Name: Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego z PDMS do przedłużonej ekspresji białek bezkomórkowych, takich jak GFP. Ta platforma umożliwia precyzyjną kontrolę reakcji biochemicznych w badaniach nad biologią syntetyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, ERC (projekt n. 677313 BioCircuit), grant NWO-VIDI z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO, 723.016.003), finansowanie z Ministerstwa Edukacji, Kultury i Nauki (programy Gravity, 024.001.035 i 024.003.013), grant Human Frontier Science Program RGP0032/2015, Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań naukowych i innowacji Grant 723106, oraz grant Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki 200021_182019.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zaprezentowano wielowarstwowe urządzenie mikroprzepływowe oparte na PDMS i zademonstrowano jego zdolność do podtrzymywania reakcji IVTT przez dłuższy czas. Chociaż technologia ta dobrze nadaje się do tego konkretnego przykładu, może być wykorzystywana do wielu innych zastosowań. Dodatkowa kontrola nad przepływem płynu - w połączeniu ze zdolnością do ciągłego uzupełniania odczynników reakcyjnych przy jednoczesnym usuwaniu produktów (ubocznych) - jest idealna do ciągłych reakcji syntezy, badania różnych zachowań dynamicznych i jednoczesnego prowadzenia wielu wariantów pojedynczej reakcji.
Pomimo stosunkowo prostego procesu produkcji urządzeń opartych na PDMS, korzystanie z nich wymaga rozbudowanej konfiguracji sprzętowej. Składające się z układów zaworów, regulatorów ciśnienia, pomp ciśnieniowych, inkubatorów i jednostek chłodzących, przejście od produkcji do użytkowania nie jest elementarne i wymaga znacznych inwestycji początkowych. Ponadto zdolność do konsekwentnego ustawiania i przeprowadzania udanych eksperymentów z tymi urządzeniami wymaga znacznych inwestycji czasowych; Jest to kwestia, do której niniejszy manuskrypt ma się odnieść. Jednak po umieszczeniu na miejscu cała konfiguracja może być modyfikowana do różnych celów. Co więcej, konfiguracja sprzętowa składa się z wielu elementów modułowych, z których każdy można rozbudować, aby umożliwić zastosowanie bardziej złożonych konstrukcji urządzeń mikroprzepływowych. Dodatkowo, modułowa konstrukcja umożliwia wymianę komponentów sprzętowych na podobnie działające alternatywy, dzięki czemu użytkownicy nie są ograniczeni do konkretnej konfiguracji opisanej tutaj48,49.
Zmienność pomiędzy poszczególnymi urządzeniami oraz w warunkach zewnętrznych (takich jak wahania ciśnienia) może skutkować niedokładnościami podczas wykonywania eksperymentów z użyciem tych urządzeń. Aby rozwiązać ten problem, przed każdym eksperymentem należy przeprowadzić kalibrację systemu, zapewniając unikalny współczynnik odświeżania dla każdego z reaktorów. Chociaż kalibracja dotyczy różnic między urządzeniami i eksperymentów, jest to proces czasochłonny i nie bezbłędny. Płyny o różnej lepkości nie będą płynąć z taką samą szybkością, gdy zostaną wystawione na działanie identycznego ciśnienia, w związku z czym przeprowadzenie kalibracji z wieloma odczynnikami może nie dać identycznych współczynników odświeżania. Efekt ten jest tłumiony przez wykorzystanie trzech kanałów sterujących do perystaltycznego pompowania odczynników do urządzenia mikroprzepływowego, w przeciwieństwie do regulacji przepływu poprzez samą zmianę dostarczanego ciśnienia. W ostateczności w przypadkach, gdy rozbieżność lepkości jest bardzo duża, można zaimplementować unikalny współczynnik odświeżania dla każdego odczynnika z osobna, przeprowadzając wiele eksperymentów kalibracyjnych.
Zastosowanie pompy perystaltycznej do wstrzykiwania odczynników do urządzenia mikroprzepływowego niweluje efekty stosowania roztworów o różnej lepkości, jednak stwarza również problem wtórny. Zastosowanie dyskretnych kroków do pompowania płynów do urządzenia mikroprzepływowego oznacza, że rozdzielczość wtrysków do pojedynczego reaktora jest ograniczona przez objętość wtryskiwaną podczas wykonywania pojedynczego cyklu pompy. W naszych badaniach wartość ta - określona podczas kalibracji - jest w przybliżeniu równa 1%, co wskazuje, że pojedynczy cykl pompy wypiera około 1% objętości reaktora (około 0,1 nL). W związku z tym przemieszczenie 30% objętości reaktora wymaga wykonania 30 cykli pompowania, przy czym dodawane są 23 cykle pompowania roztworu reakcyjnego IVTT i tylko 7 cykli pompowania DNA lub wody ultraczystej. Chociaż jest to wystarczające dla naszych badań, alternatywne protokoły eksperymentalne mogą napotkać problemy podczas próby dodania większej liczby unikalnych odczynników, użycia niższej frakcji odświeżania lub dodania mniejszych objętości pojedynczego odczynnika do reaktora. W takich przypadkach konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego może być dostosowana do zapewnienia reaktorów o większej objętości. Przykład takiego jest opisany w Niederholtmeyer et al.36.
Co najważniejsze, urządzenie opisane w tym manuskrypcie pozwala na podtrzymywanie reakcji przez dłuższy czas, co skutkuje szybkością transkrypcji i translacji w stanie ustalonym. Poprzez okresowe wstrzykiwanie nowych odczynników do reaktorów - i usuwanie (uboczne) produktów reakcji - reakcje są podtrzymywane i można monitorować złożone zachowania dynamiczne. W ten sposób powstała platforma, która – w pewnym stopniu – naśladuje środowisko komórkowe. Co więcej, platforma ta umożliwia badanie dynamiki systemu poprzez dostosowanie okresu między iniekcjami do specyficznego składu iniekcji. W rezultacie, te wielowarstwowe urządzenia mikroprzepływowe są potężnym narzędziem do charakteryzowania i optymalizacji nowatorskich sieci syntetycznych, które wykazują złożone zachowanie dynamiczne.

Komórki są w stanie wykrywać i reagować na swoje otoczenie za pomocą złożonych dynamicznych sieci regulacyjnych1,2. Dziedzina biologii syntetycznej wykorzystuje naszą wiedzę na temat naturalnie występujących składników składających się na te sieci do projektowania systemów biologicznych, które mogą rozszerzyć funkcjonalność komórek3,4. Z drugiej strony, możliwe jest również pogłębienie naszego zrozumienia naturalnych sieci rządzących życiem poprzez projektowanie uproszczonych, syntetycznych analogów istniejących obwodów lub poprzez postępową inżynierię systemów biologicznych, które wykazują naturalnie występujące zachowania. Inżynieria de novo takich systemów biologicznych jest wykonywana w sposób oddolny, w którym nowe obwody genetyczne lub szlaki sygnałowe są projektowane w racjonalny sposób, przy użyciu dobrze zdefiniowanych części5,6. Połączenie racjonalnego projektowania sieci z projektowaniem biologicznie istotnych systemów umożliwia dogłębną charakterystykę i badanie biologicznych systemów regulacyjnych o różnych poziomach abstrakcji7.
Pionierskie prace Elowitza i Leiblera8 oraz Gardnera et al.9 były pierwszymi, które wykazały udane wprowadzenie syntetycznych sieci genetycznych do gospodarzy komórkowych. W następnej dekadzie wielu badaczy kontynuowało rozwijanie tych początkowych sukcesów, pomimo pojawienia się kilku ograniczeń dotyczących wprowadzania obwodów syntetycznych do komórek7,10,11,12. Idealnie byłoby, gdyby wprowadzenie syntetycznych obwodów do gospodarzy komórkowych odbywało się w sposób modułowy. Niestety, złożoność środowiska komórkowego sprawia, że jest to szczególnie trudne, ponieważ funkcja wielu części i sieci jest wysoce zależna od kontekstu12,13,14. W rezultacie sieci często doświadczają niepożądanych interakcji z natywnymi komponentami hosta, które mogą wpływać na działanie obwodu syntetycznego. Podobnie, składniki sieci egzogenicznej mogą hamować procesy hosta, rywalizować o współdzielone zasoby w hoście i wpływać na kinetykę wzrostu15,16,17. W związku z tym, aby racjonalnie zaprojektować i przewidzieć zachowanie sieci syntetycznych w środowisku in vivo, wymagany jest kompleksowy model całej dynamiki specyficznej dla hosta i obwodu18.
Realną alternatywą dla wykorzystania hostów komórkowych do charakterystyki sieci syntetycznych jest zastosowanie technologii transkrypcji i translacji in vitro (IVTT). Działając jako poligon testowy dla sieci syntetycznych, reakcje są przeprowadzane w roztworach zawierających wszystkie składniki wymagane do umożliwienia ekspresji genów19,20,21. W ten sposób tworzone jest biologicznie istotne, choć sztuczne, środowisko, w którym można testować sieci syntetyczne22,23,24,25,26,27,28. Główną zaletą korzystania z rozwiązań IVTT jest możliwość przeprowadzania reakcji w warunkach określonych przez użytkownika, przy czym badacze są w stanie dostroić dokładny skład każdej reakcji2. Co więcej, podejście bezkomórkowe umożliwia wysokoprzepustowe testowanie sieci syntetycznych, ponieważ eliminuje potrzebę wykonywania czasochłonnych etapów klonowania komórek. W rezultacie, czas trwania kolejnych cykli projektowania - budowy - testów jest znacznie skrócony29,30,31,32. Cykl projektowania można jeszcze bardziej przyspieszyć poprzez wykorzystanie technik klonowania bezkomórkowego, takich jak montaż Gibsona, do szybkiego projektowania nowych sieci, oraz poprzez konstruowanie sieci z liniowych matryc DNA, które - w przeciwieństwie do plazmidów wymaganych do testów in vivo - mogą być amplifikowane za pomocą reakcji łańcuchowych polimerazy (PCR)33,34.
Reakcje wsadowe są najprostszą metodą, za pomocą której można przeprowadzić reakcje IVTT, wymagającą pojedynczego naczynia reakcyjnego, w którym wszystkie składniki reakcji są połączone35. Takie reakcje są wystarczające do ekspresji białek i podstawowych testów obwodów, ale okazują się niewystarczające przy próbie zbadania długoterminowego dynamicznego zachowania sieci. W trakcie reakcji okresowej odczynniki ulegają wyczerpaniu lub degradacji, co powoduje ciągły spadek szybkości transkrypcji i translacji. Co więcej, w miarę postępu reakcji gromadzą się produkty uboczne, które mogą zakłócać - lub całkowicie hamować - prawidłowe funkcjonowanie sieci. Ostatecznie, zastosowanie reaktorów wsadowych ogranicza dynamiczne zachowanie, które można zaobserwować, przy czym negatywna regulacja jest szczególnie trudna do wdrożenia5,36.
Wszechstronność systemów IVTT umożliwia wiele alternatywnych metod, za pomocą których można przeprowadzać przedłużone reakcje IVTT, począwszy od metod ciągłego przepływu do metod opartych na kropelkach, a także prostszych metod dializy2,30,37,38,39,40. Zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych zapewnia użytkownikom większą kontrolę nad ich reakcjami, jednocześnie zwiększając przepustowość i minimalizując koszty35,41,42, przy czym każde konkretne podejście ma swoje zalety. Wykorzystanie ciągłego przepływu można łatwo zoptymalizować w celu zwiększenia wydajności ekspresji, jednak niezdolność do skutecznego usuwania określonych produktów reakcji sprawia, że badanie dynamicznego zachowania jest nietrywialne39. Podczas gdy zastosowanie kropelkowych systemów mikroprzepływowych pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe nowych sieci, trudność w dostarczaniu świeżych odczynników do reakcji powoduje, że kropelki przypominają reakcje wsadowe o małej objętości43. Reaktory oparte na dializie umożliwiają wprowadzanie świeżych odczynników, a także usuwanie niektórych produktów reakcji, jednak cząsteczki RNA i większe białka gromadzą się w reaktorze, będąc zbyt duże, aby dyfundować przez pory błony. Co więcej, do podtrzymania tych reakcji przez dłuższy czas potrzebne są duże ilości odczynników30,44. W 2013 roku Maerkl i wsp. zaprezentowali wielowarstwowe urządzenie mikroprzepływowe zaprojektowane specjalnie do przeprowadzania przedłużonych reakcji IVTT 36,45. Zastosowanie wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych pozwala na bezpośrednią kontrolę przepływu płynu, co pozwala na przekierowanie przepływu, a także izolację płynu w określonych obszarach urządzenia46,47. Te izolowane obszary mogą funkcjonować jako niezależne komory reakcyjne w skali nanolitrów, w których można przeprowadzać reakcje IVTT. W trakcie pojedynczej reakcji IVTT stosuje się okresowe wstrzykiwanie świeżych odczynników do reaktora w celu uzupełnienia składników IVTT i matryc DNA. Jednocześnie równa objętość starego roztworu reakcyjnego jest przemieszczana, usuwając produkty reakcji. W ten sposób utrzymywane jest środowisko nierównowagi, w którym podstawowe tempo transkrypcji i translacji pozostaje w stanie stałym, przedłużając czas życia reakcji IVTT i umożliwiając występowanie bogatych zachowań dynamicznych. Stosując to podejście, naukowcy są w stanie badać tempo kinetyczne poszczególnych procesów zachodzących w określonym obwodzie, pomagając w inżynierii nowej sieci genetycznej. Na przykład Niederholtmeyer i in. zastosowali to podejście do scharakteryzowania różnych elementów genetycznego oscylatora pierścieniowego, określając jego wskaźniki kinetyczne36. W dalszych badaniach Yelleswarapu i in. wykazali, że wskaźniki kinetyczne czynnika sigma 28 (σ28) określone w warunkach wsadowych były niewystarczające do opisania zachowania oscylatora opartego na σ28, a dodanie danych opartych na przepływie poprawiło przewidywania modelu zachowania sieci22.
Celem tego manuskryptu jest przedstawienie kompletnego protokołu produkcji wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do przeprowadzania długotrwałych reakcji IVTT. Ponadto w manuskrypcie tym opisano cały sprzęt i oprogramowanie wymagane do przeprowadzenia przedłużonych reakcji IVTT. Uruchamianie urządzenia mikroprzepływowego - niezbędnego do kontrolowania przepływu płynów w nim - odbywa się za pomocą szeregu zaworów pneumatycznych, które łączą się bezpośrednio z urządzeniami mikroprzepływowymi za pomocą odcinków przewodów. Z kolei zawory pneumatyczne są sterowane za pomocą specjalnie zaprojektowanego wirtualnego interfejsu sterowania. Przepływ płynu w urządzeniach mikroprzepływowych odbywa się za pomocą ciągłego ciśnienia, które jest zapewniane przez dostępny na rynku system regulacji ciśnienia. Reakcje IVTT są zwykle przeprowadzane w temperaturze od 29 °C do 37 °C, a inkubator mikroskopowy służy do regulacji temperatury podczas reakcji. Funkcjonalność mieszaniny IVTT ulega jednak stopniowemu pogorszeniu, gdy jest przechowywana w temperaturze powyżej 4 °C. W związku z tym manuskrypt ten będzie rozwijał temat systemu chłodzenia poza chipem używanego do chłodzenia mieszaniny IVTT przed wstrzyknięciem do urządzenia mikroprzepływowego. Podsumowując, niniejszy manuskrypt zawiera kompleksowy przegląd procedur wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia przedłużonych reakcji IVTT przy użyciu mikroprzepływowego reaktora przepływowego, dzięki czemu inni badacze będą w stanie stosunkowo łatwo odtworzyć tę technologię.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>20063.365</td><td></td></tr><tr><td>AZ 40 XT</td><td>Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy)</td><td>-</td><td>Dodatni fotorezystu</td></tr><tr><td>AZ 726 MIF Deweloper</td><td>Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy)</td><td>-</td><td>Wywoływanik Dodatni fotorezystu</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>ECN 631-1550</td><td></td></tr><tr><td>mr Dev 600</td><td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Niemcy)</td><td>-</td><td>Deweloper Ujemny fotorezystor</td></tr><tr><td>Bezsilikonowy</td><td>radiator Smar Circuit Works</td><td>CW7270</td><td>Związek termiczny</td></tr><tr><td>Wafle krzemowe</td><td>Materiały krzemowe</td><td>-</td><td>< Orientacja 1-0-0>, średnica 100 mm, 525 &mikro; m grubość</td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td><td>-</td><td>Ujemny zestaw</td></tr><tr><td>elastomerów fotorezystu Sylgard 184 (PDMS)</td><td>The Dow Chemical Company</td><td>01317318</td><td></td></tr><tr><td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktyl)silan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Katalog Numer</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-kanałowy cyfrowy moduł wejść/wyjść</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-504</td><td>8x</td></tr><tr><td>Obiektyw kamery</td><td>Łącznik kompresyjny</td><td></td><td></td> źródła obrazowania</tr> <tr><td></td><td>Koolance, Inc.</td><td>FIT-V06X10</td><td>Złączka do rur o średnicy wewnętrznej 6 mm i średnicy zewnętrznej 10 mm. 4x</td></tr><tr><td>Moduł końcowy sterownika</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-600</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie łączące rurki</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>AAD04103</td><td>0,02" ID, 0,06" OD, Tygon Rurka (ND-100-80)</td></tr><tr><td>Piny złącza urządzenia</td><td>Unimed SA (Lozanna, Szwajcaria)</td><td>200.010-A</td><td>Rurka AISI 304, 0,35 mm średnica wewnętrzna, 0,65 mm średnica zewnętrzna, 8 mm L</td></tr><tr><td>Sterownik Ethernet</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-881</td><td></td></tr><tr><td>Żeńskie złącze magistrali</td><td>Encitech</td><td>DTCK15-DBS-K</td><td>15-biegunowe żeńskie złącze magistrali</td></tr><tr><td>Zbiorniki płynów</td><td>Fluigent</td><td>Fluiwell-4C</td><td></td></tr><tr><td>Fluigent system ciśnieniowy</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-EZ</td><td>0 - 345 mbar</td></tr><tr><td>Hg lampa łukowa</td><td>Advanced Radiation Corporation</td><td>- </td><td>350W</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Torrey Pines Scientific</td><td>HP61</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Software</td><td>de Greef Lab, Eindhoven University of</td> Technology <td>https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td><td></td></tr><tr><td>Płynny płyn chłodzący</td><td>Koolance, Inc.</td><td>LIQ-705CL-B</td><td></td></tr><tr><td>Luer odgałęzienia</td><td>Instech Laboratories, Inc.</td><td>LS23</td><td></td></tr><tr><td>Męskie złącza Luer do zadziorów</td><td>Cole Parmer</td><td>45505-32</td><td>3/32" ID</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Software de Greef Lab, Eindhoven University of</td> Technology <td>https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokamera</td><td>Źródło obrazowania</td><td>DMK 42AUC03</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>OrcaFlash4.0 V2 ( C11440-22CU)</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-513000-05</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus T6P 50045757</td><td></td></tr><tr><td>Plazma tlenowa Asher</td><td>Quorum Technologies</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>PDMS dziurkacz</td><td>SYNEO</td><td>Accu-Pucnh MP10</td><td></td></tr><tr><td>PEEK rurka Trajan</td><td></td><td>1301005001-5F</td><td>0.005" ID, 1/32" OD, czerwony</td></tr><tr><td>Element Peltiera</td><td>Termodynamika europejska</td><td>APH-127-10-25-S</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury Peltiera</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Photomask Design</td><td>Maerkl Lab, EPFL</td><td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczny układ zaworów</td><td>FESTO-1x</td><td></td> <td>22 i 1x 8 układ zaworów, Zawory normalnie zamknięte.</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Koolance, Inc.</td><td>ADT-EX004S</td><td>Zasilacz sieciowy 110/220 V</td></tr><tr><td>Rurka PTFE</td><td>Cole Parmer</td><td>06417-21</td><td>#24 AWG Cienkościenny</td></tr><tr><td>kołek dziurkujący</td><td>PTFE SYNEO</td><td>CR0320245N21R4</td><td>OD: 0,032" (0,8128 mm), ID: 0,024" (0,6090 mm)</td></tr> <tr><td>Rurki PVC</td><td>Koolance, Inc.</td><td>HOS-06CL</td><td>6 mm ID, 10 mm OD</td></tr><tr><td>Ostrza jednokrawędziowe</td><td>GEM</td> <td>Scientific-Miękkie</td><td></td></tr> <tr><td>rurki</td><td>Fluigent-Dostarczane</td><td></td> <td>ze zbiornikami płynów. (1 mm średnica wewnętrzna, 3 mm średnica zewnętrzna)</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>termistora</td><td>Warner</td><td>Instruments TA-29</td><td>z termistorem koralikowym</td></tr><tr><td>System naświetlania UV</td><td>ABM, USA-Near</td><td></td> <td>UV Exposure System, 350W</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Vacuumbrand GmbH</td><td>MD1C</td><td></td></tr><tr><td>Chłodzony wodą blok zimnej płyty</td><td>Koolance, Inc.</td><td>PLT-UN40F</td><td></td></tr><tr><td>Chłodnica wodna</td><td>Koolance, Inc.</td><td>EX2-755</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Sartorius</td><td>M-prove</td><td></td></tr></tbody></table>

wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Ograniczenia syntetycznej biologii opartej na komórkach stają się coraz bardziej widoczne, ponieważ naukowcy dążą do opracowania większych i bardziej złożonych syntetycznych genetycznych obwodów regulacyjnych. Analiza syntetycznych genetycznych sieci regulacyjnych in vivo jest czasochłonna i cierpi z powodu braku kontroli środowiska, w której egzogenne składniki syntetyczne wchodzą w interakcje z procesami gospodarza, co skutkuje niepożądanym zachowaniem. Aby przezwyciężyć te problemy, coraz powszechniejsza staje się bezkomórkowa charakterystyka nowych obwodów. Mieszaniny do transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) umożliwiają regulację środowiska eksperymentalnego i mogą być zoptymalizowane dla każdego unikalnego systemu. Przedstawione tutaj protokoły szczegółowo opisują wytwarzanie wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego, które może być wykorzystane do podtrzymywania reakcji IVTT przez dłuższy czas. W przeciwieństwie do reakcji okresowych, w których zasoby wyczerpują się z czasem, a produkty (uboczne) gromadzą się, zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych pozwala na uzupełnienie zasobów, a także usunięcie produktów reakcji. W ten sposób środowisko komórkowe jest emulowane poprzez utrzymywanie środowiska nierównowagi, w którym dynamiczne zachowanie obwodów genowych może być badane przez dłuższy czas. Aby w pełni wykorzystać możliwości wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego, zintegrowano sprzęt i oprogramowanie w celu automatyzacji reakcji IVTT. Łącząc reakcje IVTT z prezentowaną tutaj platformą mikroprzepływową, możliwa staje się kompleksowa analiza złożonych zachowań sieci, pogłębiając nasze zrozumienie mechanizmów regulujących procesy komórkowe.

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Prototypowanie syntetycznych sieci genowych jest znacznie ulepszone dzięki zastosowaniu bezkomórkowych systemów ekspresji genów. Nasz protokół opisuje proces wytwarzania wielowarstwowego mikroprzepływowego reaktora przepływowego i pokazuje, że takie urządzenie może być używane do przedłużonej ekspresji GFP bez komórek. Bezkomórkowe ekspresje białek w połączeniu z mikroprzepływowymi reaktorami przepływowymi stanowią platformę szybkiego prototypowania do projektowania syntetycznych urządzeń biologicznych.Cała ta konfiguracja jest bardzo wszechstronna i może być dostosowana do przeprowadzania dowolnych reakcji biochemicznych lub chemicznych wymagających wysokiego poziomu kontroli. Zapewnienie stabilności bezkomórkowego roztworu reakcyjnego ma kluczowe znaczenie i jest trudne do osiągnięcia. Pamiętaj, aby skupić się na zapewnieniu wystarczającego chłodzenia i wykorzystać rurki określone w tym protokole.Wytwarzanie i przygotowanie platformy eksperymentalnej wymaga połączenia wielu pojedynczych elementów, co może być trudne do zrozumienia bez pomocy wizualnych. Aby rozpocząć, postępuj zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, aby wyprodukować urządzenie mikroprzepływowe i skonfigurować sterowanie pneumatyczne i regulację ciśnienia przepływu, które będą używane do sterowania zaworami krytycznymi dla tego urządzenia. Aby skonfigurować chłodzenie poza chipem, zacznij od nawinięcia rurki PTFE na zimną powierzchnię elementu Peltiera i zabezpiecz cewkę taśmą.Upewnij się, że jeden koniec rurki PTFE jest podłączony do zbiorników systemu kontroli ciśnienia warstwy przepływowej i że drugi koniec wystaje nie więcej niż jeden centymetr z powierzchni Peltiera. Następnie włóż rurkę PEEK o długości od pięciu do 10 centymetrów w wystający koniec rurki PTFE. Nałóż odpowiednią ilość pasty termoprzewodzącej na gorącą powierzchnię elementu Peltiera i umieść ją na zimnej płycie bloku wodnego.Upewnij się, że wężyk, element Peltiera i blok chłodzący są przez cały czas w bezpośrednim kontakcie ze sobą. Następnie podłącz element Peltiera do regulatora temperatury za pomocą złącza magistrali szeregowej, aby można było regulować napięcie dostarczane do Peltiera. Następnie bezpiecznie umieść termistor na powierzchni Peltiera i podłącz jego wyjście do regulatora temperatury.Po włączeniu chłodnicy wody należy dostosować napięcie dostarczane do Peltiera, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie czterech stopni Celsjusza. Dla każdego kanału sterującego urządzenia mikroprzepływowego należy wyciąć odcinek standardowej rurki o długości jednego metra. Na jednym końcu włóż kołek króćca Luer o rozmiarze 23, jeden półcalowy króciec Luer, a na drugim końcu włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej.Podłącz króciec Luer do męskiego nylonowego złącza kolczastego Luer 3/32 cala i włóż zadzior złącza do odcinka rurki poliuretanowej. Następnie włóż tę rurkę poliuretanową bezpośrednio do jednego z zaworów elektromagnetycznych. Następnie przymocuj półcalowy króciec Luer o rozmiarze 23 do strzykawki i włóż go do kawałka standardowej rurki o długości od trzech do czterech centymetrów.Umieść otwarty koniec tej rurki w zbiorniku z ultra czystą wodą i napełnij strzykawkę ultra czystą wodą. Ponumeruj każdy kanał sterujący urządzenia mikroprzepływowego, jak pokazano tutaj. W przypadku kanałów od czwartego do 29 znajdź odpowiednią rurkę i włóż metalowy kołek do otwartego końca rurki dołączonej do strzykawki.Następnie wstrzyknąć wodę do rurki kanału sterującego, aż zostanie wypełniona połowa długości. Następnie odłącz rurkę od strzykawki i włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej do odpowiedniego otworu urządzenia mikroprzepływowego. Powtórz ten krok dla wszystkich kanałów sterujących.Teraz użyj interfejsu sterowania, aby otworzyć wszystkie zawory elektromagnetyczne. Spowoduje to zwiększenie ciśnienia płynu w rurce kanału sterującego, wpychając go do urządzenia mikroprzepływowego i zamykając wszystkie zawory membranowe w urządzeniu. Dla każdego z nieschłodzonych odczynników należy wyciąć metrową długość standardowej rurki, aby połączyć wylot zbiornika z wlotami urządzenia mikroprzepływowego.Weź jeden koniec rurki i włóż go do zbiornika, upewniając się, że rurka dociera do podstawy zbiornika. Wylot rurki zbiornika należy dokręcić, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie. Następnie włóż nierdzewny kołek łączący do otwartego końca rurki.Następnie przymocuj półcalowy króciec Luer o rozmiarze 23 do końca strzykawki o pojemności jednego mililitra. Dodaj krótki odcinek standardowej rurki do króćca Luer. Umieść koniec rurki w żądanym roztworze odczynnika i napełnij strzykawkę odczynnikiem.Następnie włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej do rurki poliuretanowej podłączonej do strzykawki i napełnij rurkę odczynnikiem. W przypadku stosowania małych objętości reakcyjnych odczynnik nie dostanie się do zbiornika, a sam przewód będzie działał jako zbiornik. Po zakończeniu odłącz strzykawkę i włóż kołek złącza do jednego z otworów wlotowych warstwy przepływowej urządzenia mikroprzepływowego.Następnie należy przyłożyć ciśnienie do każdego ze zbiorników za pomocą oprogramowania regulatora ciśnienia, aby wtłoczyć odczynniki do urządzenia mikroprzepływowego. Upewnij się, że chłodnica wody i elementy Peltiera zostały włączone przy temperaturze powierzchni Peltiera ustawionej na cztery stopnie Celsjusza. Zamontuj układ chłodzenia jak najbliżej urządzenia mikroprzepływowego, aby zminimalizować niechłodzoną objętość między ogniwem Peltiera a wlotem urządzenia.Następnie podłącz jedną mililitrową strzykawkę do półcalowego klocka Luer o średnicy 23 mm z krótkim odcinkiem standardowej rurki przymocowanej do końca. Pobrać odczynnik, który ma zostać schłodzony, aby napełnić strzykawkę. Następnie podłącz rurkę PEEK do strzykawki za pomocą rurki łączącej i wywieraj stały nacisk na strzykawkę, przepychając odczynnik przez rurkę PEEK do rurki PTFE.Na koniec odłącz rurkę PEEK od strzykawki i włóż ją bezpośrednio do wlotów kanału przepływowego urządzenia mikroprzepływowego. Po przyłożeniu ciśnienia schłodzony odczynnik zostanie wtłoczony do urządzenia mikroprzepływowego. Upewnij się, że urządzenie mikroprzepływowe jest zabezpieczone na stoliku mikroskopu z podłączonymi wszystkimi rurkami warstwy sterującej i przepływowej i zamknij wszelkie otwory w inkubatorze.Następnie ustaw temperaturę otoczenia inkubatora na 29 stopni Celsjusza. Następnie upewnij się, że system chłodzenia został włączony i jest ustawiony na cztery stopnie Celsjusza przed rozpoczęciem eksperymentu. Sprawdź, czy ciśnienie przyłożone do regulatora ciśnienia kanału przepływu jest ustawione na 800 milibarów i za pomocą oprogramowania ustaw ciśnienie wyjściowe każdego pojedynczego kanału przepływu na od 20 do 100 milibarów.Sprawdź, czy ciśnienie przyłożone do zaworów elektromagnetycznych kanału sterującego wynosi jeden bar dla kanałów od pierwszego do ósmego i trzy bary dla kanałów od dziewiątego do 29. Następnie zamknij wylot urządzenia, zwiększając ciśnienie w kanale 29 i jednocześnie rozhermetyzuj kanały sterujące od pierwszego do trzeciego i od 15 do 28. Następnie selektywnie rozhermetyzuj kanały sterujące multipleksera, aby umożliwić przepływ pojedynczego wybranego odczynnika do urządzenia.Użyj mikroskopu, aby monitorować usuwanie powietrza, a następnie upewnić się, że wszystkie odczynniki przepływają prawidłowo, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Korzystając z dostarczonego pakietu oprogramowania, skonfiguruj pola danych związane z procesem kalibracji zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie określ objętość płynu wypieranego z każdego reaktora podczas pojedynczego kroku dopływu, wykonując protokół kalibracji.Postępuj zgodnie z krokami przedstawionymi przez oprogramowanie sterujące, aby zakończyć analizę eksperymentu kalibracyjnego i określić współczynnik odświeżania każdego reaktora pierścieniowego w urządzeniu mikroprzepływowym. Na koniec ustaw wymagane wartości dla żądanego eksperymentu w wirtualnym interfejsie sterowania. Zainicjuj protokół eksperymentalny, naciskając przycisk wykonywania eksperymentu w interfejsie sterowania.Podczas eksperymentu kalibracyjnego reaktory są napełniane fluoroforem, którego intensywność jest rejestrowana po każdym rozcieńczeniu. Spadek intensywności fluorescencji na rozcieńczenie ujawnia objętość pierścienia reaktora przemieszczoną dla określonej liczby kroków dopływu. Ten wolumin jest nazywany współczynnikiem odświeżania.Średni współczynnik odświeżania i odchylenie standardowe są pokazane dla każdego etapu rozcieńczania na czerwono. Siedem z ośmiu reaktorów wykazuje bardzo podobne zachowanie, jednak jeden reaktor wykazuje wahania po siódmym cyklu rozcieńczania. Podkreśla to potrzebę stosowania unikalnych współczynników odświeżania dla każdego z reaktorów.Pokazana tutaj przedłużona reakcja transkrypcji i translacji in vitro powodowała, że co 14,6 minuty 30% objętości reaktora było przemieszczane. Dwa reaktory urządzenia mikroprzepływowego zostały użyte jako ślepe próby. Wszystkie pozostałe reaktory składały się w 75% z roztworu reakcyjnego do transkrypcji i translacji in vitro oraz w 25% z ultraczystej wody lub 2,5 nanomolowych liniowych matryc DNA kodujących ekspresję białka deGFP.We wszystkich czterech reaktorach, do których dodano DNA, stwierdzono wyraźną ekspresję deGFP. Jeden z reaktorów emituje sygnał o niższej fluorescencji. Może to być spowodowane rozbieżnościami w przepływie skutkującymi mniejszą ilością DNA dostającego się do reaktora lub zmianami w wymiarach reaktora.Po 14 godzinach obserwuje się nagły wzrost sygnału reaktorów zawierających DNA. Jest to spowodowane przedostaniem się pęcherzyka powietrza do warstwy przepływowej urządzenia mikroprzepływowego. Po wznowieniu przepływu eksperyment powraca do poprzedniej intensywności fluorescencji.Bezkomórkowe roztwory reakcyjne ulegają degradacji w czasie, chyba że są wystarczająco schłodzone, co sprawia, że proces chłodzenia opisany w tym protokole ma kluczowe znaczenie. Ze względu na uniwersalność platformy, w sposób precyzyjny i kontrolowany można przeprowadzać różnorodne reakcje biochemiczne i chemiczne. Zastosowanie mikroprzepływowych reaktorów przyspieszyło kolejne cykle testowe projektowania i budowy prototypów podwójnych obwodów genetycznych.

a-multilayer-microfluidic-platform-for-conduction-prolonged-cell-free

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Opisano mikrofabrykowane urządzenie z zamykanymi komorami reakcyjnymi o objętości femtolitrów. Raport ten zawiera protokół uszczelniania bezkomórkowych reagentów syntezy białek w tych komorach w celu zrozumienia roli stłoczenia i uwięzienia w ekspresji genów.

Zamykane matryce komór femtolitrowych dla biologii bezkomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Poznaj metodę wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego z PDMS do przedłużonej ekspresji białek bezkomórkowych, takich jak GFP. Ta platforma umożliwia precyzyjną kontrolę reakcji biochemicznych w badaniach nad biologią syntetyczną.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Przeglądaj więcej filmów