Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Prototypowanie syntetycznych sieci genowych jest znacznie ulepszone dzięki zastosowaniu bezkomórkowych systemów ekspresji genów. Nasz protokół opisuje proces wytwarzania wielowarstwowego mikroprzepływowego reaktora przepływowego i pokazuje, że takie urządzenie może być używane do przedłużonej ekspresji GFP bez komórek. Bezkomórkowe ekspresje białek w połączeniu z mikroprzepływowymi reaktorami przepływowymi stanowią platformę szybkiego prototypowania do projektowania syntetycznych urządzeń biologicznych.

Cała ta konfiguracja jest bardzo wszechstronna i może być dostosowana do przeprowadzania dowolnych reakcji biochemicznych lub chemicznych wymagających wysokiego poziomu kontroli. Zapewnienie stabilności bezkomórkowego roztworu reakcyjnego ma kluczowe znaczenie i jest trudne do osiągnięcia. Pamiętaj, aby skupić się na zapewnieniu wystarczającego chłodzenia i wykorzystać rurki określone w tym protokole.

Wytwarzanie i przygotowanie platformy eksperymentalnej wymaga połączenia wielu pojedynczych elementów, co może być trudne do zrozumienia bez pomocy wizualnych. Aby rozpocząć, postępuj zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, aby wyprodukować urządzenie mikroprzepływowe i skonfigurować sterowanie pneumatyczne i regulację ciśnienia przepływu, które będą używane do sterowania zaworami krytycznymi dla tego urządzenia. Aby skonfigurować chłodzenie poza chipem, zacznij od nawinięcia rurki PTFE na zimną powierzchnię elementu Peltiera i zabezpiecz cewkę taśmą.

Upewnij się, że jeden koniec rurki PTFE jest podłączony do zbiorników systemu kontroli ciśnienia warstwy przepływowej i że drugi koniec wystaje nie więcej niż jeden centymetr z powierzchni Peltiera. Następnie włóż rurkę PEEK o długości od pięciu do 10 centymetrów w wystający koniec rurki PTFE. Nałóż odpowiednią ilość pasty termoprzewodzącej na gorącą powierzchnię elementu Peltiera i umieść ją na zimnej płycie bloku wodnego.

Upewnij się, że wężyk, element Peltiera i blok chłodzący są przez cały czas w bezpośrednim kontakcie ze sobą. Następnie podłącz element Peltiera do regulatora temperatury za pomocą złącza magistrali szeregowej, aby można było regulować napięcie dostarczane do Peltiera. Następnie bezpiecznie umieść termistor na powierzchni Peltiera i podłącz jego wyjście do regulatora temperatury.

Po włączeniu chłodnicy wody należy dostosować napięcie dostarczane do Peltiera, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie czterech stopni Celsjusza. Dla każdego kanału sterującego urządzenia mikroprzepływowego należy wyciąć odcinek standardowej rurki o długości jednego metra. Na jednym końcu włóż kołek króćca Luer o rozmiarze 23, jeden półcalowy króciec Luer, a na drugim końcu włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej.

Podłącz króciec Luer do męskiego nylonowego złącza kolczastego Luer 3/32 cala i włóż zadzior złącza do odcinka rurki poliuretanowej. Następnie włóż tę rurkę poliuretanową bezpośrednio do jednego z zaworów elektromagnetycznych. Następnie przymocuj półcalowy króciec Luer o rozmiarze 23 do strzykawki i włóż go do kawałka standardowej rurki o długości od trzech do czterech centymetrów.

Umieść otwarty koniec tej rurki w zbiorniku z ultra czystą wodą i napełnij strzykawkę ultra czystą wodą. Ponumeruj każdy kanał sterujący urządzenia mikroprzepływowego, jak pokazano tutaj. W przypadku kanałów od czwartego do 29 znajdź odpowiednią rurkę i włóż metalowy kołek do otwartego końca rurki dołączonej do strzykawki.

Następnie wstrzyknąć wodę do rurki kanału sterującego, aż zostanie wypełniona połowa długości. Następnie odłącz rurkę od strzykawki i włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej do odpowiedniego otworu urządzenia mikroprzepływowego. Powtórz ten krok dla wszystkich kanałów sterujących.

Teraz użyj interfejsu sterowania, aby otworzyć wszystkie zawory elektromagnetyczne. Spowoduje to zwiększenie ciśnienia płynu w rurce kanału sterującego, wpychając go do urządzenia mikroprzepływowego i zamykając wszystkie zawory membranowe w urządzeniu. Dla każdego z nieschłodzonych odczynników należy wyciąć metrową długość standardowej rurki, aby połączyć wylot zbiornika z wlotami urządzenia mikroprzepływowego.

Weź jeden koniec rurki i włóż go do zbiornika, upewniając się, że rurka dociera do podstawy zbiornika. Wylot rurki zbiornika należy dokręcić, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie. Następnie włóż nierdzewny kołek łączący do otwartego końca rurki.

Następnie przymocuj półcalowy króciec Luer o rozmiarze 23 do końca strzykawki o pojemności jednego mililitra. Dodaj krótki odcinek standardowej rurki do króćca Luer. Umieść koniec rurki w żądanym roztworze odczynnika i napełnij strzykawkę odczynnikiem.

Następnie włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej do rurki poliuretanowej podłączonej do strzykawki i napełnij rurkę odczynnikiem. W przypadku stosowania małych objętości reakcyjnych odczynnik nie dostanie się do zbiornika, a sam przewód będzie działał jako zbiornik. Po zakończeniu odłącz strzykawkę i włóż kołek złącza do jednego z otworów wlotowych warstwy przepływowej urządzenia mikroprzepływowego.

Następnie należy przyłożyć ciśnienie do każdego ze zbiorników za pomocą oprogramowania regulatora ciśnienia, aby wtłoczyć odczynniki do urządzenia mikroprzepływowego. Upewnij się, że chłodnica wody i elementy Peltiera zostały włączone przy temperaturze powierzchni Peltiera ustawionej na cztery stopnie Celsjusza. Zamontuj układ chłodzenia jak najbliżej urządzenia mikroprzepływowego, aby zminimalizować niechłodzoną objętość między ogniwem Peltiera a wlotem urządzenia.

Następnie podłącz jedną mililitrową strzykawkę do półcalowego klocka Luer o średnicy 23 mm z krótkim odcinkiem standardowej rurki przymocowanej do końca. Pobrać odczynnik, który ma zostać schłodzony, aby napełnić strzykawkę. Następnie podłącz rurkę PEEK do strzykawki za pomocą rurki łączącej i wywieraj stały nacisk na strzykawkę, przepychając odczynnik przez rurkę PEEK do rurki PTFE.

Na koniec odłącz rurkę PEEK od strzykawki i włóż ją bezpośrednio do wlotów kanału przepływowego urządzenia mikroprzepływowego. Po przyłożeniu ciśnienia schłodzony odczynnik zostanie wtłoczony do urządzenia mikroprzepływowego. Upewnij się, że urządzenie mikroprzepływowe jest zabezpieczone na stoliku mikroskopu z podłączonymi wszystkimi rurkami warstwy sterującej i przepływowej i zamknij wszelkie otwory w inkubatorze.

Następnie ustaw temperaturę otoczenia inkubatora na 29 stopni Celsjusza. Następnie upewnij się, że system chłodzenia został włączony i jest ustawiony na cztery stopnie Celsjusza przed rozpoczęciem eksperymentu. Sprawdź, czy ciśnienie przyłożone do regulatora ciśnienia kanału przepływu jest ustawione na 800 milibarów i za pomocą oprogramowania ustaw ciśnienie wyjściowe każdego pojedynczego kanału przepływu na od 20 do 100 milibarów.

Sprawdź, czy ciśnienie przyłożone do zaworów elektromagnetycznych kanału sterującego wynosi jeden bar dla kanałów od pierwszego do ósmego i trzy bary dla kanałów od dziewiątego do 29. Następnie zamknij wylot urządzenia, zwiększając ciśnienie w kanale 29 i jednocześnie rozhermetyzuj kanały sterujące od pierwszego do trzeciego i od 15 do 28. Następnie selektywnie rozhermetyzuj kanały sterujące multipleksera, aby umożliwić przepływ pojedynczego wybranego odczynnika do urządzenia.

Użyj mikroskopu, aby monitorować usuwanie powietrza, a następnie upewnić się, że wszystkie odczynniki przepływają prawidłowo, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Korzystając z dostarczonego pakietu oprogramowania, skonfiguruj pola danych związane z procesem kalibracji zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie określ objętość płynu wypieranego z każdego reaktora podczas pojedynczego kroku dopływu, wykonując protokół kalibracji.

Postępuj zgodnie z krokami przedstawionymi przez oprogramowanie sterujące, aby zakończyć analizę eksperymentu kalibracyjnego i określić współczynnik odświeżania każdego reaktora pierścieniowego w urządzeniu mikroprzepływowym. Na koniec ustaw wymagane wartości dla żądanego eksperymentu w wirtualnym interfejsie sterowania. Zainicjuj protokół eksperymentalny, naciskając przycisk wykonywania eksperymentu w interfejsie sterowania.

Podczas eksperymentu kalibracyjnego reaktory są napełniane fluoroforem, którego intensywność jest rejestrowana po każdym rozcieńczeniu. Spadek intensywności fluorescencji na rozcieńczenie ujawnia objętość pierścienia reaktora przemieszczoną dla określonej liczby kroków dopływu. Ten wolumin jest nazywany współczynnikiem odświeżania.

Średni współczynnik odświeżania i odchylenie standardowe są pokazane dla każdego etapu rozcieńczania na czerwono. Siedem z ośmiu reaktorów wykazuje bardzo podobne zachowanie, jednak jeden reaktor wykazuje wahania po siódmym cyklu rozcieńczania. Podkreśla to potrzebę stosowania unikalnych współczynników odświeżania dla każdego z reaktorów.

Pokazana tutaj przedłużona reakcja transkrypcji i translacji in vitro powodowała, że co 14,6 minuty 30% objętości reaktora było przemieszczane. Dwa reaktory urządzenia mikroprzepływowego zostały użyte jako ślepe próby. Wszystkie pozostałe reaktory składały się w 75% z roztworu reakcyjnego do transkrypcji i translacji in vitro oraz w 25% z ultraczystej wody lub 2,5 nanomolowych liniowych matryc DNA kodujących ekspresję białka deGFP.

We wszystkich czterech reaktorach, do których dodano DNA, stwierdzono wyraźną ekspresję deGFP. Jeden z reaktorów emituje sygnał o niższej fluorescencji. Może to być spowodowane rozbieżnościami w przepływie skutkującymi mniejszą ilością DNA dostającego się do reaktora lub zmianami w wymiarach reaktora.

Po 14 godzinach obserwuje się nagły wzrost sygnału reaktorów zawierających DNA. Jest to spowodowane przedostaniem się pęcherzyka powietrza do warstwy przepływowej urządzenia mikroprzepływowego. Po wznowieniu przepływu eksperyment powraca do poprzedniej intensywności fluorescencji.

Bezkomórkowe roztwory reakcyjne ulegają degradacji w czasie, chyba że są wystarczająco schłodzone, co sprawia, że proces chłodzenia opisany w tym protokole ma kluczowe znaczenie. Ze względu na uniwersalność platformy, w sposób precyzyjny i kontrolowany można przeprowadzać różnorodne reakcje biochemiczne i chemiczne. Zastosowanie mikroprzepływowych reaktorów przyspieszyło kolejne cykle testowe projektowania i budowy prototypów podwójnych obwodów genetycznych.