Name: Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę edycji genetycznej komórek CAR-T za pomocą CRISPR/Cas9 w celu zwiększenia skuteczności i zmniejszenia toksyczności terapii przeciwnowotworowej. Protokół integruje produkcję komórek z manipulacją genetyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty od K12CA090628 (SSK), National Comprehensive Cancer Network (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), Predolin Foundation (SSK), Mayo Clinic Office of Translation to Practice (SSK) oraz Mayo Clinic Medical Scientist Training Program Robert L. Howell Physician-Scientist Scholarship (RMS).

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Kliniki Mayo oraz Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC).
1. Produkcja komórek CART19
<ol>
	<li>Izolacja, stymulacja i hodowla ex-vivo limfocytów T
	<ol>
		<li>Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w kapturze do hodowli komórkowych, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej. Pobieraj jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) z niezidentyfikowanych normalnych stożków krwi dawcy pobranych podczas aferezy, ponieważ wiadomo, że są one realnym źródłem PBMC.13</li>
		<li>Aby wyizolować PBMC, dodaj 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do probówki do separacji gradientu gęstości o pojemności 50 ml. Rozcieńczyć krew dawcy równą objętością soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby uniknąć uwięzienia komórek.
		<ol>
			<li>Dodaj rozcieńczoną krew dawcy ze stożka do probówki separacyjnej, uważając, aby nie naruszyć granicy faz między krwią a ośrodkiem o gradiencie gęstości. Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Zdekantować supernatant do nowego stożka o pojemności 50 ml, przemyć PBS + 2% FBS, doprowadzając do 40 ml, odwirować przy 300 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant, ponownie zawiesić w 40 ml buforu i policzyć komórki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyizoluj limfocyty T z PBMC za pomocą zestawu kulek magnetycznych z selekcją ujemną przy użyciu w pełni zautomatyzowanego separatora komórek zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Aby wyhodować izolowane limfocyty T, przygotuj pożywkę z komórek T (TCM), która składa się z 10% ludzkiej surowicy AB (v / v), 1% penicyliny-streptomycyny-glutaminy (v / v) i pożywki komórek krwiotwórczych bez surowicy. Wysterylizuj pożywkę, filtrując przez sterylny filtr próżniowy 0,45 μm, a następnie sterylny filtr próżniowy 0,22 μm.</li>
		<li>W dniu 0 (dzień stymulacji limfocytów T) umyj kulki CD3/CD28 przed stymulacją limfocytów T. Aby umyć, umieść wymaganą objętość koralików (użyj wystarczającej ilości koralików CD3/CD28 w stosunku 3: 1 kulki : komórki T; należy zauważyć, że stężenie kulek może być zmienne) w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić w 1 ml TCM.</li>
		<li>Miejsce w kontakcie z magnesem.</li>
		<li>Po 1 minutach odessać TCM i ponownie zawiesić w 1 ml świeżego TCM, aby umyć kulki.</li>
		<li>Powtórz tę procedurę, aby uzyskać łącznie trzy prania.</li>
		<li>Po trzecim praniu ponownie zawieś kulki w 1 ml TCM.</li>
		<li>Policz limfocyty T.</li>
		<li>Przenieś koraliki do komórek T w stosunku 3: 1 kulki: komórki.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja i transdukcja limfocytów T
	<ol>
		<li>Prace lentiwirusowe należy wykonywać przy użyciu środków ostrożności BSL-2+, w tym kapturów do hodowli komórkowych, środków ochrony osobistej i dezynfekcji zużytych materiałów wybielaczem przed utylizacją.</li>
		<li>Uzyskaj konstrukt CART19 w wektorze lentiwirusowym. 
		UWAGA: Zastosowany tutaj konstrukt CART19 został zaprojektowany, a następnie zsyntetyzowany de novo przy użyciu dostępnego na rynku dostawcy syntezy białek. Konstrukt CAR został następnie sklonowany do lentiwirusa trzeciej generacji pod kontrolą promotora EF-1α. Fragment regionu zmiennej pojedynczego łańcucha pochodzi z klonu FMC63 i rozpoznaje ludzki CD19. Konstrukt CAR19 posiada domenę kostymulacyjną 4-1BB drugiej generacji i stymulację CD3ζ (FMC63-41BBz). 12</li>
		<li>Przeprowadzić produkcję lentiwirusa zgodnie z wcześniejszym opisem. 12
		<ol>
			<li>Krótko mówiąc, do produkcji lentiwirusa należy wykorzystać komórki 293T, które osiągnęły 70-90% konfluencji.</li>
			<li>Pozostawić na 30 minut inkubację w temperaturze pokojowej odczynników do transfekcji, w tym 15 μg plazmidu lentiwirusowego będącego przedmiotem zainteresowania, 18 μg wektora opakowania gag/pol/tat/rev, 7 μg wektora otoczki VSV-G, 111 μl odczynnika do wstępnego kompleksowania, 129 μl odczynnika do transfekcji i 9,0 ml pożywki do transfekcji przed dodaniem do komórek 293T. Następnie hoduj transfekowane komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
			<li>Zebrać, odwirować (900 x g przez 10 min), przefiltrować (filtr nylonowy 0,45 μM) i zagęścić supernatant po 24 i 48 godzinach przez ultrawirowanie przy 13 028 x g przez 18 godzin lub 112 700 x g przez 2 godziny.</li>
			<li>Zamrażać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W dniu 1 delikatnie ponownie zawiesić limfocyty T, aby rozbić rozety limfocytów T, które zostały stymulowane przy 1 x 106 / ml w dniu 0.</li>
		<li>Przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności BSL-2 + dla wszystkich prac lentiwirusowych, dodaj świeży lub mrożony zebrany wirus do stymulowanych limfocytów T przy wielokrotności infekcji (MOI) 3,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozbudowa komórek CAR-T
	<ol>
		<li>W fazie ekspansji kontynuować inkubację transdukowanych limfocytów T w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Policz komórki CAR-T w 3 i 5 dniu i dodaj świeży, wstępnie ogrzany TCM do hodowli, aby utrzymać stężenie komórek CAR-T na poziomie 1 x 106/ml.</li>
		<li>Usuń kulki z transdukowanych limfocytów T 6 dni po stymulacji (dzień 6) za pomocą magnesu. Zbierz, ponownie zawieś i umieść limfocyty T w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml w magnesie na 1 minutę. Następnie zebrać supernatant (zawiera komórki CAR-T) i wyrzucić kulki.</li>
		<li>Umieść zebrane komórki CAR-T z powrotem w hodowli w stężeniu 1 x 106 komórek/ml, aby wznowić ekspansję.</li>
		<li>W dniu 6 ocenić ekspresję powierzchniową CAR za pomocą cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Do wykrywania ekspresji powierzchniowej CAR można zastosować kilka metod, takich jak barwienie kozim przeciwciałem wtórnym anty-mysim IgG (H+L) adsorbowanym krzyżowo lub barwienie peptydem specyficznym dla CD19, sprzężonym z fluorochromem. Tutaj weź podwielokrotność (około 100 000 limfocytów T) z hodowli i przemyj buforem przepływowym przygotowanym z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco, 2% płodowej surowicy bydlęcej i 1% azydku sodu. Wybarwić komórki przeciwciałem anty-CAR i umyć dwukrotnie. Wybarwić komórki żywym/martwym barwnikiem i przeciwciałem monoklonalnym CD3 (OKT3). Umyć komórki i ponownie zawiesić w buforze przepływowym. Pobrać na cytometr, aby określić wydajność transdukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwacja komórek CAR-T
	<ol>
		<li>Aby pobrać i kriokonserwować komórki CAR-T 8 dni po stymulacji (8 dzień ekspansji limfocytów T), należy pobrać komórki z hodowli.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
		<li>Zawiesić w pożywce zamrażającej w ilości 10 milionów komórek na ml na fiolkę w pożywce zamrażającej składającej się z 10% dimetylosulfotlenku i 90% płodowej surowicy bydlęcej.</li>
		<li>Zamrozić w pojemniku zamrażającym do osiągnięcia szybkości chłodzenia -1 °C/min w zamrażarce o temperaturze -80 °C, a następnie po 48 godzinach przenieść do ciekłego azotu.</li>
		<li>Przed użyciem do eksperymentów in vitro lub in vivo należy rozmrozić komórki CAR-T w ciepłym TCM.</li>
		<li>Umyj komórki w celu rozcieńczenia i usunięcia dimetylosulfotlenku i ponownie zawieś do stężenia 2 x 106 komórek/ml w ciepłym TCM. Odpocząć przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Produkcja GM-CSF k/o CART19
<ol>
	<li>Aby zakłócić GM-CSF, należy wykorzystać przewodnik RNA (gRNA) ukierunkowany na ekson 3 ludzkiego GM-CSF (CSF2) wybrany za pomocą przesiewowych gRNA, o których wcześniej doniesiono, że mają wysoką skuteczność dla genu CSF2, który koduje ludzką cytokinę GM-CSF. 14 
	UWAGA: Użyto komercyjnie zsyntetyzowanego konstruktu lentiwirusowego trzeciej generacji Cas9 klasy badawczej zawierającego to gRNA (pod promotorem U6). Konstrukt zawiera gen oporności na puromycynę. Sekwencja gRNA to GACCTGCCTACAGACCCGCC. 12</li>
	<li>Do produkcji lentiwirusa wykorzystaj komórki 293T, które osiągnęły 70-90% konfluencji.</li>
	<li>Pozostawić 15 μg plazmidu lentiwirusowego będącego przedmiotem zainteresowania, 18 μg wektora opakowania gag/pol/tat/rev, 7 μg wektora otoczki VSV-G, 111 μl odczynnika do wstępnego kompleksowania, 129 μl odczynnika do transfekcji i 9,0 ml pożywki do transfekcji do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj odczynniki do transfekcji do komórek 293T. Następnie hodowla w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zebrać, odwirować (900 x g przez 10 min), przefiltrować (filtr nylonowy 0,45 μM) i zagęścić supernatant po 24 i 48 godzinach przez ultrawirowanie w temperaturze 13 028 x g przez 18 godzin lub 112 700 x g przez 2 godziny i zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>W dniu 1 delikatnie ponownie zawieś limfocyty T, aby rozbić rozety.</li>
	<li>W laboratorium zatwierdzonym przez BSL-2+ dodaj zamrożonego lub świeżo zebranego wirusa do stymulowanych limfocytów T, aby wytworzyć komórki CAR-T. Transdukuj limfocyty T zarówno lentiwirusem CAR19, jak i GM-CSF ukierunkowanym na lentiwirusa CRISPR. Dodaj lentiwirusa CAR19 przy MOI 3. Ponieważ miareczkowanie lentiwirusa CRISPR nie było możliwe, należy użyć cząstek wirusa wygenerowanych z preparatu plazmidu 15 ug do transdukcji 10 x 106 limfocytów T.</li>
	<li>Zobacz pozostałe etapy stymulacji, ekspansji i kriokonserwacji limfocytów T, jak omówiono w kroku 1.</li>
	<li>W przypadku limfocytów T edytowanych przez lentiCRISPR wykazujących oporność na puromycynę, należy potraktować komórki dichlorowodorkiem puromycyny w stężeniu 1 μg puromycyny na 1 ml w dniu 3 i dniu 5 .</li>
</ol>
3. Skuteczność zakłóceń GM-CSF i ocena funkcjonalna GM-CSF k/o CART19
<ol>
	<li>Efektywność zakłóceń GM-CSF: śledzenie indeli przez sekwencjonowanie i analizę rozkładu (TIDE)
	<ol>
		<li>Aby zsekwencjonować ekson będący przedmiotem zainteresowania w genie GM-CSF, użyj następujących starterów. Użyj sekwencji startera do przodu dla GM-CSF (CSF2) TGACTACAGAGAGGCACAGA i odwrotnej sekwencji startera TCACCTCTGACCTCATTAACC.</li>
		<li>Ekstrakcja DNA z maksymalnie 5 milionów komórek CAR-T za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowej. Do reakcji PCR należy użyć 25 μl mastermixu Taq na reakcję z końcowym stężeniem każdego startera w reakcji PCR μM, 0,1-0,5 μg matrycy DNA i całkowitą objętością reakcji PCR przyniesioną do 50 μl wodą wolną od nukleaz.</li>
		<li>Patrz warunki cykliczne PCR opisane w Tabeli 1.</li>
		<li>Próbki PCR należy przeprowadzić na 1-2% żelu agarozowym pod napięciem 100 V przez 30 minut i ekstrahować za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.</li>
		<li>Sekwencja amplikonów PCR. Oblicz częstotliwość modyfikacji alleli, przesyłając surowe dane do odpowiedniego oprogramowania TIDE. 15</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja GM-CSF i ocena funkcjonalna GM-CSFk/o CART19
	<ol>
		<li>Aby określić produkcję cytokin w komórkach CAR-T, należy inkubować komórki CART19 typu dzikiego i GM-CSFk / o CART19 z linią komórkową CD19 wyrażającą ostrą białaczkę limfoblastyczną NALM6 w stosunku 1:5 przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w obecności roztworu monenzyny, anty-ludzkiego CD49d, anty-ludzkiego CD28 i anty-ludzkiego CD107a.</li>
		<li>Zbierz komórki z hodowli do cytometrii przepływowej. Przemyć komórki buforem do cytometrii przepływowej. Zabarwić komórki za pomocą zestawu do barwienia żywych/martwych. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Utrwalić komórki pożywką utrwalającą i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Po umyciu wybarwić komórki wewnątrzkomórkowo pożywką przepuszczalną w połączeniu z przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzkim IFNγ, anty-ludzkim GM-CSF, anty-ludzkim MIP-1β, anty-ludzkim IL-2 i anty-ludzkim CD3 i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min. Umyć i ponownie zawiesić próbki. Pobrać próbki na cytometrze przepływowym i przeanalizować je pod kątem procentowej zawartości wewnątrzkomórkowej ekspresji GM-CSF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK jest wynalazcą patentów w dziedzinie terapii limfocytami T CAR, na które firma Novartis jest licencjonowana (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis). Badania te zostały częściowo sfinansowane z grantu Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS i SSK są wynalazcami patentów związanych z tą pracą. Laboratorium (SSK) otrzymuje dofinansowanie od firm Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys i Actinium.

W niniejszym raporcie opisujemy metodologię wykorzystania technologii CRISPR/Cas9 do indukowania wtórnych modyfikacji w komórkach CAR-T. W szczególności wykazano to za pomocą transdukcji lentiwirusowej z wektorem wirusowym, który zawiera gRNA ukierunkowane na gen zainteresowania i Cas9 w celu wytworzenia komórek GM-CSFk/o CART19. Wcześniej wykazaliśmy, że neutralizacja GM-CSF poprawia CRS i NT w modelu ksenoprzeszczepu. 12 Jak opisano wcześniej, komórki GM-CSFk/o CAR-T pozwal...

Terapia komórkowa z chimerycznym receptorem antygenowym T (CAR-T) jest bardzo obiecująca w leczeniu raka. 1,2 Dwie terapie komórkowe CAR-T ukierunkowane na CD19 (CART19) zostały niedawno zatwierdzone w Stanach Zjednoczonych i Europie do stosowania w nowotworach złośliwych komórek B po uzyskaniu imponujących wyników w wieloośrodkowych badaniach klinicznych. 3,4,5 Barierami dla szerszego stosowania komórek CAR-T są ograniczona aktywność w guzach litych i związane z nimi toksyczności, w tym zespół uwalniania cytokin (CRS) i neurotoksyczność (NT). 3,5,6,7,8,9 Aby zwiększyć indeks terapeutyczny terapii komórkowej CAR-T, narzędzia inżynierii genomu, takie jak nukleazy palca cynkowego, TALEN-y i CRISPR, są wykorzystywane do dalszej modyfikacji komórek CAR-T w celu wygenerowania mniej toksycznych lub bardziej efektywnych komórek CAR-T. 10,11
W tym artykule opisujemy metodę generowania komórek CAR-T edytowanych metodą CRISPR/Cas9. Szczególnym celem tej metody jest genetyczna modyfikacja komórek CAR-T podczas produkcji komórek CAR-T za pomocą CRISPR/Cas9 w celu wytworzenia mniej toksycznych lub bardziej efektywnych komórek CAR-T. Uzasadnienie dla opracowania tej metodologii opiera się na wnioskach wyciągniętych z doświadczeń klinicznych w zakresie terapii komórkami CAR-T, co wskazuje na pilną potrzebę opracowania nowych strategii w celu wydłużenia okna terapeutycznego terapii komórkami CAR-T i rozszerzenia jej zastosowania na inne nowotwory, a także jest wspierane przez ostatnie postępy w biologii syntetycznej, które umożliwiają wielokrotne modyfikacje komórek CAR-T, które zaczęły wchodzić do praktyki klinicznej. Podczas gdy kilka narzędzi inżynierii genomu jest opracowywanych i stosowanych w różnych środowiskach, takich jak nukleazy palca cynkowego, TALEN-y i CRISPR, nasza metodologia opisuje modyfikację komórek CAR-T za pomocą CRISPR/Cas9. 10,11 CRISPR/Cas9 to bakteryjny mechanizm obronny oparty na RNA, który ma na celu eliminację obcego DNA. CRISPR opiera się na endonukleazach do rozszczepiania sekwencji docelowej zidentyfikowanej przez przewodnik RNA (gRNA). Edycja CRISPR komórek CAR-T ma kilka zalet w porównaniu z innymi narzędziami inżynierii genomu. Należą do nich precyzja sekwencji gRNA, prostota projektowania gRNA ukierunkowanego na gen będący przedmiotem zainteresowania, wysoka wydajność edycji genów oraz możliwość celowania w wiele genów, ponieważ wiele gRNA może być używanych w tym samym czasie.
Konkretnie w opisanych tutaj metodach, użyliśmy lentiwirusa kodującego RNA przewodnika CRISPR i Cas9 do zakłócenia genu podczas transdukcji limfocytów T przez CAR. Wybierając odpowiednią technikę edycji komórek CAR-T, sugerujemy, że opisana tutaj technika jest skutecznym mechanizmem generowania komórek CAR-T klasy badawczej, ale ponieważ długoterminowy efekt trwałej integracji Cas9 z genomem jest nieznany, proponujemy tę metodologię w celu opracowania komórek CAR-T klasy badawczej typu proofof concept, ale nie w celu produkcji komórek CAR-T klasy zgodnej z dobrą praktyką produkcyjną.
W szczególności, tutaj opisujemy generowanie komórek CAR-T stymulujących tworzenie komórek CAR-T czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) skierowanych na ludzką CD19. Te komórki CAR-T zostały wygenerowane przez transdukcję z cząstkami lentiwirusa kodującymi przewodnik RNA specyficzny dla GM-CSF (nazwa genu CSF2) i Cas9. Wcześniej odkryliśmy, że neutralizacja GM-CSF poprawia CRS i NT w modelu ksenoprzeszczepu. 12 Komórki CAR-TGM-CSF k/o pozwalają na hamowanie GM-CSF podczas procesu produkcyjnego, skutecznie zmniejszając produkcję GM-CSF, jednocześnie zwiększając aktywność przeciwnowotworową komórek CAR-T i przeżywalność in vivo w porównaniu z komórkami CAR-T typu dzikiego. 12 Dlatego tutaj przedstawiamy metodologię generowania komórek CAR-T edytowanych przez CRISPR/Cas9.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD3 (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD3 (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>System CytoFLEX B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (Magnetyczny Koncentrator Cząstek)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>koraliki magnetyczne selekcji negatywnej; 17951RF zawiera końcówki i bufor</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>Mysz FITC Anti-Human CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka utrwalająca (pożywka A)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA Konstrukt: Nazwa: CSF2 CRISPR przewodnik RNA 1; Gatunek: Człowiek, Wektor: pLentiCRISPR v2; Odporność: ampicylina; Numer kopii: Wysoki; Przygotowanie plazmidu: Dostawa standardowa: 4 &mu; g (Bezpłatnie opłaty)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>na zamówienie niestandardowe</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td><td>Desktop Genetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB; Dawcy płci męskiej; typu AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Przeciwciało monoklonalne (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Monenzyny, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD49d Clone 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human MIP-1&beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr> Mr<tr><td>. Frosty Pojemnik mroźniczy</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, klon G5&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>linia komórkowa ostrej białaczki limfoblastycznej</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td> Systemy filtrów próżniowych <td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,22 uM, sterylne</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Szybkoprzepływowe sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną CN 0,45uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica Medium (1X), płynny</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td> PE-CF594 <td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100X), płynna</td> pożywka permeabilizacyjna <td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr> (<tr><td>średnia B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Szczur Anti-Human GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>W pełni automatyczny separator komórek</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Azek sodu, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Podłoże z komórek krwiotwórczych bez surowicy</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie crispr/cas9 do wyeliminowania gm-csf w komórkach car-t

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Terapia komórkowa z chimerycznym receptorem antygenowym T (CAR-T) jest nowatorską i potencjalnie rewolucyjną nową opcją leczenia raka. Istnieją jednak znaczne ograniczenia w jego powszechnym stosowaniu w leczeniu raka. Ograniczenia te obejmują rozwój unikalnych toksyczności, takich jak zespół uwalniania cytokin (CRS) i neurotoksyczność (NT) oraz ograniczoną ekspansję, funkcje efektorowe i aktywność przeciwnowotworową w guzach litych. Jedną ze strategii mających na celu zwiększenie skuteczności CAR-T i/lub kontrolę toksyczności komórek CAR-T jest edycja genomu samych komórek CAR-T podczas produkcji komórek CAR-T. W tym miejscu opisujemy zastosowanie edycji genów CRISPR/Cas9 w komórkach CAR-T poprzez transdukcję za pomocą konstruktu lentiwirusowego zawierającego przewodnik RNA do czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) i Cas9. Jako przykład opisujemy nokaut GM-CSF za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Wykazaliśmy, że te komórki GM-CSFk / o CAR-T skutecznie wytwarzają mniej GM-CSF, zachowując krytyczną funkcję komórek T i powodując zwiększoną aktywność przeciwnowotworową in vivo w porównaniu z komórkami CAR-T typu dzikiego.

Rysunek 1 przedstawia redukcję GM-CSF w komórkach GM-CSFk/o CART19. Aby zweryfikować, czy genom limfocytów T został zmodyfikowany w celu wywołania knockoutu GM-CSF, w komórkach GM-CSFk/o CART19 zastosowano sekwencjonowanie TIDE (Rysunek 1A). Barwienie powierzchniowe komórek CAR-T potwierdza, że limfocyty T skutecznie ekspresują powierzchniowy receptor CAR in vitro po wyselekcjonowaniu żywych komórek CD3+ (<s...

Tutaj prezentujemy protokół do genetycznej edycji komórek CAR-T za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Nasz protokół opisuje modyfikację genetyczną komórek CAR-T podczas ich produkcji za pomocą technologii CRISPR w celu wytworzenia bardziej skutecznego i mniej toksycznego produktu. Zaletą tej techniki jest to, że zarówno produkcja komórek CAR-T, jak i manipulacja genetyczna mogą zachodzić w jednej komórce z dobrą wydajnością. Procedurę zademonstrują Rosalie Sterner, doktorantka medycyny medycyny i doktorantka, Michelle Cox, technolog i doktorantka oraz Reona Sakemura, doktorantka z mojego laboratorium.Po wyizolowaniu limfocytów T z pobranych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej rozpocznij ich hodowlę, najpierw przygotowując pożywkę z komórek T, a następnie sterylizując ją, filtrując przez sterylny filtr próżniowy o średnicy 0,45 mikrometra, a następnie sterylny filtr próżniowy o sterylnym rozmiarze 0,22 mikrometra. W dniu stymulacji limfocytów T lub dniu zero, przed stymulacją, umyj kulki CD3/CD28, umieszczając wymaganą objętość kulek w sterylnej 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej i ponownie zawieszając w jednym mililitrze TCM. Umieść rurkę w kontakcie z magnesem na jedną minutę.Następnie odessać TCM i ponownie zawiesić w jednym mililitrze świeżego TCM, aby ponownie umyć kulki i powtórzyć w sumie trzy prania. I na koniec ponownie zawieś koraliki w jednym mililitrze TCM. Po policzeniu limfocytów T przenieś kulki do limfocytów T w stosunku trzy do jednego koralika na komórki.Następnie rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia miliona komórek na mililitr i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 przez 24 godziny. Po uzyskaniu konstruktu CART19 w wektorze lentiwirusowym, należy przeprowadzić produkcję lentiwirusa, najpierw inkubując plazmid lentiwirusowy, wektor opakowania, wektor otoczki, odczynnik wstępnego kompleksowania, odczynnik do transfekcji i pożywkę do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Prace lentiwirusowe należy wykonywać przy użyciu środków ostrożności BSL2+, w tym kapturów do hodowli komórkowych, środków ochrony osobistej i dezynfekcji zużytych materiałów wybielaczem przed utylizacją.Po inkubacji dodaj te odczynniki do transfekcji do 293 limfocytów T, które osiągnęły konfluencję od 70 do 90% i hoduj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po 24 i 48 godzinach od transfekcji, zebrać, odwirować, przefiltrować i zagęścić supernatant zawierający wirusa przez ultrawirowanie i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Pierwszego dnia delikatnie ponownie zasmów limfocyty T, które zostały stymulowane na poziomie miliona komórek na mililitr w dniu zero, aby rozbić rozety komórek.Przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności BSL2 + dodać świeżego lub mrożonego zebranego wirusa do symulowanych limfocytów T przy wielokrotności infekcji 3,0. Kontynuuj inkubację transdukowanych limfocytów T w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. W trzecim i piątym dniu policz komórki CAR-T i dodaj do hodowli świeży, wstępnie podgrzany TCM, aby utrzymać stężenie komórek CAR-T na poziomie miliona komórek na mililitr.Sześć dni po symulacji usuń kulki z transdukowanych limfocytów T, najpierw zbierając i ponownie zawieszając komórki. Przenieś komórki w stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów i umieść probówki w magnesie na jedną minutę. Po zebraniu supernatantu zawierającego komórki CAR-T i odrzuceniu kulek, umieścić komórki z powrotem w hodowli w stężeniu miliona komórek na mililitr w kolbie hodowlanej.Użyj próbki komórek do cytometrii przepływowej, aby ocenić ekspresję powierzchniową CAR. Inkubuj resztę, aby wznowić ekspansję, a następnie zbierz i zakonserwuj komórki w kriokonserwacji w ósmym dniu, jak opisano w manuskrypcie. Aby zakłócić czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów, należy użyć przewodnika RNA, jak opisano w manuskrypcie.Inkubować odczynniki do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji dodaj je do 293 limfocytów T, które osiągnęły zbieżność od 70 do 90% i hoduj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2, aby wytworzyć lentiwirusa. Po 24 i 48 godzinach zebrać i zagęścić supernatant zawierający wirusa przez ultrawirowanie w 50-mililitrowych probówkach ultrawirówek i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.Następnie pierwszego dnia delikatnie ponownie zawieś limfocyty T, aby rozbić rozety. W laboratorium zatwierdzonym przez BSL2 +, aby wygenerować komórki CAR-T, dodaj lentiwirusa CAR19 i lentiwirusa CRISPR ukierunkowanego na GMCSF do symulowanych limfocytów T. W trzecim i piątym dniu w przypadku pomyślnie transdukowanych limfocytów T edytowanych przez lentiCRISPR wykazujących oporność na puromycynę, należy potraktować komórki dichlorowodorkiem puromycyny w stężeniu jednego mikrograma puromycyny na mililitr.Sekwencjonowanie pływów zastosowano w celu potwierdzenia zmniejszenia GM-CSF w komórkach CART19 z nokautem GM-CSF ze skutecznością zakłóceń wynoszącą około 71%Wykresy przepływu barwienia powierzchni komórek CAR-T bramkowanych na żywych komórkach CD3-dodatnich pokazują, że zarówno CART19 typu dzikiego, jak i CART19 nokautujący GM-CSF z powodzeniem i w podobny sposób wyrażają receptor powierzchniowy CAR in vitro. Z drugiej strony, wewnątrzkomórkowe barwienie GM-CSF za pomocą cytometrii przepływowej, również bramkowanej na żywych komórkach CD3-dodatnich, wykazuje zmniejszoną ekspresję GM-CSF w komórkach nokautujących w porównaniu z komórkami CART19 typu dzikiego, potwierdzając funkcjonalny sukces nokautu. Szczególną ostrożność należy zachować podczas etapów transdukcji tej procedury, ponieważ są one najbardziej krytyczne dla rozwoju genetycznie zmodyfikowanych komórek CAR-T.Opisana metodologia może być potencjalnie zastosowana do różnych genów w celu modyfikacji komórek CAR-T za pomocą CRISPR/CAS9, aby pomóc w generowaniu mniej toksycznego i bardziej skutecznego produktu. Technologia CRISPR/CAS9 zapewnia strategie bezpośredniego ukierunkowania na genom komórek CAR-T w celu opracowania rozwiązań dla obecnych niedociągnięć klinicznych.

using-crisprcas9-to-knock-out-gm-csf-in-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Film przedstawia proces tworzenia genetycznie modyfikowanych komórek CAR T za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Zakażenie limfocytów T lentiwirusami CRISPR i CAR powoduje modyfikacje genu docelowego i syntezę chimerycznego receptora antygenowego lub CAR, co ostatecznie prowadzi do powstania genetycznie zmodyfikowanych limfocytów CAR T.

Genetyczna modyfikacja limfocytów CAR T przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Tutaj prezentujemy protokół edycji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą technologii CRISPR Cas do modyfikacji komórek CAR-T.

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Tutaj opisujemy metodę selektywnej zmiany ekspresji genów w splocie naczyniówkowym, unikając jednocześnie jakiegokolwiek wpływu na inne obszary mózgu.

Celowy knockdown genów w splocie naczyniówkowym

Artykuł opisuje protokół zastosowania modelu in vitro do wyczerpania w celu przeprowadzenia całego genomu ekranu nokautującego CRISPR w zdrowych limfocytach T receptora chimerycznego antygenu dawcy.

Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym

Opracowaliśmy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 dla pierwotnych komórek CAR T. Poprzez redukcję przenoszenia gDNA poprzez trawienie enzymatyczne i pulldown kasety sgRNA, podejście to minimalizuje artefakty PCR, zapewniając dokładne wykrywanie sgRNA i solidną identyfikację funkcjonalnych celów genowych.

Ulepszanie ekranów CRISPR-Cas9 w komórkach CAR T: udoskonalona metoda przygotowania biblioteki

Poznaj metodę edycji genetycznej komórek CAR-T za pomocą CRISPR/Cas9 w celu zwiększenia skuteczności i zmniejszenia toksyczności terapii przeciwnowotworowej. Protokół integruje produkcję komórek z manipulacją genetyczną.

Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T

Przeglądaj więcej filmów