Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T

Nasz protokół opisuje modyfikację genetyczną komórek CAR-T podczas ich produkcji za pomocą technologii CRISPR w celu wytworzenia bardziej skutecznego i mniej toksycznego produktu. Zaletą tej techniki jest to, że zarówno produkcja komórek CAR-T, jak i manipulacja genetyczna mogą zachodzić w jednej komórce z dobrą wydajnością. Procedurę zademonstrują Rosalie Sterner, doktorantka medycyny medycyny i doktorantka, Michelle Cox, technolog i doktorantka oraz Reona Sakemura, doktorantka z mojego laboratorium.

Po wyizolowaniu limfocytów T z pobranych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej rozpocznij ich hodowlę, najpierw przygotowując pożywkę z komórek T, a następnie sterylizując ją, filtrując przez sterylny filtr próżniowy o średnicy 0,45 mikrometra, a następnie sterylny filtr próżniowy o sterylnym rozmiarze 0,22 mikrometra. W dniu stymulacji limfocytów T lub dniu zero, przed stymulacją, umyj kulki CD3/CD28, umieszczając wymaganą objętość kulek w sterylnej 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej i ponownie zawieszając w jednym mililitrze TCM. Umieść rurkę w kontakcie z magnesem na jedną minutę.

Następnie odessać TCM i ponownie zawiesić w jednym mililitrze świeżego TCM, aby ponownie umyć kulki i powtórzyć w sumie trzy prania. I na koniec ponownie zawieś koraliki w jednym mililitrze TCM. Po policzeniu limfocytów T przenieś kulki do limfocytów T w stosunku trzy do jednego koralika na komórki.

Następnie rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia miliona komórek na mililitr i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 przez 24 godziny. Po uzyskaniu konstruktu CART19 w wektorze lentiwirusowym, należy przeprowadzić produkcję lentiwirusa, najpierw inkubując plazmid lentiwirusowy, wektor opakowania, wektor otoczki, odczynnik wstępnego kompleksowania, odczynnik do transfekcji i pożywkę do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Prace lentiwirusowe należy wykonywać przy użyciu środków ostrożności BSL2+, w tym kapturów do hodowli komórkowych, środków ochrony osobistej i dezynfekcji zużytych materiałów wybielaczem przed utylizacją.

Po inkubacji dodaj te odczynniki do transfekcji do 293 limfocytów T, które osiągnęły konfluencję od 70 do 90% i hoduj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po 24 i 48 godzinach od transfekcji, zebrać, odwirować, przefiltrować i zagęścić supernatant zawierający wirusa przez ultrawirowanie i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Pierwszego dnia delikatnie ponownie zasmów limfocyty T, które zostały stymulowane na poziomie miliona komórek na mililitr w dniu zero, aby rozbić rozety komórek.

Przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności BSL2 + dodać świeżego lub mrożonego zebranego wirusa do symulowanych limfocytów T przy wielokrotności infekcji 3,0. Kontynuuj inkubację transdukowanych limfocytów T w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. W trzecim i piątym dniu policz komórki CAR-T i dodaj do hodowli świeży, wstępnie podgrzany TCM, aby utrzymać stężenie komórek CAR-T na poziomie miliona komórek na mililitr.

Sześć dni po symulacji usuń kulki z transdukowanych limfocytów T, najpierw zbierając i ponownie zawieszając komórki. Przenieś komórki w stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów i umieść probówki w magnesie na jedną minutę. Po zebraniu supernatantu zawierającego komórki CAR-T i odrzuceniu kulek, umieścić komórki z powrotem w hodowli w stężeniu miliona komórek na mililitr w kolbie hodowlanej.

Użyj próbki komórek do cytometrii przepływowej, aby ocenić ekspresję powierzchniową CAR. Inkubuj resztę, aby wznowić ekspansję, a następnie zbierz i zakonserwuj komórki w kriokonserwacji w ósmym dniu, jak opisano w manuskrypcie. Aby zakłócić czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów, należy użyć przewodnika RNA, jak opisano w manuskrypcie.

Inkubować odczynniki do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji dodaj je do 293 limfocytów T, które osiągnęły zbieżność od 70 do 90% i hoduj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2, aby wytworzyć lentiwirusa. Po 24 i 48 godzinach zebrać i zagęścić supernatant zawierający wirusa przez ultrawirowanie w 50-mililitrowych probówkach ultrawirówek i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Następnie pierwszego dnia delikatnie ponownie zawieś limfocyty T, aby rozbić rozety. W laboratorium zatwierdzonym przez BSL2 +, aby wygenerować komórki CAR-T, dodaj lentiwirusa CAR19 i lentiwirusa CRISPR ukierunkowanego na GMCSF do symulowanych limfocytów T. W trzecim i piątym dniu w przypadku pomyślnie transdukowanych limfocytów T edytowanych przez lentiCRISPR wykazujących oporność na puromycynę, należy potraktować komórki dichlorowodorkiem puromycyny w stężeniu jednego mikrograma puromycyny na mililitr.

Sekwencjonowanie pływów zastosowano w celu potwierdzenia zmniejszenia GM-CSF w komórkach CART19 z nokautem GM-CSF ze skutecznością zakłóceń wynoszącą około 71%Wykresy przepływu barwienia powierzchni komórek CAR-T bramkowanych na żywych komórkach CD3-dodatnich pokazują, że zarówno CART19 typu dzikiego, jak i CART19 nokautujący GM-CSF z powodzeniem i w podobny sposób wyrażają receptor powierzchniowy CAR in vitro. Z drugiej strony, wewnątrzkomórkowe barwienie GM-CSF za pomocą cytometrii przepływowej, również bramkowanej na żywych komórkach CD3-dodatnich, wykazuje zmniejszoną ekspresję GM-CSF w komórkach nokautujących w porównaniu z komórkami CART19 typu dzikiego, potwierdzając funkcjonalny sukces nokautu. Szczególną ostrożność należy zachować podczas etapów transdukcji tej procedury, ponieważ są one najbardziej krytyczne dla rozwoju genetycznie zmodyfikowanych komórek CAR-T.

Opisana metodologia może być potencjalnie zastosowana do różnych genów w celu modyfikacji komórek CAR-T za pomocą CRISPR/CAS9, aby pomóc w generowaniu mniej toksycznego i bardziej skutecznego produktu. Technologia CRISPR/CAS9 zapewnia strategie bezpośredniego ukierunkowania na genom komórek CAR-T w celu opracowania rozwiązań dla obecnych niedociągnięć klinicznych.