Name: Zależna od DNAzymu analiza 2-O-metylacji rRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę analizy 2'-O-metylacji RNA zależną od DNAzymów w Saccharomyces cerevisiae. Szybkie i ekonomiczne podejście do badania modyfikacji rRNA kierowanych przez snoRNA w standardowym laboratorium biologii molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mayi Wilson i Aneice Leney za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta była wspierana przez stypendium Sir Henry'ego Dale'a ufundowane wspólnie przez Wellcome Trust i Royal Society (200473/Z/16/Z).

1. Szczepy, podłoża i receptury buforowe
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę drożdżową (S. cerevisiae) zgodnie z opisem tutaj: YP (1% w/v ekstraktu drożdżowego, 2% w/v peptonu bakteriologicznego) oraz zapasy glukozy i galaktozy w stężeniu 20% w/v.</li>
	<li>Przygotować bufor octanu sodu (NaAc)-EDTA (AE) zgodnie z opisem tutaj: 50 mM NaAc pH 5,3 i 10 mM EDTA.</li>
	<li>Przygotuj 10-23 DNAzyme 4x bufor inkubacyjny zgodnie z opisem tutaj: 24 mM Tris pH 8,0, 60 mM NaCl i 10-23 DNAzyme 4x Bufor reakcyjny: 200 mM Tris pH 8,0 i 600 mM NaCl.</li>
	<li>Przygotuj 8-17 DNAzyme 2x bufor reakcyjny zgodnie z opisem tutaj: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2 i 15 mM MnCl2.</li>
	<li>Przygotuj 10x bufor MOPS zgodnie z opisem tutaj: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 i 1,5x Bufor do denaturacji próbki: 50% v/v formamidu, 20% v/v formaldehydu, 1,5x bufor MOPS.</li>
	<li>Otrzymanie szczepów S. cerevisiae, BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1::SNR13 (jako BY4741, ale GAL1::SNR13:KANmX); GAL1::SNR47 (jako BY4741, ale GAL1::SNR47:HIS3mX). Do tej analizy można użyć dowolnego innego szczepu drożdży.</li>
</ol>
2. Projekt DNAzyme
<ol>
	<li>Znajdź interesującą sekwencję RNA lub przypuszczalne miejsce metylacji, korzystając z odpowiedniej bazy danych. W przypadku celów snoRNA S. cerevisiae należy użyć bazy danych snoRNA drożdży: http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14</li>
	<li>Aby znaleźć interesujące nas miejsce metylacji, np. miejsce zależne od snR13, wybierz "snR13" i zanotuj położenie zmodyfikowanego nukleotydu (np. A2281 kierowanego snR13 w 25S rRNA).</li>
	<li>Znajdź sekwencje przed i za zmodyfikowanym nukleotydem, korzystając z odpowiedniej bazy danych. W przypadku S. cerevisiae należy skorzystać z bazy danych genomu Saccharomyces: https://www.yeastgenome.org/</li>
	<li>Wyszukaj nazwę docelowego genu, np. RDN25 (kodujący 25S rRNA).</li>
	<li>Z zakładki "sekwencja" wybierz 10-15 nukleotydów przed (ramię 5') i za (ramię 3') miejsca metylacji przy użyciu testu 10-23 DNAzyme i 20 nukleotydów przed (ramię 5') i za (ramię 3') dla 8-17 DNAzymu.</li>
	<li>Twórz komplementarne sekwencje ramion 5' i 3'.</li>
	<li>Flankuj sekwencję katalityczną 10-23 lub 8-17 DNAzyme z komplementarnymi sekwencjami ramion 5' i 3'.</li>
	<li>Zamów DNAzyme jako normalny oligonukleotyd DNA od dostawcy.</li>
</ol>
3. Warunki wzrostu S. cerevisiae
UWAGA: Użyto pochodnych szczepu S. cerevisiae BY4741, w których ekspresja snoRNA SNR13 lub SNR47 jest sterowana przez indukowalny promotor GAL1. W celu indukcji lub zahamowania ich syntezy należy hodować komórki na pożywce zawierającej galaktozę (transkrypcja zależna od GAL1) lub glukozę (transkrypcja zależna od GAL1). Jako kontrolę użyj szczepu typu dzikiego (BY4741) uprawianego na galaktozie lub glukozie.
<ol>
	<li>Uprawiaj szczepy drożdży w odpowiednim podłożu i warunkach. Aby przeanalizować szczepy GAL1::SNR13 i GAL1::SNR47, a także izogeniczny szczep typu dzikiego, należy wyhodować komórki w 50 ml pożywki YP z 2% glukozą (YPD) lub galaktozą (YPGal) w temperaturze 30 °C do środkowej fazy wykładniczej.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i zachować granulki.</li>
	<li>Zamrażać granulki komórkowe w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C. 
	ostrożność: Ciekły azot może powodować poważne oparzenia kriogeniczne. Zawsze noś odzież ochronną i środki ostrożności podczas ćwiczeń. 
	nuta: Granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C do 1 miesiąca. W razie potrzeby protokół można w tym miejscu wstrzymać.</li>
</ol>
4. Izolacja RNA15
UWAGA: Użyj najbardziej odpowiedniej metody do izolacji RNA. W przypadku drożdży S. cerevisiae można zastosować ekstrakcję RNA gorącym fenolem.
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml lodowatej wody, ponownie zawieś granulki i przenieś zawieszone komórki do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 20 000 x g przez 10 s w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 400 μl buforu AE i ponownie zawiesić komórki. 
	nuta: Kroki 4.4-4.15 wykonuje się w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
	<li>Dodać 40 μl 10% SDS i 400 μl kwaśnego fenolu (pH 4,5). 
	ostrożność: Fenol jest toksyczny i powinien być przenoszony pod wyciągiem. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary podczas pracy z fenolem. Utylizować odpady zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj, wirując przez 20 sekund.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Co 2 minuty delikatnie otwieraj i zamykaj rurkę, aby zwolnić ciśnienie i obróć rurkę 2-3 razy, aby wymieszać fazy.</li>
	<li>Przenieść probówki do temperatury -80 °C i inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Rozmrozić probówki na stole i odwirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść górną fazę do nowej probówki zawierającej 400 μl kwasu fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1). Nie zakłócaj interphase. 
	ostrożność: Chloroform jest toksyczny i powinien być przenoszony pod wyciągiem. Podczas pracy z chloroformem zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary. Odpady należy utylizować zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.</li>
	<li>Dobrze wymieszać przez wirowanie przez 30 s i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść górną fazę (~400 μL) do nowej probówki zawierającej 400 μL chloroformu.</li>
	<li>Dobrze wymieszać przez wirowanie przez 30 s i odwirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś górną fazę (~300-350 μL) do nowej probówki zawierającej 1 ml EtOH i 40 μl 7,5 M octanu amonu (NH4AC). Wymieszaj, obracając rurkę kilka razy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze -80 °C przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze -20 °C. 
	nuta: W tym miejscu procedurę można wstrzymać.</li>
	<li>Wirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki pojawi się mały, biały granulek RNA.</li>
	<li>Usunąć EtOH przez pipetowanie, aby uniknąć naruszenia osadu.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 70% EtOH i odwiruj przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć 70% EtOH przez pipetowanie.</li>
	<li>Wirować przy 20 000 x g przez 15 s i usunąć pozostały EtOH za pomocą pipety o pojemności 2-20 μl.</li>
	<li>Pozostaw probówkę otwartą na ławce na 5 minut, aby wysuszyć osad RNA. 
	nuta: Osad RNA po wyschnięciu zmienia kolor z białego na przezroczysty</li>.
	<li>Zawiesić osad RNA w 30 μlH2Owolnego od RNaz/DNaz, natychmiast przenieść probówkę na lód i zmierzyć stężenie RNA na mikrospektrofotometrze.</li>
	<li>Zamrażać próbki w temperaturze -20 °C. 
	nuta: RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca i w temperaturze -80 °C do 1 roku. Procedurę można w tym miejscu wstrzymać lub przejść bezpośrednio do następnego kroku.</li>
</ol>
5. Trawienie DNAzymu
<ol>
	<li>10-23 DNAtrawienie zymu
	<ol>
		<li>W probówkach o pojemności 1,5 ml przygotuj mieszaninę inkubacyjną, łącząc 5 μg RNA, 200 pmol 10-23 DNAzymu (2 μl 100 μM roztworu podstawowego) i 2,5 μl 4x 10-23 buforu inkubacyjnego w całkowitej objętości 10 μL. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
		<li>Przenieść probówki do suchego bloku grzewczego ustawionego w temperaturze 95 °C i inkubować przez 3 minuty.</li>
		<li>Natychmiast przenieś probówki na lód i inkubuj przez 5 minut.</li>
		<li>Odkręć na chwilę i połóż rurki z powrotem na lodzie.</li>
		<li>Dodać 20 j. inhibitora RNazy (np. 0,5 μl inhibitora RNazy RiboLock).</li>
		<li>Umieścić probówki w suchym bloku grzewczym ustawionym na 25 °C i inkubować przez 10 minut.</li>
		<li>W międzyczasie należy przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce o pojemności 1,5 μl, łącząc 5 μl 4x 10-23 buforu reakcyjnego z 4 μl 300 mM MgCl2 i 1 μLH2O. Umieścić probówkę w suchym bloku ustawionym na 37 °C.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę inkubacyjną do suchego bloku grzewczego ustawionego na 37 °C i dodać 10 μl wstępnie podgrzanej mieszaniny reakcyjnej.</li>
		<li>Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przenieś probówki na lód i przejdź do kroku 5.3.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>8-17 DNAtrawienie zymu
	<ol>
		<li>Przygotować mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml z 5 μg RNA w łącznej objętości 6 μl. Probówkę należy trzymać na lodzie.</li>
		<li>Przygotuj mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml z 400 pmol 8-17 DNAzyme (4 μl ze 100 μM zapasu). Trzymaj probówkę na lodzie.</li>
		<li>Przenieść probówki do suchego bloku grzewczego ustawionego na 95 °C i inkubować przez 2 minuty.</li>
		<li>Przenieś próbkę RNA na lodzie.</li>
		<li>Wirować probówkę z DNAzymem przez 5 s i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut.</li>
		<li>W tym samym czasie przygotować probówkę o pojemności 1,5 ml z 10 μl 2x 8-17 buforu reakcyjnego i inkubować w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną, dodając 10 μl wstępnie podgrzanego buforu reakcyjnego 2x do probówki z DNAzymem.</li>
		<li>Przenieść 14 μl mieszaniny reakcyjnej do probówki z RNA i dodać 20 j. inhibitora RNazy.</li>
		<li>Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Przenieść probówkę na lód i przystąpić do oczyszczania RNA (krok 5.3.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie RNA
	<ol>
		<li>Dodać 350 μl wody i 400 μl chloroformu do probówki reakcyjnej, dobrze wymieszać przez wirowanie przez 30 s i odwirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieś górną fazę (~300-350 μL) do nowej probówki zawierającej 1 ml EtOH, 40 μl 7,5 M NH4AC i 1 μl glikogenu (10 μg/μL). Wymieszaj, obracając rurkę kilka razy.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze -80 °C przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze -20 °C. 
		nuta: W tym miejscu procedurę można wstrzymać.</li>
		<li>Powtórz kroki od 4.15 do 4.21.</li>
		<li>Zawiesić osad RNA w 10 μl H2O wolnego od RNazy/DNaz i natychmiast przenieść probówki na lód.</li>
		<li>Zamrażać próbki w temperaturze -20 °C. 
		nuta: RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C do miesiąca i w temperaturze -80 °C do 1 roku. W tym miejscu procedurę można przerwać lub przejść do elektroforezy RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Elektroforeza RNA
<ol>
	<li>Spryskaj sprzęt do elektroforezy (zbiornik, tackę, grzebień) 1% SDS, pozostaw na 15 minut i spłucz dużą ilością ddH2O.</li>
	<li>Rozpuść 1,5 g agarozy w 127,5 ml ddH2O, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej.</li>
	<li>Dodaj 15 ml 10x MOPS i 7,5 ml 37% formaldehydu do roztworu agarozy (całkowita objętość wynosi 150 ml). 
	ostrożność: Formaldehyd jest toksyczny i powinien być przenoszony pod wyciągiem. Podczas pracy z formaldehydem zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary. Odpady należy utylizować zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.</li>
	<li>Do roztworu agarozy dodać odpowiednią ilość wybranego barwnika żelowego (np. 15 μl barwnika żelowego SYBR Safe DNA). Dobrze wymieszaj i wlej agarozę na tacę.</li>
	<li>Natychmiast włóż grzebień do żelu.</li>
	<li>Pozostaw na 45 minut pod wyciągiem. Przykryj tacę folią aluminiową, gdy używasz światłoczułej plamy z żelu.</li>
	<li>Przygotuj 600 ml 1x buforu MOPS.</li>
	<li>Przygotowanie próbki RNA
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml połącz 10 μl strawionej i oczyszczonej próbki RNA, 5 μl buforu do denaturacji próbki i 0,5 μl 6-krotnego barwnika ładującego. 
		ostrożność: Formamid jest toksyczny i należy go obchodzić pod wyciągiem. Podczas pracy z formamidem należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary. Odpady należy utylizować zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.</li>
		<li>Próbki RNA inkubować w temperaturze 70 °C przez 5 minut. Próbki przenieść na lód. Inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Odkręć na chwilę przed załadowaniem żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść żel w zbiorniku do elektroforezy i napełnij 1x buforem MOPS. Załadować całą objętość każdej próbki (15 μl) na żel. Pracować pod napięciem 80 V, aż błękit bromofenolowy osiągnie 2/3 długości żelu.</li>
	<li>Zobrazuj żel za pomocą imagera odpowiedniego do wykrycia wybranej plamy żelowej (np. transilluminator UV).</li>
</ol>

<ol><li>Dieci, G., Preti, M., Montanini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+snoRNAs%3A+a+paradigm+for+gene+expression+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic snoRNAs: a paradigm for gene expression flexibility.</a> Genomics. 94 (2), 83-88 (2009).</li>
<li>Watkins, N. J., Bohnsack, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+box+C%2FD+and+H%2FACA+snoRNPs%3A+key+players+in+the+modification%2C+processing+and+the+dynamic+folding+of+ribosomal+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Review+RNA%22%5BJournal%5D)">The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA.</a> Wiley Interdisciplinary Review RNA. 3 (3), 397-414 (2012).</li>
<li>Kufel, J., Grzechnik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Nucleolar+RNAs+Tell+a+Different+Tale%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small Nucleolar RNAs Tell a Different Tale.</a> Trends in Genetics. , (2018).</li>
<li>Li, T., Zhou, X., Wang, X., Zhu, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+human+snoRNA+core+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of human snoRNA core promoters.</a> Genomics. 96 (1), 50-56 (2010).</li>
<li>Jorjani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+human+snoRNAome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An updated human snoRNAome.</a> Nucleic Acids Research. 44 (11), 5068-5082 (2016).</li>
<li>Hubbard, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2009.</a> Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D690-D697 (2009).</li>
<li>Makarova, J. A., Kramerov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNOntology%3A+Myriads+of+novel+snoRNAs+or+just+a+mirage%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">SNOntology: Myriads of novel snoRNAs or just a mirage?</a> BMC Genomics. 12, 543(2011).</li>
<li>Yu, Y. T., Shu, M. D., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+detecting+sites+of+2%27-O-methylation+in+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A new method for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules.</a> RNA. 3 (3), 324-331 (1997).</li>
<li>Decatur, W. A., Liang, X. H., Piekna-Przybylska, D., Fournier, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+effects+of+snoRNA-guided+modifications+on+the+synthesis+and+function+of+the+yeast+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identifying effects of snoRNA-guided modifications on the synthesis and function of the yeast ribosome.</a> Methods in Enzymology. 425, 283-316 (2007).</li>
<li>Dong, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTL-P%3A+a+sensitive+approach+for+detecting+sites+of+2%27-O-methylation+in+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RTL-P: a sensitive approach for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e157(2012).</li>
<li>Birkedal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+ribose+methylations+in+RNA+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%2C+England%22%5BJournal%5D)">Profiling of ribose methylations in RNA by high-throughput sequencing.</a> Angewandte Chemie International Edition, England. 54 (2), 451-455 (2015).</li>
<li>Buchhaupt, M., Peifer, C., Entian, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+2%27-O-methylated+nucleosides+and+pseudouridines+in+ribosomal+RNAs+using+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of 2'-O-methylated nucleosides and pseudouridines in ribosomal RNAs using DNAzymes.</a> Analytical Biochemistry. 361 (1), 102-108 (2007).</li>
<li>Grzechnik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fate+of+yeast+snoRNA+is+determined+by+co-transcriptional+Rnt1+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Nuclear fate of yeast snoRNA is determined by co-transcriptional Rnt1 cleavage.</a> Nature Communication. 9 (1), 1783(2018).</li>
<li>Piekna-Przybylska, D., Decatur, W. A., Fournier, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+bioinformatic+tools+for+analysis+of+nucleotide+modifications+in+eukaryotic+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">New bioinformatic tools for analysis of nucleotide modifications in eukaryotic rRNA.</a> RNA. 13 (3), 305-312 (2007).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18 (10), 3091-3092 (1990).</li>
<li>Maden, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+2%27-O-methyl+groups+in+ribosomal+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA.</a> Methods. 25 (3), 374-382 (2001).</li>
<li>Santoro, S. W., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+purpose+RNA-cleaving+DNA+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme.</a> Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A. 94 (9), 4262-4266 (1997).</li>
<li>Hengesbach, M., Meusburger, M., Lyko, F., Helm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+DNAzymes+for+site-specific+analysis+of+ribonucleotide+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Use of DNAzymes for site-specific analysis of ribonucleotide modifications.</a> RNA. 14 (1), 180-187 (2008).</li>
<li>Sednev, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29+-Methyladenosine-Sensitive+RNA-Cleaving+Deoxyribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%2C+England%22%5BJournal%5D)">N(6) -Methyladenosine-Sensitive RNA-Cleaving Deoxyribozymes.</a> Angewandte Chemie International Edition, England. 57 (6), 15117-15121 (2018).</li>
<li>Aschenbrenner, J., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+site-specific+quantification+of+RNA+2%27-O-methylation+by+PCR+with+an+engineered+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Direct and site-specific quantification of RNA 2'-O-methylation by PCR with an engineered DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Research. 44 (8), 3495-3502 (2016).</li>
<li>Lee, K. W., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+2%27-O-methyltransferases+to+modification+sites+on+the+mammalian+mitochondrial+large+subunit+16+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assignment of 2'-O-methyltransferases to modification sites on the mammalian mitochondrial large subunit 16 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (36), 24936-24942 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Trawienie zależne od DNAzymu może być stosowane jako prosta i szybka metoda analizy specyficznej dla miejsca metylacji 2'-O RNA12,13. DNAzymy rozszczepiają RNA, jeśli nukleotyd znajdujący się przed miejscem rozszczepienia nie jest metylowany. W przeciwieństwie do innych podejść, w tym trawienia kierowanego przez RNazę H, degradacji alkalicznej lub odwrotnej transkrypcji w niskich stężeniach nukleotydów, a następnie ilościowego PCR lub sekwencjonowania 8,10,11,16, podejście DNAzyme wymaga prostego oligonukleotydu DNA i podstawowych odczynników, które są obecne w każdym laboratorium biologii molekularnej. Co więcej, DNAzymy mogą być wykorzystywane w podobny sposób do analizy pseudourydylacji RNA, w której pośredniczy snoRNA12 box H/ACA, co czyni je wszechstronnymi narzędziami w badaniu celów snoRNA.
Podejścia zależne od DNAzymu są ograniczone jedynie przez sekwencje konsensusu miejsca rozszczepienia17. 10-23 DNAzymy mogą być używane do analizy metylacji 2'-O tylko w pozycji R dinukleotydu RY, podczas gdy DNAzymy 8-17 rozpoznają modyfikację nukleotydu znajdującego się przed guaniną. W rezultacie nie można analizować modyfikacji, takich jak metylacja 2'-O pierwszego nukleotydu w dinukleotydach guanina-adenina (GA), adenina-adenina (AA), pirymidyno-adenina (YA) i pirymidyna-pirymidyna (YY). Ponadto należy wziąć pod uwagę niską skuteczność rozszczepienia DNAzymezależnego od 12 . Chociaż niektóre DNAzymy rozszczepiają RNA prawie całkowicie (Figura 3B), wiele DNAzymów tylko częściowo trawi swoje cele (Figura 3B). Skuteczność może zależeć od sekwencji otaczającej miejsce rozszczepienia. Na przykład regiony RNA z odcinkami tego samego nukleotydu mogą wpływać na prawidłowe pozycjonowanie sekwencji aktywnej DNAzyme. Co więcej, regiony RNA tworzące silną strukturę drugorzędową mogą ponownie hybrydyzować i hamować wiązanie DNAzymu z sekwencją docelową. Aby przezwyciężyć te problemy, można zastosować cykle ogrzewania i chłodzenia 10-23 DNAzymu i jego substratu RNA18.
Zastosowaliśmy podejście DNAzyme do zbadania metylacji 2'-O rRNA. Można również użyć tej techniki do analizy innych modyfikacji RNA, takich jak N 6-metyloadenozyna19. Rybosomalne RNA, ze względu na swoją obfitość, można analizować za pomocą elektroforezy, a produkty rozszczepienia można uwidocznić w świetle UV. Nie dotyczy to jednak mniej licznych RNA, takich jak kodujące RNA (mRNA) i niekodujące RNA (ncRNA) generowane przez polimerazę II. Te RNA zwykle nie mogą być wykryte bezpośrednio przez barwienie RNA w żelach agarozowych lub poliakrylamidowych. W takich przypadkach rozszczepienie zależne od DNAzymu można uwidocznić za pomocą Northern blot, pośrednio wykryć za pomocą PCR/ilościowego PCR lub przeanalizować za pomocą ilościowego PCR z polimerazami (np. Polimerazą DNA KlenTaq) zdolnymi do odróżnienia 2′-O-metylowanego RNA od niemetylowanego RNA20,21.

Modyfikacje RNA odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów. Metylacja 2'-O i pseudourydylacja RNA, które są kierowane odpowiednio przez małe jąderkowe RNA (snoRNA) w pudełku C/D i w pudełku H/ACA, chronią RNA przed degradacją i stabilizują ich struktury wyższego rzędu1,2,3. Cele SnoRNA zostały zidentyfikowane głównie w rybosomalnych RNA (rRNA) i małych jądrowych RNA (snRNA). Jednak u wyższych eukariontów istnieją potencjalnie setki snoRNA bez przypisanych funkcji, a niektóre z nich mogą rozpoznawać wiele RNA1,4,5,6,7. Dlatego też metody, które pozwalają na identyfikację i analizę modyfikacji sterowanych przez snoRNA, są ważnymi narzędziami w odkrywaniu mechanizmów rządzących procesami komórkowymi.
A pole C/D domniemane miejsce metylacji 2'-O snoRNA może być zidentyfikowane bioinformatyczną i potwierdzone eksperymentalnie za pomocą wielu technik, w tym rozszczepienia skierowanego przez RNazę H, lub metod specyficznych dla miejsca i całego genomu, które wykorzystują odwrotną transkrypcję w podejściu o niskim stężeniu nukleotydów (dNTPs)8,9,10,11. Techniki te są bardzo czułe, ale także pracochłonne i kosztowne, dlatego mogą nie być odpowiednie do wstępnych lub szybkich testów. Jedną z najprostszych i najtańszych metod identyfikacji miejsc metylacji 2'-O jest DNAzyme-zależne od DNA rozszczepienie RNA12. DNAzymy to krótkie, jednoniciowe i katalitycznie aktywne cząsteczki DNA zdolne do endonukleolitycznego rozszczepienia RNA w określonych pozycjach. Składają się one z konserwatywnej i katalitycznie aktywnej sekwencji rdzenia oraz ramion wiążących 5' i 3' złożonych ze zmiennych sekwencji zaprojektowanych do hybrydyzacji przez parowanie zasad Watsona-Cricka z celem RNA (<silna klasa = "xfig">Figura 1). W ten sposób ramiona 5' i 3' dostarczają sekwencję katalityczną do określonego miejsca RNA. Rozszczepienie zależne od DNAzymu jest hamowane przez 2'-O-metylację nukleotydu umieszczonego bezpośrednio przed miejscem rozszczepienia12,13. To sprawia, że DNAzymes jest bardzo praktycznym narzędziem do analizy przypuszczalnych lub znanych miejsc metylacji 2'-O RNA.
Dwa rodzaje DNAzymów są używane do analiz modyfikacji RNA12. Aktywna sekwencja 10-23 DNAzyme (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) składa się z 15 nukleotydów (5'RGGCTAGCTACAACGA3'), które tworzą pętlę wokół docelowego dinukleotydu RNA puryna-pirymidyny (RY) i katalizują rozszczepienie między tymi dwoma nukleotydami. Puryna RNA (R) nie jest sparowana z DNAzymem, a metylacja 2'-O obecna na DNAzymie hamuje rozszczepienie. Ramiona wiążące 10-23 DNAzymy mają zwykle długość 10-15 nukleotydów. Druga klasa DNAzyme, 8-17 DNAzymes (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) zawiera 14-nukleotydową sekwencję katalityczną (5'TCCGAGCCGGACGA3'). NukleotydyC2, C, 3 iG4 łączą się z C, 9, G, 10 iG11, tworząc krótką strukturę łodygowo-pętlową. 8-17 DNAzymy rozszczepiają RNA przed dowolną guaniną, która jest nieidealnie sparowana z pierwszą tyminą z aktywnej sekwencji DNAzyme. Nukleotyd RNA przed guaniną nie jest sparowany z DNAzymem, a jego metylacja 2'-O upośledza rozszczepienie. 8-17 DNAzymy wymagają dłuższych ramion homologicznych wynoszących około 20 nukleotydów, aby skierować DNAzyme do jego określonej sekwencji.
Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół analizy 2'-O-metylacji rRNA w Saccharomyces cerevisiae przy użyciu podejść zależnych od DNAzyme 10-23 i 8-1712,13 (Rysunek 1C). Protokół ten można łatwo dostosować do innych organizmów i gatunków RNA i zastosować do szybkich, wstępnych lub głównych analiz specyficznej dla miejsca metylacji 2'-O-M RNA.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acid fenol</td><td>SIGMA</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>VWR</td><td>A2114</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>SIGMA</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Chlorophorm</td><td>Fisher scientific</td><td>10293850</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od DNazy/RNaz</td><td>Fischer Scientific</td><td>10526945</td><td></td></tr><tr><td>DNAzyme</td><td>Zintegrowana technologia DNA</td><td>Niestandardowe oligo DNA</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Fisher 10437341</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Galaktoza</td><td>SIGMA</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>SIGMA</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Izoamyl</td><td>SIGMA</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>SIGMA</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>SIGMA</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Pepton Bakteriologiczny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży oxoidowych w proszku</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>RNaza RiboLock Inhibitor (40 U/&mikro; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SIGMA</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Trójwodny octan sodu</td><td>SIGMA</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczna plama żelowa DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris baza</td><td>SIGMA</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>silny>Nazwa</td><td>Firma</silny> </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL mikroprobówki</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>152VR5C01M -80&deg; Zamrażarka C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Kolby Erlenmeyera</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Combicup VX200 vortex</td> Mikrospektrofotometr <td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-11</td><td>Denovix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora do elektroforezy (taca 20 cm)</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miernik pH FiveEasy F20</td> System dokumentacji żelu <td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikrowirówka Syngene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 21</td><td>Wirówka Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 8R z rotatorem odpowiednia do probówek stożkowych 50 ml</td><td>Wirówka Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge Plus</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik HC blok termiczny</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OLS26 Kąpiel z wytrząsaniem</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac zasilacz</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zależna od dnazymu analiza 2'-o-metylacji rrna

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D małe jąderkowe RNA (snoRNA) katalizują 2'-O-metylację rybosomalnego i małego jądrowego RNA. Jednak duża liczba snoRNA u wyższych eukariontów może rozwiązle rozpoznawać inne gatunki RNA i wiele celów 2'-O-metylanu. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik krok po kroku dotyczący szybkiej i niedrogiej analizy specyficznej dla miejsca metylacji 2'-O przy użyciu dobrze znanej metody wykorzystującej krótkie oligonukleotydy DNA zwane DNAzymes. Te fragmenty DNA zawierają sekwencje katalityczne, które rozszczepiają RNA w określonych pozycjach konsensusu, a także zmienne ramiona homologiczne kierujące DNAzyme do jego celów RNA. Aktywność DNAzymu jest hamowana przez 2-'O-metylację nukleotydu sąsiadującego z miejscem cięcia w RNA. Tak więc DNAzymy, ograniczone jedynie konsensusem rozszczepionej sekwencji, są doskonałymi narzędziami do szybkiej analizy 2'-O-metylacji RNA za pośrednictwem snoRNA. Przeanalizowaliśmy snoRNA snR13- i snR47 sterowaną 2'-O-metylacją rybosomalnego RNA 25S w Saccharomyces cerevisiae, aby zademonstrować prostotę techniki i zapewnić szczegółowy protokół testu zależnego od DNAzyme.

Użyteczność cięcia zależnego od DNAzymu w analizie modyfikacji rRNA została niedawno wykazana w kontekście dojrzewania snoRNA13. Analiza zależna od DNAzymu została wykorzystana do wykazania, że brak przetwarzania 5’-końca pre-snoRNA wpływa na poziomy 2’-O-metylacji 25S i 18S rRNA w S. cerevisiae13.
W tym przypadku wykorzystano indukowalny system transkrypcji snoRNA, aby zademonstrować skuteczność i prostotę tej techniki. snoRNA Box C/D snR13 kieruje metylację w dwóch pozycjach 25S rRNA, w tym w adeninie 281 (Rycina 2A). Za tym nukleotydem następuje uracyl, co tworzy konsensusowy dinukleotyd (RY) podatny na cięcie przez DNAzym 10-23. Box C/D snR47 również kieruje metylacją dwóch nukleotydów w 25S rRNA (Rycina 2B). Za adeniną w pozycji 20 następuje reszta guaniny i ten dinukleotyd może być cięty przez DNAzym 8-17. Aby indukować lub hamować syntezę snoRNA snR13 lub snR47, wprowadzono indukowalny promotor GAL1 powyżej genów SNR13 lub SNR47 i hodowano komórki w medium zawierającym galaktozę (transkrypcja zależna od GAL1 włączona) lub glukozę (transkrypcja zależna od GAL1 wyłączona). Następnie RNA wyizolowane z komórek GAL1::SNR13 inkubowano z DNAzymem 10-23 zaprojektowanym do cięcia 25S rRNA w miejscu zależnym od snR13, pomiędzy nukleotydami 2281 i 282 (Rycina 2C). RNA ze szczepu GAL1::SNR47 poddano działaniu DNAzymu 8-17 celującego w miejsce zależne od snR47 pomiędzy nukleotydami 220 i 21 (Rycina 2D). Jako kontrolę RNA ze szczepu typu dzikiego BY4741 rosnącego na galaktozie lub glukozie inkubowano z obydwoma DNAzymami. Elektroforeza RNA traktowanego DNAzymami wykazała, że 25S rRNA wyizolowane ze szczepów GAL1::SNR13 i GAL1::SNR47 rosnących na galaktozie (GAL) pozostało nienaruszone (Rycina 3A,B; ścieżki 3). W przeciwieństwie do tego, RNA wyizolowane z komórek GAL1::SNR13 i GAL1::SNR47 rosnących na glukozie (GLC) zostało strawione przez odpowiednie DNAzymy (Rycina 3A,B; ścieżki 4). W obu przypadkach prążek 25S rRNA uległ zmniejszeniu i zaobserwowano produkty cięcia z końców 5’ i 3’ (A i B). Wskazuje to, że w szczepach GAL1::SNR13 i GAL1::SNR47 25S rRNA uległo 2’-O-metylacji w miejscach kierowanych przez snR13 lub snR47, gdy galaktoza służyła jako źródło węgla i te snoRNA były ekspresjonowane. Brak metylacji 25S rRNA po wyłączeniu ekspresji snR13 lub snR47 na glukozie umożliwił cięcie zależne od DNAzymu. Nie zaobserwowano trawienia RNA w próbkach typu dzikiego (Rycina 3A,B; ścieżki 1 i 2), ponieważ ekspresja snR13 i snR47 w tym szczepie jest niezależna od galaktozy/glukozy. W związku z tym rRNA było prawidłowo zmetylowane, a zatem oporne na aktywność DNAzymów.
Ogólnie nasz eksperyment wykazuje, że aktywność cięcia DNAzymów 10-23 (Rysunek 3A) oraz 8-17 (Rysunek 3B) korelowała z brakiem snoRNA snR13 lub snR47 typu box C/D, co wyraźnie wskazuje, że te snoRNA są odpowiedzialne za 2’-O-metylację 25S rRNA w konkretnych miejscach.
<img alt="Schemat procesu cięcia przez DNAzym; sekwencje, ścieżki cięcia, etapy schematu doświadczalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: DNAzymy i ich substraty RNA. (ADNAzymy 10-23 rozcinają dinukleotyd RNA puryna-pirymidyna (RY). R w RNA nie tworzy pary z DNAzymem, natomiast Y jest komplementarny do zasady R w DNAzymie. Metylacja puryny (R) w RNA hamuje rozcinanie zależne od DNAzymu.B) DNAzymy 8-17 przecinają RNA powyżej guaniny, która jest niedoskonałe sparowana z pierwszą tyminą w katalitycznej sekwencji DNAzymu. Nukleotyd poprzedzający guaninę nie jest sparowany, a jego metylacja chroni przed cięciem zależnym od DNAzymu. RNA przedstawiono w kolorze szarym (z wyjątkiem miejsca metylacji), a DNAzym w kolorze fioletowym. N = dowolny nukleotyd, R = puryna: adenina lub guanina, Y = pirymidyna: cytozyna lub uracyl; CH3- oznacza metylację RNA. Pary zasad w obrębie aktywnych sekwencji DNAzymu zaznaczono liniami przerywanymi. Niebieska błyskawica oznacza miejsce cięcia. (C) Schemat blokowy przedstawiający etapy analizy zależnej od DNAzymu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="DNazym celujący w metylację zależną od snR13/snR47, analiza sekwencji genów, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: DNAzymy celujące w miejsca metylacji zależne od snR13 i snR47 w 25S rRNA. (A, BZrzuty ekranu z przeglądarki przedstawiające zależne od snR13 (A) i zależne od snR47 (B) miejsca metylacji w 25S rRNA (C) sekwencja 25S rRNA w otoczeniu miejsca metylacji zależnej od snR13 (A2281) oraz DNAzymu 10-23 (zaznaczony na fioletowo), zaprojektowanego do rozcinania RNA pomiędzy A2281 oraz U2282. A2281 nie jest sparowany z DNAzymem, podczas gdy U2282 tworzy parę z pierwszym nukleotydem aktywnej sekwencji DNAzymu (oznaczonej niebieską linią). Niebieski symbol błyskawicy oznacza miejsce cięcia. (D) sekwencja 25S rRNA w obrębie miejsca metylacji zależnej od snR47 (A2220) oraz DNAzym 8-17 (zaznaczony na fioletowo), zaprojektowany do rozcinania RNA pomiędzy A2220 oraz G2221. A2220 nie hybrydyzuje z DNAzymem, podczas gdy G2221 jest niedoskonale sparowany z tyminą (oznaczone przerywaną linią). Niebieski symbol błyskawicy wskazuje miejsce cięcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej po traktowaniu DNAzymą; prążki 25S i 18S rRNA; analiza snR13, snR47." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza specyficznych dla miejsca 2’-O-metylacji 25S rRNA z wykorzystaniem testu zależnego od DNAzymów 10-23 i 8-17. (A) Analiza metylacji 25S rRNA zależna od snR13 z wykorzystaniem DNAzymu 10-23. (BAnaliza metylacji 25S rRNA zależna od snR47 z wykorzystaniem DNAzymu 8-17. RNA wizualizowano za pomocą barwienia w denaturującym żelu agarozowym. Produkty cięcia A i B zaznaczono czerwonymi strzałkami. WT = szczep dziki; GAL = galaktoza, GLC = glukoza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Trawienie zależne od DNAzymu jest przydatną metodą do badania funkcji snoRNA. Jest to szybka i prosta metoda analizy metylacji RNA specyficznej dla danego miejsca. Wymaga krótkiego oligonukleotydu DNA i podstawowych odczynników obecnych w każdym laboratorium biologii molekularnej.Zacznij od zaprojektowania DNAzyme dla interesującej Cię sekwencji. Znajdź sekwencję RNA lub przypuszczalne miejsce metylacji, korzystając z odpowiedniej bazy danych. W przypadku celów snoRNA S.cerevisiae należy użyć bazy danych snoRNA drożdży.Aby znaleźć interesujące miejsce metylacji, na przykład miejsce zależne od snR13, wybierz snR13 i zanotuj położenie zmodyfikowanego nukleotydu. Znajdź sekwencję przed i za zmodyfikowanym nukleotydem, korzystając z odpowiedniej bazy danych, takiej jak Saccharomyces Genome Database. Wyszukaj nazwę genu docelowego.Jeśli używasz testu od 10 do 23 DNAzyme, wybierz od 10 do 15 nukleotydów przed i za miejscem metylacji. Jeśli używasz zymu 8-17 DNA, wybierz 20 nukleotydów. Utwórz komplementarne sekwencje ramion pięciu i trzech liczb pierwszych i użyj ich do flankowania sekwencji katalitycznej DNAzyme na końcach trzech i pięciu pierwszych.Zamów DNAzyme jako normalny oligonukleotyd DNA. Uprawiaj interesujące Cię odmiany drożdży w odpowiednim podłożu i warunkach. Gdy komórki osiągną środkową fazę wykładniczą, osadzaj je przez wirowanie w temperaturze 1000 razy g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzuć pożywkę.Kontynuuj izolację RNA zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie ponownie zawieś osad RNA w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNazy i DNaz. Umieść probówkę na lodzie i zmierz stężenie RNA na mikrospektrofotometrze.Aby przeprowadzić trawienie DNAzyme przy użyciu 10 do 23 DNAzyme, przygotuj mieszankę inkubacyjną z pięcioma mikrogramami RNA, 200 pikosolami od 10 do 23 DNAzymu i jednym buforem inkubacyjnym X 10 do 23 w całkowitej objętości 10 mikrolitrów. Następnie inkubuj probówki na suchym bloku grzewczym ustawionym na 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Natychmiast po tym umieść probówki na lodzie i pozostaw je tam na pięć minut.Na krótko odkręć rurki i połóż je z powrotem na lodzie. Dodaj 20 jednostek inhibitora RNazy i umieść probówki na suchym bloku grzewczym ustawionym na 25 stopni Celsjusza na 10 minut. W międzyczasie przygotuj mieszaninę reakcyjną, łącząc pięć mikrolitrów buforu reakcyjnego o pojemności od czterech X 10 do 23 z czterema mikrolitrami 300-molowego chlorku magnezu i jednym mikrolitrem wody.Podgrzej tę mieszaninę reakcyjną na suchym bloku grzewczym ustawionym na 37 stopni Celsjusza. Umieść probówkę z mieszanką inkubacyjną na suchym bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodaj 10 mikrolitrów podgrzanej mieszanki reakcyjnej. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie umieść probówkę na lodzie.Aby przeprowadzić trawienie DNAzyme za pomocą 8-17 DNAzyme, przygotuj 1,5-mililitrową mikroprobówkę z pięcioma mikrogramami RNA w łącznej objętości sześciu mikrolitrów. Następnie przygotuj osobną probówkę z 400 pikomolami 8-17 DNAzymu. Podczas pracy trzymaj obie rurki na lodzie.Przenieś obie probówki do suchego bloku grzewczego ustawionego na 95 stopni Celsjusza i inkubuj je przez dwie minuty. Przenieś próbkę RNA z powrotem na lód i wiruj rurkę z DNAzyme przez pięć sekund. Inkubuj DNAzyme w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 minut.Podczas inkubacji DNAzymu przygotuj 10 mikrolitrów buforu reakcyjnego 2-X 8-17 i podgrzej go do 25 stopni Celsjusza. Dodaj wstępnie podgrzany bufor do probówki z DNAzymem, a następnie przenieś 14 mikrolitrów tej mieszaniny reakcyjnej do probówki z RNA wraz z 20 jednostkami inhibitora RNazy. Inkubuj reakcję w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie umieść probówkę na lodzie.Aby oczyścić RNA po trawieniu DNAzym, do probówki reakcyjnej dodać 350 mikrolitrów wody i 400 mikrolitrów chloroformu. Wirować przez 30 sekund i wirować przy 20 000 g przez pięć minut. Po odwirowaniu przenieś górną fazę do nowej probówki zawierającej jeden mililitr etanolu, 40 mikrolitrów 7,5-molowego octanu amonu i jeden mikrolitr glikogenu.Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać i inkubować w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Kontynuuj oczyszczanie RNA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie ponownie zawiesić osad RNA w 10 mikrolitrach wody wolnej od RNazy i DNazy. Umieść probówkę RNA na lodzie natychmiast po oczyszczeniu.Aby wykonać elektroforezę RNA, zacznij od rozpuszczenia 1,5 grama agarozy w 127,5 mililitrach podwójnie destylowanej wody, podgrzewając mieszaninę w kuchence mikrofalowej. Następnie dodaj 15 mililitrów 10X MOPS i 7,5 mililitrów 37% formaldehydu do roztworu agarozy. Do roztworu agarozy dodać odpowiednią ilość barwnika żelowego.Wlej agarozę do tacki i pozwól jej ostygnąć przez 45 minut. Przygotuj próbki RNA, łącząc 10 mikrolitrów strawionego i oczyszczonego RNA z pięcioma mikrolitrami buforu denaturującego próbkę i 0,5 mikrolitra barwnika ładującego sześciokrotnie. Próbki należy inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie przez pięć minut na lodzie.Przygotowany żel należy umieścić w zbiorniku do elektroforezy i napełnić zbiornik buforem one-X MOPS. Załaduj całe 15 mikrolitrów próbki na żel i uruchom żel pod napięciem 80 woltów, aż błękit bromotymolowy osiągnie 2/3 długości żelu. Przeanalizuj żel za pomocą odpowiedniego imagera.Wartość tej techniki można wykazać na indukowalnym systemie transkrypcji snoRNA. Wprowadzenie indukowalnego promotora GAL1 przed genami snR13 lub snR47 pozwala na analizę zależnej od snoRNA metylacji rybosomalnego RNA 25S. Kiedy komórki są hodowane na galaktozie, rybosomalny RNA 25S jest metylowany w miejscach kierowanych przez snoRNA i pozostaje nienaruszony po leczeniu DNAzyme.W przeciwieństwie do tego, gdy ekspresja snoRNA jest wyłączona z powodu braku galaktozy, następuje rozszczepienie zależne od DNAzymu. Co więcej, nie obserwuje się trawienia RNA w kontrolach typu dzikiego, ponieważ ekspresja snoRNA jest niezależna od galaktozy. Aktywność rozszczepienia zależnego od DNAzymu w analizie naszych modyfikacji rRNA została ostatnio wykazana w kontekście dojrzewania snoRNA.Test zależny od DNAzymu został wykorzystany do wykazania, że brak przetwarzania pięciokrotnego i pre-snoRNA wpływa na poziomy metylacji 25S i 18S rRNA w Saccharomyces cerevisiae. Protokół ten wymaga stosowania fenolu i chloroformu, które są toksyczne i powinny być obsługiwane pod wyciągiem.

dnazyme-dependent-analysis-of-rrna-2-o-methylation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m6A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Rola modyfikacji RNA w infekcjach wirusowych dopiero zaczyna być badana i może uwypuklić nowe mechanizmy interakcji wirus-gospodarz. W tej pracy przedstawiamy proces badania modyfikacji RNA m6A i m5C w kontekście infekcji wirusowych.

Badanie epitranskryptomów m6A i m5C po infekcji wirusowej: przykład z HIV

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Ten protokół zapewnia łatwy do naśladowania przepływ pracy do przeprowadzenia oczyszczania poli(A) RNA, konwersji wodorosiarczynu i przygotowania biblioteki przy użyciu standardowego sprzętu dla interesującej próbki biologicznej.

Wzbogacenie biblioteki mRNA i mRNA wodorosiarczynowego do sekwencjonowania nowej generacji

Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.

Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA

Poznaj metodę analizy 2'-O-metylacji RNA zależną od DNAzymów w Saccharomyces cerevisiae. Szybkie i ekonomiczne podejście do badania modyfikacji rRNA kierowanych przez snoRNA w standardowym laboratorium biologii molekularnej.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Przeglądaj więcej filmów