoku kolekcji, zaznacz pole wyboru wyzwalacz automatycznego wstrzykiwania. Ustaw czas trwania przebiegu na 70 minut, tak aby dane były zbierane dla całej aluzji, aż do osiągnięcia całkowitej objętości przenikania kolumny SEC. Rozpocznij eksperyment w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk uruchom.

Odczyt danych rozpocznie się po odebraniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS. Wyzeruj sygnał DRI, klikając przycisk automatycznego zerowania na przednim panelu instrumentu. Pracując w oprogramowaniu FPLC, przejdź do instrukcji, wykonaj instrukcje ręczne, ustaw znacznik i wstaw nazwę białka i biegu.

Przełącz zawór wtryskowy z obciążenia ręcznego na wtrysk, ścieżkę przepływu, zawór wtryskowy. Dołącz sygnał impulsowy, wstawiając impuls 0,5-sekundowy pod wyjściem cyfrowym impulsu IO box. Spowoduje to rozpoczęcie zbierania danych w oprogramowaniu MALS.

Teraz wstrzyknij próbkę do pętli. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj) w oprogramowaniu FPLC, aby rozpocząć przebieg eksperymentu. Przeprowadź analizę krok po kroku, w sekcji procedur w oprogramowaniu MALS.

Sprawdź, czy piki pojawiają się w przybliżeniu przy tej samej objętości aluzji w UV, MALS i RI, sprawdzając podstawowy widok kolekcji. W widoku linii bazowej zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów. W widoku szczytów zdefiniuj szczyty, które mają być analizowane, klikając i przeciągając myszą.

Wybierz środkowe 50% każdego szczytu. Najpierw wybierz pik monomeru, a następnie pik dimera. Pod każdym pikiem sprawdź poprawność wartości dn/dc i współczynnika ekstynkcji przy 280 nanometrach dla BSA.

W procedurach, widoku wyrównania, wybierz środkowy region szczytów, klikając i przeciągając myszą. Kliknij pozycję Wyrównaj sygnały, a następnie kliknij przycisk OK. W procedurach, widok poszerzania pasma, wybierz środkowe 50% piku monomeru.

Upewnij się, że detektor indeksu refrakcji jest określony jako przyrząd odniesienia. Następnie kliknij wykonaj dopasowanie i zastosuj, aby dopasować sygnały UV i rozpraszania światła do sygnału indeksu załamania światła. Powiększ szczyty, aby sprawdzić, czy bardzo ściśle pokrywają się w środkowym zakresie od 50 do 70%, a następnie kliknij przycisk OK.

W procedurach, widoku normalizacji wybierz pik jeden. Wprowadź 3,0 nanometra jako wartość RG, kliknij przycisk normalizuj, a następnie kliknij przycisk OK. Wyświetl wykres wyników w widoku wykresu EASI.

Wybierz masę molową z listy rozwijanej wyświetlacza w górnej części okna. Użyj Control, kliknij i przeciągnij, aby powiększyć obszar szczytu. Aby wyświetlić końcowe tabelaryczne wyniki średniej masy molowej dla pików monomeru i dimera, przejdź do wyników pików, momentów masy molowej, MW i wybierz do wyników, podsumowanie raportu.

Czystość jest podawana pod wynikami pików, ułamek masowy. Z menu pliku wybierz opcję Zapisz jako metodę i zapisz analizowane dane BSA jako standardową metodę do przyszłych pomiarów wszystkich typów białek. Parametry normalizacji i poszerzenia pasma wyznaczone dla BSA zostaną przeniesione do analizy.

Poniżej przedstawiono analizy SEC-MALS BSA przy użyciu kolumny wykluczającej wielkość porów 200 angstremów. Ślady chromatogramu są znormalizowane do piku monomeru i przesunięte w celu uzyskania klarowności. Wskazano typowe artefakty, które można zignorować, w tym pik cząstek w pobliżu początku sygnału rozpraszania światła, a także piki soli i rozpuszczonego powietrza w pobliżu całkowitej objętości przenikania w sygnale współczynnika załamania światła.

Chromatogram wykazuje doskonałą separację monomerów, dimerów i trimerów, a sygnał rozpraszania światła wykazuje wysoki stosunek sygnału do szumu. Średnie wartości masy molowej monomeru i dimeru wykazują wysoką jednorodność. Oto przykłady niskiej jakości analiz SEC-MALS.

W tym przykładzie nieodpowiednia separacja w kolumnie wykluczającej wielkość porów 75 angstremów powoduje pik cząstek między ośmioma a dziewięcioma minutami, które nie są dobrze oddzielone od białek. W tym przypadku stosunek sygnału do szumu jest niewystarczający, a w sygnale rozpraszania światła widoczne są rozległe cząstki przylegające do białek. Kluczem do dobrych wyników SEC-MALS jest wybór odpowiedniej kolumny, upewnienie się, że system jest skalibrowany przy niskim poziomie szumów rozpraszania światła oraz wstępne filtrowanie lub odwirowanie próbek w celu usunięcia cząstek.

Po badaniu SEC-MALS próbki białek mogą być dalej analizowane pod kątem powinowactwa wiązania, biolizy, powierzchniowego rezonansu plazmonowego, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej, forometrii biolerydów, termoforezy w mikroskali lub gradientu składu, wielokątowego rozpraszania światła. Strukturę białka można określić za pomocą krystalografii rentgenowskiej, błędnej krioelektronowej cysterkopii lub NMR.