Name: Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas tworzenia synaps immunologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: Poznaj techniki obrazowania i biochemiczne do badania dynamiki organelli w limfocytach B podczas tworzenia synaps immunologicznych. Te metody pozwalają zrozumieć mechanizmy aktywacji komórek B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.-I.Y. jest wspierany przez grant badawczy od FONDECYT #1180900. J.I., D.F. i J.L. byli wspierani przez stypendia od Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Dziękujemy Davidowi Osorio z Pontificia Universidad Católica de Chile za nagranie i edycję wideo.

UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane przy użyciu komórek B IIA1.6.
1. Aktywacja komórek B za pomocą koralików pokrytych antygenem
<ol>
	<li>Przygotowanie koralików pokrytych antygenem
	<ol>
		<li>Aby aktywować komórki B, użyj koralików NH2 kowalencyjnie pokrytych antygenem (koraliki pokryte antygenem), które są przygotowywane za pomocą 50 μL (~20 x 106 koralików) koralików NH2 3 μm z aktywującymi (BCR-ligandi+) lub nieaktywującymi (BCR-ligandi-) antygenami.</li>
		<li>W przypadku komórek B IIA1.6 użyj fragmentu przeciwciała przeciw IgG-F(ab')2 jako BCR-ligandi+ i fragmentu przeciwciała przeciw IgM-F(ab')2 lub albuminy surowicy wołowej (BSA) jako BCR-ligandi-. Aby aktywować pierwotne komórki B lub linię komórek B IgM+, użyj fragmentu przeciwciała przeciw IgM-F(ab')2 jako BCR-ligandi+ i BSA jako BCR-ligandi-. 
		UWAGA: Aby uniknąć wiązania ligandów z receptorem Fc, użyj fragmentów przeciwciał F(ab') lub F(ab')2 zamiast pełnowymiarowych przeciwciał.</li>
		<li>Aby przystąpić do przygotowania koralików pokrytych antygenem, umieść koraliki w mikroprobówkach do mikrowirowania o niskim wiązaniu białka, aby maksymalizować odzyskiwanie koralików podczas manipulacji próbkami. Dodaj 1 ml buforu fosforanowego 1x (PBS) do wypłukania koralików i wiruj przez 5 min przy 16 000 x g. Zasądź nadstan.</li>
		<li>Zawieś reaktywne grupy NH2 za pomocą 500 μL 8% glutaraldehydu i wiruj przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT). 
		UWAGA: Roztwór glutaraldehydu należy używać tylko w kapturze chemicznym. Należy przestrzegać instrukcji zawartych w karcie danych bezpieczeństwa materiału (MSDS).</li>
		<li>Wiruj koraliki przez 5 min przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C, usuń glutaraldehyd i wypłukuj koraliki jeszcze trzykrotnie 1 ml 1x PBS. 
		UWAGA: Roztwór glutaraldehydu należy wyrzucić jako odpady chemiczne.</li>
		<li>Zawieś aktywowane koraliki w 100 μL 1x PBS. Próbkę można podzielić na dwie mikroprobówki do mikrowirowania o niskim wiązaniu białka: 50 μL na BCR-ligandi+ i 50 μL na BCR-ligandi-.</li>
		<li>Aby przygotować roztwór antygenu, użyj dwóch 2 mL mikroprobówek do mikrowirowania o niskim wiązaniu białka zawierających 100 μg/mL roztworu antygenu w 150 μL PBS: jedna probówka z BCR-ligandi+ a druga z BCR-ligandi-.</li>
		<li>Dodaj 50 μL roztworu aktywowanych koralików do każdej probówki zawierającej 150 μL roztworu antygenu, zmieszaj wirując i wiruj przez noc w 4 °C.</li>
		<li>Dodaj 500 μL 10 mg/mL BSA, aby zablokować pozostałe reaktywne grupy NH2 na koralikach, i wiruj przez 1 godzinę w 4 °C.</li>
		<li>Wiruj koraliki przez 5 min przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C i zasądź nadstan. Wypłukuj koraliki zimnym 1x PBS jeszcze trzykrotnie.</li>
		<li>Zawieś aktywowane koraliki w 70 μL 1x PBS.</li>
		<li>Aby wyznaczyć końcową koncentrację koralików pokrytych antygenem, rozcieńcz niewielką objętość koralików w PBS (1:200) i zlicz za pomocą hematometru. Następnie przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Koraliki pokryte antygenem nie należy przechowywać dłużej niż miesiąc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie szkiełków pokrytych poli-L-lizyną
	<ol>
		<li>Przed testem aktywacji komórek B za pomocą koralików pokrytych antygenem, przygotuj szkiełka pokryte poli-L-lizyną (PLL-szkiełka). Użyj 50 mL probówki zawierającej 40 mL 0,01% w/v roztworu PLL i zanurz szkiełka o średnicy 12 mm w roztworze. Wiruj przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wypłucz szkiełka 1x PBS i pozostaw do wyschnięcia na 24-dołkowej patelni pokrytej folią parafinową. Przejdź do aktywacji komórek B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja komórek B
	<ol>
		<li>Aby rozpocząć aktywację komórek B za pomocą koralików, najpierw rozcieńcz linię komórek B IIA1.6 do 1,5 x 106 komórek/mL w środowisku CLICK (RPMI-1640 uzupełnionym o 2 mM L-alanino-L-glutaminę + 55 μM beta-merkaptoetanol + 1 mM pirogalakton + 100 U/mL Penicyliny + 100 μg/mL streptomycyny) + 5% ogrzewanego surowicy wołowej inaktywowanej termicznie [FBS]).</li>
		<li>Skombinuj 100 μL (150 000 komórek) komórek B IIA1.6 z koralikami pokrytymi antygenem w proporcji 1:1 w 0,6 mL probówkach. Mieszaj delikatnie wirując i rozsiewaj na PLL-szkiełkach. Inkubatorz przez różne punkty czasowe w inkubatorze komórkowym (37 °C / 5% CO2). Typowe punkty

<ol><li>Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+Acquire+Particulate+Antigen+in+a+Macrophage-Rich+Area+at+the+Boundary+between+the+Follicle+and+the+Subcapsular+Sinus+of+the+Lymph+Node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node.</a> Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).</li>
<li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+who%2C+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li>
<li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+nucleation+at+the+centrosome+controls+lymphocyte+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li>
<li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+antigen+extraction+in+the+B+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse.</a> Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).</li>
<li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+Receptor-Mediated+Antigen+Gathering+Requires+Ubiquitin+Ligase+Cbl+and+Adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+Recruit+Dynein+to+the+Signaling+Microcluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster.</a> Immunity. , (2011).</li>
<li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap1+%E2%80%93+cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).</li>
<li>Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+ligand+discrimination+through+a+spreading+and+contraction+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response.</a> Science. 312 (5774), 738-741 (2006).</li>
<li>Vascotto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-based+motor+protein+myosin+II+regulates+MHC+class+II+trafficking+and+BCR-driven+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation.</a> Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).</li>
<li>Reversat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+Par3+controls+B-cell+receptor+dynamics+and+antigen+extraction+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse.</a> Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).</li>
<li>Lankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Compartments+during+B+Cell+Receptor%E2%80%93mediated+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).</li>
<li>Duchez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Polarization+of+T+and+B+Cells+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse.</a> The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).</li>
<li>Pérez-Montesinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+intracellular+association+of+selected+rab+small+GTPases+with+MHC+class+II+and+DM+during+dendritic+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation.</a> Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).</li>
<li>Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk-dependent+Actin+Dynamics+Regulate+Endocytic+Trafficking+and+Processing+of+Antigens+Internalized+through+the+B-Cell+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor.</a> Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).</li>
<li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+Isolation+of+Centrosomes+from+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).</li>
<li>Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+centrosomes+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of centrosomes from mammalian cell lines.</a> Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).</li>
<li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vamp-7%E2%80%93dependent+secretion+at+the+immune+synapse+regulates+antigen+extraction+and+presentation+in+B-lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).</li>
<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Events+in+B+Cell+Activation+BCR%3A+B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor.</a> Annual Review of Immunology. , (2010).</li>
<li>Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+use+conserved+polarity+cues+to+regulate+their+antigen+processing+and+presentation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.

Opisujemy kompleksową metodę badania, w jaki sposób limfocyty B reorganizują swoją wewnątrzkomórkową architekturę, aby wspierać tworzenie IS. Badanie to obejmuje zastosowanie technik obrazowania do ilościowego określenia dystrybucji organelli wewnątrz komórki, takich jak centrosomy, aparat Golgiego i lizosomy podczas aktywacji limfocytów B oraz ich polaryzacji do IS. Dodatkowo opisujemy biochemiczną metodę badania zmian w składzie centrosomy po aktywacji limfocytów B.
Aby wspierać tworzenie IS...

Limfocyty B są istotnym elementem układu odpornościowego adaptacyjnego, odpowiedzialnym za produkcję przeciwciał przeciwko różnym zagrożeniom i najeżdżającym patogenom. Skuteczność produkcji przeciwciał zależy od zdolności komórek B do pozyskiwania, przetwarzania i prezentacji antygenów spotykanych w postaci rozpuszczalnej lub związanych na powierzchni1,2. Rozpoznanie antygenów związanych z powierzchnią komórki prezentującej przez receptor przeciwciałowy (BCR) prowadzi do powstania ścisłego kontaktu międzykomórkowego, zwanego interfejsem immunologicznym (IS)3,4. Wewnątrz tej dynamicznej platformy ma miejsce zarówno zależne od BCR przekazywanie sygnałów w dół, jak i internalizacja antygenów do komórtek endolizosomowy. Przechwycone antygeny są przetwarzane i montowane na cząsteczkach MHC klasy II, a następnie prezentowane limfocytom T. Produktywne interakcje B-T, zwane współpracą komórek B-T, pozwalają limfocytom B na otrzymanie odpowiednich sygnałów, które sprzyjają ich różnicowaniu się w komórki plazmatyczne produkujące przeciwciała lub komórki pamięci8.
Dwa mechanizmy są zaangażowane w ekstrakcję antygenów przez limfocyty B. Pierwszy polega na wydalaniu proteaz pochodzących z lizosomu, które ulegają rekrutacji i fuzji w szczelinie synaptycznej5,6. Drugi zależy od sił ciągnięcia wywołanych przez Myozynę IIA, które wywołują wgłębienie membran zawierających antygen, które są internalizowane do zanurzonych w klatrynie kopców7. Sposób ekstrakcji antygenów zależy od właściwości fizycznych membrany, w której znajdują się antygeny. Niemniej, w obu przypadkach, limfocyty B przechodzą dwie główne reorganizacje: reorganizację cytoszkieletu aktynowego i polaryzację organelli do IS. Reorganizacja cytoszkieletu aktynowego obejmuje początkową fazę rozprzestrzeniania, w której aktyna-zależne wypustki na błonie synaptycznej zwiększają powierzchnię w kontakcie z antygenem. Następuje to faza kurczenia, w której BCR związane z antygenami są skoncentrowane w centrum IS dzięki zgodnej akcji motorów molekularnych i reorganizacji cytoszkieletu aktynowego8,9,10,11. Polaryzacja organelli również opiera się na reorganizacji cytoszkieletu aktynowego. Na przykład, centrosoma zostaje odłączona od jądra poprzez lokalną depolimeryzację skojarzonej aktyny, co pozwala na przemieszczenie tej organelli do IS5,12. U limfocytów B, przemieszczenie centrosomy do jednego zbiega komórki (IS) prowadzi do rekrutacji lizosomy do błony synaptycznej, które po wydzielaniu mogą ułatwić ekstrakcję i/lub przetwarzanie antygenów związanych z powierzchnią6. Lizosomy zrekrutowanej w IS są wzbogacone w MHC klasy II, co sprzyja formowaniu kompleksów peptyd-MHC-II w komórkach endosomalnych do prezentacji limfocytom T13. Dodatkowo, aparat Golgiego również obserwowano jako blisko rekrutowany do IS14, co sugeruje, że wezykuły pochodzące z Golgiego z szlaku wydzielniczego mogą być zaangażowane w ekstrakcję i/lub przetwarzanie antygenów.
W sumie, wewnątrzkomórkowe przekształcenia organelli i cytoszkieletu w limfocytach B podczas formowania synapsy są kluczowymi krokami, które umożliwiają efektywne pozyskiwanie i przetwarzanie antygenów wymagane do dalszej ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące wykonywania obrazowania i analizy biochemicznej w limfocytach B w celu badania wewnątrzkomórkowego przekształcania organelli związanych z formowaniem IS. Te techniki obejmują: (i) immunofluorescencje i analizę obrazów limfocytów B aktywowanych kulkami pokrytymi antygenem i na pokrytych antygenem szkiełkach, co pozwala na wizualizację i ilościową ocenę komponentów wewnątrzkomórkowych, które są mobilizowane do IS oraz (ii) izolację frakcji wzbogaconych w centrosomy w limfocytach B poprzez ultrawirowanie na gradientach sacharozy, co pozwala na identyfikację białek związanych z centrosomami, potencjalnie zaangażowanych w regulację polaryzacja komórki.

<table><tbody><tr><td>IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without Fc&gamma;IIR</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular</td><td>Marienfield-Superior</td><td>111500</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG&nbsp;</td><td>LifeTech&nbsp;</td><td>A21206</td><td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit &nbsp;IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A-11071</td><td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A21238</td><td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program L-013 used</td></tr><tr><td>Amino- Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>14307D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pericentrin</td><td>&nbsp;Abcam</td><td>ab4448&nbsp;</td><td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td></tr><tr><td>Anti-rab6</td><td>Abcam</td><td>ab95954</td><td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td></tr><tr><td>Anti-sec61</td><td>Abcam</td><td>ab15575</td><td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td></tr><tr><td>BSA</td><td>&nbsp;Winkler</td><td>&nbsp;BM-0150</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Winkler</td><td>CA-0520</td><td></td></tr><tr><td>Culture plate T25</td><td>BD</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Fiji Software</td><td>Fiji col.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7651&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Winkler&nbsp;</td><td>BM-0820</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-005-003</td><td>IIA1.6 positive ligand</td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31186</td><td>IIA1.6 negative ligand</td></tr><tr><td>HyClone Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Winkler</td><td>PO-1260</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Winkler</td><td>SO-1455</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope</td><td>&nbsp;Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>M</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td>Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>Polybead Amino Microspheres 3.00&mu;m</td><td>Polyscience</td><td>17145-5</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>Dilute with sterile water</td></tr><tr><td>Rabbit anti- alpha tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>1:1000 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Rabbit anti mouse lamp1 antibody</td><td>Cell signaling</td><td>3243</td><td>1:200 dilution recomended but should be optimized</td></tr><tr><td>Rabbit anti-cep55&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab170414</td><td>1:500 dilution recomended but should be optimized</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody</td><td>&nbsp;Abcam</td><td>ab16504</td><td>&nbsp;1:1000 for Western Blot</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-104-1A</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>&nbsp;Merck</td><td>558255</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Winkler&nbsp;</td><td>SA-1390&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>&nbsp;Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Tube 50 ml</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie dynamiki organelli w komórkach b podczas formowania się synapsy immunologicznej

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Rozpoznanie antygenów związanych z powierzchnią przez receptor komórek B (BCR) wyzwala powstanie synapsy odpornościowej (IS), gdzie zarówno sygnalizacja jak i przyjmowanie antygenu są skoordynowane. Powstawanie IS wymaga dynamicznej reorganizacji aktyny towarzyszącej spolaryzowanemu rekrutowaniu do błony synaptycznej centrum komórkowego i powiązanych organelli wewnątrzkomórkowych, takich jak lizozomy i aparat Golgiego. Wczesne etapy reorganizacji aktyny pozwalają komórkom B zwiększyć powierzchnię komórki i zmaksymalizować ilość kompleksów antygen-BCR gromadzonych w synapsie. W pewnych warunkach, gdy komórki B rozpoznają antygeny związane z sztywnymi powierzchniami, proces ten jest sprzężony z lokalnym rekrutowaniu i sekrecją lizozomów, które mogą ułatwić ekstrakcję antygenu. Przyjęte antygeny są internalizowane do specjalizowanych kompartmentów endo-lizosomalnych w celu przetworzenia na peptydy, które są ładowane na cząsteczki kompleksu głównej zgodności tkankowej II (MHC-II) do dalszej prezentacji limfocytom T pomocniczym. Dlatego badanie dynamiki organelli związanej z tworzeniem IS jest kluczowe dla zrozumienia, w jaki sposób aktywowane są komórki B. W niniejszym artykule omówimy zarówno obrazowanie, jak i technikę biochemiczną stosowaną do badania zmian w pozycji organelli wewnątrzkomórkowych i przemieszczenia cytoszkieletu, które są związane z tworzeniem IS w komórkach B.

Niniejszy artykuł pokazuje, jak komórki B można aktywować za pomocą unieruchomionego antygenu na kulkach lub pokrywach szkieletowych w celu wywołania formowania się IS. Przedstawiamy informacje o tym, jak zidentyfikować i określić liczbowo polaryzację różnych organelli za pomocą immunofluorescencji oraz jak scharakteryzować białka, które ulegają dynamicznym zmianom w ich skojarzeniu z centrosomom, które polaryzuje się do IS, stosując podejście biochemiczne.
<p class="jove_content" fo:...

Poniżej opisano dwa podejścia do charakteryzacji zdarzeń polaryzacji komórkowej w limfocytach B podczas formowania IS. Pierwsze obejmuje ilościową analizę rekrutacji organelli i reorganizacji cytoszkieletu w błonie synaptycznej. Drugie to podejście biochemiczne, którego celem jest charakterystyka zmian w składzie centrosomy, która ulega polaryzacji w synapsie immunologicznej.

Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas formowania się synapsy immunologicznej

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

W tej recenzji omówimy zarówno techniki obrazowania, jak i biochemiczne stosowane do badania pozycjonowania i składu organelli, a także przekształceń cytoszkieletu obserwowanych podczas formowania synapsy immunologicznej. Wczesne etapy aktywnej remodelacji pozwalają limfocytom B zwiększyć powierzchnię komórki i zmaksymalizować ilość kompleksów antygen-BCR gromadzonych w synapsie. Z drugiej strony, lokalne rekrutowanie lizosomów, wraz z centrosomowym na błonie synaptycznej, może być sprzężone z sekrecją lizosomu, która jest znana z ułatwiania ekstrakcji unieruchomionych antygenów.Pochłonięty antygen jest następnie przetwarzany w śródplazmatycznych przegrodach lizosomalnych na peptydy, które są ładowane na cząsteczki MHC klasy II w celu prezentacji komórkom T pomocniczym. Dlatego też, badanie dynamiki organelli związanych z synapsą immunologiczną jest kluczowe dla zrozumienia, jak limfocyty B są w pełni aktywowane. Immunofluorescencja limfocytów B aktywowanych za pomocą unieruchomionych antygenów pozwala śledzić różne komponenty komórki i jak mogą być one rekrutowany do synapsy immunologicznej.Limfocyty B mogą być aktywowane przez unieruchomione antygeny na powierzchni kulki lub nakrywki. Kulki pokryte antygenem przygotowuje się poprzez inkubację specyficznych ligandów z kulamkami aminowymi wcześniej poddanymi obróbce glutaraldehydem w celu aktywacji grup aminowych. Resuspenduj aktywowane kulki w 100 mikrolitrach PBS i wymieszaj.Tymczasem przygotuj roztwór antygenu, dodając 100 mikrograma na mL ligandu BCR w 150 mikrolitrach PBS. Następnie dodaj 50 mikrolitrów aktywowanych kulek do roztworu antygenu i inkubatuj przez noc w czterech stopniach Celsjusza. Pamiętaj, użyj również niezwiązanego ligandu jako ujemnej kontroli.Po inkubacji, przemyj kulki w PBS. Odsącz nadstan i zastąp PBS. Powtórz trzy razy.Następnie zablokuj trzy grupy aminowe resuspendują kulki w 500 mikrolitrach roztworu BSA. Wreszcie resuspenduj kulki w 70 mikrolitrach PBS. Aby obliczyć końcową koncentrację, możesz użyć hemocytometru do zliczenia kulek.Do aktywacji limfocytów B użyj 50 mL probówki i resuspenduj komórki w koncentracji 1,5 miliona na mL w CLICK uzupełnionym o 5% surowicy wołowej płodowej. Następnie dodaj 150 000 limfocytów B, co odpowiada 100 mikrolitrom mieszanki komórek i kulek do pokrywki pokrytej poli-L-lizynę i inkubatuj w 37 stopniach na różne punkty czasowe. Drugie podejście do aktywacji limfocytów B to ich zasiew na pokrywkach pokrytych antygenem.W tym celu pokryj szklanki przeciwciałami przeciwko BCR i B220, co poprawia przyleganie komórek. Przygotuj roztwór antygenu, dodając przeciwciała przeciwko BCR i B220 w PBS do końcowej koncentracji 10 mikrograma na mL i 0,5 mikrograma na mL odpowiednio. Następnie umieść pokrywkę na pokrywie 24-dołkowej płytki pokrytej parafilmem i dodaj 40 mikrolitrów roztworu antygenu.Zatnij płytkę i następnie inkubatuj w 4 stopniach przez noc. Aby rozpocząć aktywację na pokrywkach, najpierw przemyj je w PBS i pozwól im wyschnąć przez kilka minut. Następnie dodaj 150 000 limfocytów B i inkubatuj w 37 stopniach na różne punkty czasowe.W obu przypadkach, podczas aktywacji za pomocą kulek lub pokrywek pokrytych antygenem, zalecamy rozpoczęcie od najdłuższego punktu czasowego, a następnie przejście do krótszych. Gdy już umieścisz suchą pokrywkę na szklanym slajdzie, możesz użyć mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, aby obejrzeć swoje próbki, w zależności od wymaganej rozdzielczości. Skup się na próbce używając światła przepuszczonego.Powinieneś szukać pól, gdzie komórki i kulki współdziałają w proporcji jeden do jednego. W przypadku limfocytów B aktywowanych na pokrywkach pokrytych antygenem, użyj obiektywu 100x dla lepszej rozdzielczości. Pod względem parametrów, rozważ zrobienie z-stacku, który obejmuje całą komórkę.Możesz oznaczyć aktynę, aby wyznaczyć dolne i górne granice komórki. W przypadku limfocytów B aktywowanych za pomocą kulek pokrytych antygenem i oznakowanych na jeden punkt, najpierw wyznacz dwa obszary: obszar komórki i obszar kulki. Następnie zidentyfikuj pozycję lub organellę za pomocą punktu i uzyskaj jej współrzędne lokalizacji.Narysuj dwa wektory: jeden między centrum komórki a organolem, a drugi między centrum komórki a centrum kulki. Zmierzyj długość obu i zmierzyj kąt między dwoma wektorami, teraz określany jako alfa. Zrób projekcję z wektorem między centrosomowym a centrum komórki używając Guassiana alfy, a następnie oblicz wskaźnik polaryzacji organelli przez podzielenie rzutowanego wektora, a, przez b.Tak więc wskaźnik polaryzacji między zero a jednym wskazuje na polaryzowany fenotyp. Wartości między zero a minus jednym wskazują na fenotyp niepolaryzowany. Aby określić wskaźnik polaryzacji dla bardziej rozproszonych organelli, takich jak lizosomy, możesz użyć tego samego algorytmu wspomnianego wcześniej, zmieniając współrzędne lokalizacji organelli na współ

studying-organelle-dynamics-in-b-cells-during-immune-synapse-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Bello-Gamboa, A. et al., Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej.J. Vis. Exp.(2019 rok) Ten film demonstruje badanie in vitro tworzenia synaps immunologicznych między komórką prezentującą antygen a limfocytami T pomocniczymi za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Receptory limfocytów T pomocniczych oddziałują z kompleksem antygenu-MHC-II w komórkach prezentujących antygen i tworzą synapsy immunologiczne, po których następują ruchy pęcherzyków wydzielniczych w kierunku synapsy, co...

Tworzenie synaps immunologicznych między limfocytami T pomocniczymi a komórkami prezentującymi antygen

W tym filmie opisujemy metodę badania dynamiki organelli w limfocytach B po ich aktywacji za pomocą mikrogranulek pokrytych antygenem.

Dynamika organelli w limfocytach B po aktywacji kulkami pokrytymi antygenem

Ten film pokazuje aktywację limfocytów B in vitro. Proces ten obejmuje interakcję antygenu z receptorami komórek B, prowadzącą do przebudowy cytoszkieletu, tworzenia synaps immunologicznych, ruchu lizosomów, internalizacji antygenu, przetwarzania, a następnie prezentacji na cząsteczkach MHC w celu aktywacji komórek B.

Aktywacja limfocytów B na szkiełku nakrywkowym pokrytym antygenem

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Tutaj ilustrujemy protokół obrazowania za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED, cytotoksycznej synapsy immunologicznej komórek NK rekapitulowanej na szkle. Za pomocą tej metody uzyskujemy rozdzielczość sub-100 nm białek synapsy i cytoszkieletu.

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Poznaj techniki obrazowania i biochemiczne do badania dynamiki organelli w limfocytach B podczas tworzenia synaps immunologicznych. Te metody pozwalają zrozumieć mechanizmy aktywacji komórek B.

Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas formowania się synapsy immunologicznej

Przeglądaj więcej filmów