Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro
6 listopada 2019
Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.
Ten test in vitro wykazuje kiełkowanie angiogenne w wysokoprzepustowej i skalowalnej platformie. Można to wykorzystać do znalezienia nowych celów w angiogenezie. Ten test angiogenezy łączy złożone mikrośrodowiska komórkowe, które obejmują gradienty i perfuzję, z platformą, która jest kompatybilna z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi.
Angiogeneza odgrywa ważną rolę zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Zrozumienie mechanizmów zachodzących podczas angiogenezy może pomóc nam zrozumieć, w jaki sposób rosną nowotwory i jak naprawiają się tkanki. Metoda ta może dać wgląd w mechanizmy zachodzące podczas chorób sercowo-naczyniowych i regeneracji tkanek.
W obu przypadkach angiogeneza odgrywa ważną rolę. Przy pierwszym użyciu tej platformy mikroprzepływowej należy znać prawo objętości i sposób pipetowania. Możesz potwierdzić kroki, patrząc pod mikroskop lub odwracając płytkę do góry nogami.
Niektóre kroki są trudne do wyczucia podczas czytania metody, na przykład, jak małe są kanały mikroprzepływowe lub jak trzymać płytkę. Procedury te zademonstruje Wendy Stam, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć, przenieś 384-dołkową płytkę mikrofludyczną do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.
Zdejmij pokrywkę i dodaj 50 mikrolitrów wody lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do każdej z 40 studzienek obserwacyjnych za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra czterech miligramów na mililitr kolagenu jednego roztworu do wlotu żelu każdej jednostki mikroprzepływowej. Upewnij się, że kropla żelu jest umieszczona na środku każdej studzienki, aby żel dostał się do kanału.
Po napełnieniu pięciu jednostek mikroprzepływowych odwróć płytkę do góry nogami, aby wizualnie sprawdzić prawidłowe wypełnienie kanałów żelowych. Umieść płytkę mikrofludyczną w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 10 minut, aby spolimeryzować kolagen. Następnie wyjąć płytkę z inkubatora i przenieść do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.
Dodaj 50 mikrolitrów 10 mikrogramów na mililitr roztworu kodującego fibronektynę do studzienki wylotowej górnego kanału perfuzyjnego każdej jednostki mikroprzepływowej. Dociśnij końcówkę pipety do boku studzienki, aby prawidłowo napełnić studzienkę bez zatrzymywania pęcherzyków powietrza. Kanał napełnia się, a płyn miski na wylocie bez dobrego napełnienia wylotu.
Następnie umieść płytkę w inkubatorze na co najmniej dwa dni. Teraz szybko rozmrażaj zamrożone IPSC-EC przez mniej niż jedną minutę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i powoli dodaj 10 mililitrów podłoża podstawowego do rozcieńczenia.
Pobrać 10 mikrolitrów roztworu i policzyć komórki na liczniku komórek. Odwirować probówkę o sile 100 razy g przez pięć minut. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić w podłożu podstawowym, aby uzyskać stężenie dwa razy od 10 do siódmych komórek na mililitr.
Następnie przenieś 384-dołkową płytkę mikroprzepływową z inkubatora do sterylnego okapu z przepływem laminarnym. Odessać roztwór kodujący fibronektynę z wylotu perfuzji i dodać 25 mikrolitrów podłoża podstawowego do studzienek wylotowych. Dodaj jedną mikrolitrową kroplę zawiesiny komórkowej do każdej górnej studzienki perfuzyjnej.
Kropla spłaszcza się w ciągu kilku sekund. Sprawdź pod mikroskopem, czy wysiew jest jednorodny w obrębie jednego kanału i między kanałami. Inkubować płytkę dołka mikroprzepływowego przez jedną do 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Następnie sprawdź komórki, aby potwierdzić, że przylegają. Usuń podłoże podstawowe z górnych studzienek wylotowych perfuzji. Dodaj ciepłą pożywkę do hodowli naczyń w górnym wlocie i wylocie perfuzji.
Umieść płytkę na platformie kołyskowej, która jest ustawiona pod kątem siedmiu stopni i ośmiominutowym interwałem kołysania w inkubatorze. W pierwszym i drugim dniu po wysiewie zobrazuj płytkę za pomocą mikroskopu Brightfield z automatycznym stolikiem, aby potwierdzić żywotność komórek. Po dwóch dniach utworzyła się zlewająca się monowarstwa przeciwko rusztowaniu kolagenowemu.
Najpierw przygotuj 4,5 mililitra angiogennej pożywki do kiełkowania, uzupełniając 4,5 mililitra podłoża podstawowego 4,5 mikrolitra bulionu VEGF, 4,5 mikrolitra bulionu PMA i 2,25 mikrolitra bulionu S1P. Przygotuj 8,5 mililitra pożywki do wzrostu naczyń, uzupełniając podłoże podstawowe 5,1 mikrolitrami VEGF i 3,4 mikrolitrami BFGF. Odessać pożywkę ze studzienek i dodać 50 mikrolitrów pożywki do hodowli w świeżych naczyniach do górnych dołków wlotowych i wylotowych perfuzji oraz studzienek wlotowych i wylotowych żelu.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów angiogennej mieszaniny kiełków do każdej ze studzienek wlotowych i wylotowych dolnego kanału perfuzyjnego. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na platformie kołyskowej, aby utworzyć gradient angiogennych czynników wzrostu. Jeden dzień i dwa dni po dodaniu angiogennych czynników wzrostu użyj mikroskopu Brightfield, aby zobrazować studzienki na zautomatyzowanym stoliku.
Aby zbadać zespolenie i stabilizację kiełków, dodaj jeden mikrolitr 0,5 miligrama na mililitr fluorescencyjnie znakowanej albuminy do górnego wlotu perfuzji. Następnie wymieszaj roztwór za pomocą pipety o pojemności 50 mikrolitrów. Przenieś płytkę do mikroskopu fluorescencyjnego z automatycznym stolikiem i inkubatorem ustawionym na 37 stopni Celsjusza.
Ustaw mikroskop na obiektywie 10X i skoryguj ustawienia ekspozycji. Pobieraj zdjęcia poklatkowe co minutę przez 10 minut. Wyjmij płytkę z mikroskopu i przenieś ją do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.
Usunąć całą pożywkę z dołków i umieścić zarówno pożywkę do hodowli naczyniowych, jak i pożywkę do kiełkowania angiogennego w odpowiednich studzienkach. Umieść płytkę mikroprzepływową z powrotem w inkubatorze, aby kontynuować kiełkowanie angiogenne. Szóstego dnia powtórz obrazowanie, aby zbadać przepuszczalność.
Aby naprawić hodowlę komórkową, odessać wszystkie pożywki hodowlane z dołków. Dodaj 25 mikrolitrów 4% PFA w PBS do wszystkich studzienek wlotowych i wylotowych perfuzji. Następnie umieść jedną stronę płytki mikroprzepływowej na pokrywie pod niewielkim kątem pięciu stopni, aby wywołać przepływ.
Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać PFA ze studzienek. Umyj wszystkie wloty i wyloty perfuzji dwukrotnie 50 mikrolitrami HBSS.
Następnie odessać HBSS ze studzienek. Paraformaldehyd jest niebezpieczną substancją chemiczną, z którą należy obchodzić się w rękawiczkach i otwierać ją tylko w dygestorium. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego do wszystkich wlotów i wylotów perfuzji, aby przepuszczalność w temperaturze pokojowej przez 10 minut i umieścić płytkę mikroprzepływową na pokrywce pod niewielkim kątem pięciu stopni.
Odessać niejonowy środek powierzchniowo czynny ze studzienek i dwukrotnie przemyć kanały perfuzyjne, dodając 50 mikrolitrów HBSS do wszystkich studzienek wlotowych i wylotowych perfuzji. Odessać HBSS ze studzienek. Przygotuj Hoechst 1 000 do 2 000 do barwienia jąder i przygotuj falloidynę 100 do 200 w HBSS do barwienia F-aktyny.
Połącz sześć mililitrów HBSS, 30 mikrolitrów F-aktyny i trzy mikrolitry Hoechst w probówce Falcona. Następnie dodaj 25 mikrolitrów do każdego wlotu i wylotu perfuzji. Umieścić płytkę pod niewielkim kątem i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.
Przemyć dwukrotnie 50 mikrolitrami HBSS we wszystkich wlotach i wylotach perfuzyjnych. Następnie bezpośrednio zobrazuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego ze zautomatyzowanym stolikiem lub przechowuj płytkę zabezpieczoną przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. W tym protokole mikronaczynia były stale perfundowane i wystawione na działanie gradientu angiogennych czynników wzrostu.
Wysiew IPSC-EC przy użyciu metody pompowania pasywnego pozwolił uzyskać jednorodne gęstości wysiewu. Timelapse kropli, która jest umieszczona na szczycie wlotu kanału mikroprzepływowego, pokazuje kroplę zaraz po dodaniu, kroplę na górze pnia wlotowego po dodaniu, aż menisk kropli został przygwożdżony przez wlot, co spowodowało przepływ w kierunku wylotu. Ekspozycja na gradient czynników angiogennych spowodowała kierunkowe angiogenne kiełkowanie mikro naczyń w obrębie wzorzystego żelu kolagenowego.
Tworzenie się komórek czystej końcówki i inwazja do kolagenu, jeden żel był widoczny 24 godziny po dodaniu gradientu angiogennego, podczas gdy komórki podstawowe, w tym tworzenie światła, były widoczne po 48 godzinach. Po utrwaleniu i zabarwieniu zidentyfikowano kształt i długość tych kiełków. Jednak bez dodatku czynników wzrostu nie zaobserwowano inwazji do kolagenu jednego żelu.
Za pomocą obrazowania konfokalnego określono średnicę kiełka i potwierdzono tworzenie się światła. Metoda ta może być wykorzystana do badań przesiewowych w kierunku nowych inhibitorów angiogennych. Może to pomóc w znalezieniu nowych metod leczenia retinopatii cukrzycowej, reumatoidalnego zapalenia stawów i raka.
Obecnie badamy, w jaki sposób możemy stworzyć kokultury, w tym model bariery krew-mózg i unaczynione organoidy.
Przegląd
Metoda ta opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC w formie perfundowanych 3D mikro naczyń w zestandaryzowanej platformie mikrofluidycznej. Platforma ta umożliwia badanie napędzanego gradientem kiełkowania angiogennego w 3D, w tym anastomozy i stabilizacji pąków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Angiogeneza
Wstęp
- Angiogeneza odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobach.
- Zrozumienie angiogenezy może dostarczyć cennych informacji na temat wzrostu nowotworów i regeneracji tkanek.
- W niniejszym badaniu wykorzystano platformę mikroprzepływową do analizy procesów angiogennych.
- Opisana metoda umożliwia wysokoprzepustowy screening angiogenezy.
Cel badania
- Opracowanie skalowalnej platformy do badania pączkowania angiogennego.
- Zbadanie mechanizmów angiogenezy istotnych dla chorób układu sercowo-naczyniowego oraz regeneracji tkanek.
- Identyfikacja nowych celów w badaniach nad angiogenezą.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek śródbłonka pochodzących z iPSC na platformie mikroprzepływowej.
- Wykorzystanie kolagenu i fibronektyny w celu stworzenia odpowiedniego środowiska do wzrostu komórek.
- Zastosowanie angiogennych czynników wzrostu w celu stymulacji pączkowania.
- Techniki obrazowania służące do monitorowania zachowania komórek i tworzenia pączków.
Główne wyniki
- Pomyślne utworzenie konfluencyjnej warstwy pojedynczej komórek śródbłonka.
- Obserwacja pączkowania angiogennego i anastomozy w kontrolowanych warunkach.
- Wykazanie zdolności platformy do analizy wysokoprzepustowej.
- Zrozumienie dynamiki angiogenezy w czasie.
Wnioski
- Platforma mikrofluidyczna jest skuteczna w badaniu angiogenezy.
- Metoda ta może zwiększyć zrozumienie rozwoju i patologii naczyń krwionośnych.
- Potencjalne zastosowania w odkrywaniu leków oraz medycynie regeneracyjnej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejszy test odpowiada na krytyczną potrzebę opracowania fizjologicznie istotnych, wysokoprzepustowych modeli w badaniach nad lekami naczyniowymi, łącząc komórki śródbłonka pochodzące z iPSC z możliwością perfuzji i tworzenia gradientów w formacie mikrofluidycznym. Umożliwia on mechanistyczną minimalizację ryzyka w przypadku celów angiogennych poprzez standaryzowaną i skalowalną obserwację dynamiki komórek wierzchołkowych (tip cells) i pniowych (stalk cells) oraz tworzenia światła naczynia. Platforma ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych, łącząc istotność fizjologiczną z kompatybilnością z infrastrukturą przesiewową.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów angiogenezy poprzez kontrolowaną ekspozycję na gradient i perfuzję, co wspiera testowanie postawionych hipotez.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne tworzenie perfuzowalnego światła naczynia oraz różnicowanie komórek na komórki wierzchołkowe (tip) i pniowe (stalk) jako ilościowe wskaźniki oddziaływania na cel.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie kluczowych cech angiogenezy w systemie pochodzącym z ludzkich iPSC, istotnym z punktu widzenia badań nad człowiekiem.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane dotyczące przepuszczalności poprzez badania anastomozy z użyciem znaczników fluorescencyjnych, co umożliwia ocenę efektu działania związków.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany format 384-dołkowy z wysiewem opartym na pompowaniu pasywnym, co pozwala na homogeniczną i skalowalną dystrybucję komórek śródbłonka w 40 mikronaczyniach na płytkę.
- Wartość naukowa: Ułatwia analizę zależności dawka-odpowiedź inhibitorów angiogenezy poprzez obrazowanie time-lapse inwazji i stabilizacji wypustek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje ludzką patofizjologię naczyniową istotną dla nowotworów, retinopatii cukrzycowej i reumatoidalnego zapalenia stawów poprzez proces kiełkowania indukowany przez VEGF/PMA/S1P.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną ocenę od momentu formowania monowarstwy po anastomozę i testy przepuszczalności w ciągu sześciu dni.
- Wartość naukowa: Wspiera translacyjne dopasowanie biomarkerów poprzez korelację integralności światła naczynia i dynamiki kiełkowania z modulacją szlaku angiogennego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając oparty na ludzkich komórkach test angiogenezy z możliwością perfuzji, który jest przeprowadzany po identyfikacji celu, a przed walidacją przedkliniczną, oferując wgląd w mechanizmy działania przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i funkcjonalną walidację celów poprzez indukowane gradientem kiełkowanie i anastomozę w perfundowanym mikrośrodowisku 3D.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki jednostkom mikrofluidycznym powlekanym kolagenem/fibronektyną, kompatybilnym z automatycznym obrazowaniem do wysokoprzepustowego przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie długości kiełków, tworzenia światła naczyń oraz zmian przepuszczalności jako kluczowych parametrów dla relacji struktura-aktywność.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie ludzkich odpowiedzi angiogennych w warunkach istotnych dla danej choroby z wykorzystaniem EC pochodzących z iPSC.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania szlaków angiogennych w wielu projektach dzięki ustandaryzowanemu formatowi mikrofluidycznemu i skalowalnym odczytom.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie wiarygodności predykcyjnej w walidacji celu poprzez perfuzję fizjologiczną i warunki gradientowe, które naśladują mikrośrodowisko angiogenne in vivo.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i skalowalność dzięki zastosowaniu mikrofluidyki w płytkach 384-dołkowych, siewowi z wykorzystaniem pompowania pasywnego oraz kompatybilności z automatycznym obrazowaniem stołu mikroskopowego.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modulacji celów angiogennych dzięki bezpośredniej obserwacji kiełkowania i anastomozy.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko dzięki ilościowym danym dotyczącym przepuszczalności i tworzenia kiełków, które informują o alokacji kapitału w programach leków naczyniowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi mikrofluidyki, hodowli iPSC-EC oraz przygotowania medium angiogennego, zgodnie z opisem w protokole.
- Metoda zależy od dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej z automatycznym stolikiem oraz zintegrowaną z inkubatorem platformą kołyszącą do tworzenia gradientów.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja czasu perfuzji, wymiany mediów oraz protokołów fiksacji w celu uzyskania powtarzalnych wyników w zakresie kiełkowania i anastomozy.
- Wymagane są rozważania dotyczące adaptacji do modeli kokultur, takich jak bariera krew-mózg lub unaczynione organoidy, co odnotowano w trwających badaniach eksploracyjnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność precyzyjnego wypełnienia kanałów żelowych oraz perfuzji bez pęcherzyków powietrza, aby zapewnić jednorodny przepływ i kierunkowość kiełkowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:12
Preparation of Device, Gel, and Coating
2:42
Cell Seeding/Microvessel Culture
4:37
Study Angiogenic Sprouting
5:49
Study Anastomosis and Sprout Stabilization
6:50
Fixation, Staining, and Imaging
8:55
Results: Cell Seeding and 3D Sprouting of iPSC-EC
10:13
Conclusion
