Name: Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Poznaj jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej. Ta metoda umożliwia kontrolowane badanie aktywacji płytek krwi w warunkach roztworu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca związana z tym badaniem była częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) National Heart, Lung, and Blood Institute HL082808, HL123984 (R.L.) i F31HL134241 (M.E.Q.). Finansowanie zapewnia również grant NIH National Institute of General Medical Sciences T32GM008367 (M.E.Q.); oraz pilotażowe fundusze grantowe z Children's Healthcare of Atlanta i Emory University Pediatric Flow Cytometry Core. Autorzy chcieliby podziękować dr Hansowi Deckmynowi za udostępnienie przeciwciała 6B4 oraz Emory Children's Pediatric Research Center Flow Cytometry Core za wsparcie techniczne.

Wszystkie opisane tutaj metody z wykorzystaniem ludzkich płytek krwi pochodzących od dawców zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board) Uniwersytetu Emory/Children's Healthcare of Atlanta.
1. Pobieranie krwi i izolacja płytek krwi
<ol>
	<li>Pobierz krew od zdrowych, dorosłych dawców, którzy wyrazili zgodę na udział w badaniu, metodą nakłucia żyły w dniu eksperymentu do 3,8% cytrynianu trisodu. Jedna probówka zawierająca 4,5 ml krwi jest wystarczająca, aby uzyskać ilość osocza bogatopłytkowego (PRP) potrzebną do 20–25 wariantów doświadczalnych u dawców, których liczba płytek krwi oscyluje wokół 250 x 10^9/L.3 na μL. 
	UWAGA: Należy unikać pobierania krwi za pomocą igieł o małej średnicy (mniejszych niż 21 G).</li>
	<li>Przygotować PRP poprzez wirowanie przy 22 °C oraz 140x g przez 12 min z długim hamowaniem. W rezultacie powstaną dwie wyraźne warstwy: erytrocyty na dnie oraz jasna warstwa PRP na górze.</li>
	<li>Odizolować górną, mątną, żółtą warstwę PRP, ostrożnie pipetując ją za pomocą końcówki do pipety odciętej na poziomie 45° pod kątem i oznaczyć liczbę płytek krwi za pomocą morfologii krwi (CBC).</li>
	<li>W razie potrzeby przemyć płytki krwi w soli fizjologicznej buforowanej PIPES (150 mM NaCl, 20 mM PIPES) w obecności prostaglandyny E1 (PGE1) i resuspender w buforze Tyrodea (134 mM NaCl, 0,34 mM Na2HPO4, 2,9 mM KCl, 1 mM MgCl22, 5 mM glukozy, 12 mM NaHCO33, 20 mM HEPES, pH 7,35) z dodatkiem 5 mM glukozy; w przeciwnym razie należy przejść do kroku 1.5. Kolejne etapy opisują w skrócie proces płukania.
	<ol>
		<li>Dopełnić objętość PRP do 10 ml solą fizjologiczną buforowaną PIPES i dodać 0.6 μM PGE1.</li>
		<li>Wiruj przez 8 min przy 1900 x g gnastępnie należy odlać nadsącz i pozostawić osad płytkowowy w 400 μL roztworem Tyrode'a i glukozą przez 5 min.</li>
		<li>Ostrożnie resuspendować osad płytek i pozostawić go w spokoju na 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosować liczbę płytek krwi do poziomu ~250 x 103 płytek krwi na μL z pulą ludzkiej osocza ubogopłytkowej (PPP) i utrzymuj zawiesinę w 22 °C bez niepokojenia lub przy łagodnym mieszaniu obrotowym.</li>
</ol>
2. Traktowanie ligandem i jednorodnym ścinaniem
UWAGA: Wszystkie etapy w sekcji 2 wymagające pipetowania należy wykonywać powoli, aby uniknąć wystąpienia sił ścinających.
<ol>
	<li>Do PRP lub przemytych płytek dodać odpowiednie przeciwciało lub ligand i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół lub mieszając końcówką pipety. Pozostawić niezakłócone w temperaturze pokojowej na 5-10 min. Do kontroli negatywnej dodać równą objętość PPP lub buforu Tyrode'a.</li>
	<li>Włączyć wiskozymetr stożkowo-płaskiego, ustawić temperaturę płyty na 22 °C i odczekać, aż płyta osiągnie tę temperaturę.</li>
	<li>Nanieść pipetą traktowane PRP lub przemyte płytki na kontrolowany temperaturowo wiskozymetr stożkowo-płaski bezpośrednio na środek płyty. Upewnić się, że cała próbka została naniesiona pomiędzy stożek a płytę w punkcie styku, a nie na zewnętrzną krawędź stożka.</li>
	<li>Poddać ścinaniu z odpowiednią szybkością i przez określony czas.
	<ol>
		<li>Obliczyć ścinanie zgodnie z instrukcją wiskozymetru lub zgodnie z wcześniej opisanymi metodami15,16.</li>
		<li>Wyznaczyć szybkość ścinania na podstawie lepkości i pożądanego naprężenia ścinającego zgodnie z prawem lepkości Newtona; <img alt="Wzór na naprężenie ścinające, τ=μ(du/dy), w równaniu dynamiki płynów." src="/files/ftp_upload/59704/59704eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">; lepkość osocza wynosi 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Na przykład normalny zakres ścinania w krążeniu człowieka wynosi 5-30 dyn/cm2, a ścinanie powinno być stosowane w skali czasu minutowej (jednocyfrowej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lekko unieść stożek nad płytę (~2 mm), tak aby próbka pozostała w kontakcie zarówno z płytą, jak i stożkiem, a następnie użyć końcówki do nakładania żelu lub innej długiej końcówki pipety, aby pobrać 5-10 μL ze środka objętości próbki.</li>
	<li>Inkubować poddane ścinaniu próbki z odpowiednimi markerami przez 20 min w temperaturze pokojowej. W przypadku markerów ekspozycji fosfatydyloseryny, β-galaktozy i P-selektyny zastosować odpowiednio domenę C2 laktaderyny (LactC2) w stężeniu 0,08 μM18, lektynę Erythrina cristagalli (ECL) w stężeniu 6,25 μg/mL oraz przeciwciało przeciwko P-selektynie (20 µg/mL).</li>
	<li>Utrwalić próbki w 2% paraformaldehydzie przez 20 min w RT przed rozcieńczeniem lub przechowywaniem w chłodni, a następnie przejść do kroku 3.1 lub przechowywać próbki w 4 °C nie dłużej niż przez 12 h.</li>
</ol>
3. Wykrywanie markerów powierzchniowych i sieciowania za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przeanalizować próbkę za pomocą cytometrii przepływowej, zbierając co najmniej 20 000 zdarzeń dla każdego warunku.</li>
	<li>Ilościowo określić siłę sygnału markerów fluorescencyjnych, wykorzystując wartość wysokości (height) dla intensywności każdego fluoroforu lub geometryczną średnią intensywności fluorescencji (MFI).</li>
	<li>W przypadku chęci wykrycia sieciowania płytek krwi po poddaniu ich działaniu sił ścinania, przeanalizować próbkę na cytometrze przepływowym z możliwością obrazowania i określić ilościowo sieciowanie za pomocą parametrów pola powierzchni (area) oraz współczynnika kształtu (aspect ratio).
	<ol>
		<li>Wykreślić histogram pola powierzchni i/lub współczynnika kształtu.</li>
		<li>Użyć kontroli negatywnej z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) lub nośnikiem, aby wyznaczyć bramkę wykluczającą większość zdarzeń w pełni kolistych (bramkę tę wyznacza się zazwyczaj przy współczynniku kształtu ~0,819,20) i określić procent zdarzeń wewnątrz tej bramki. Zdarzenia o niższym współczynniku kształtu z większym prawdopodobieństwem są sieciowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-voltage-gated+Ca2%2B+influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li>
<li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li>
<li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+Cell+Transduction%2C+Tuning%2C+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li>
<li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li>
<li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li>
<li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301(2018).</li>
<li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870(2016).</li>
<li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584(2016).</li>
<li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li>
<li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li>
<li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li>
<li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863(2016).</li>
<li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li>
<li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterhof%2C+N+%22Snapshots+of+hemodynamics%3A+an+aid+for+clinical+research+and+graduate+education%22">Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education</a>. , Springer Science, Business Media. (2010).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li>
<li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li>
<li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li>
<li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół opisany w tym manuskrypcie pozwala na szybką i wszechstronną ocenę wpływu ścinania laminarnego na receptory płytkowe i powierzchniowe komórek. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki podkreślają, w jaki sposób przepływ ścinający może wpływać na działanie ligandów multimerycznych lub dwuwartościowych. Oprócz tego zastosowania, jednolity test ścinania ma szerokie zastosowanie w obserwacji efektów zależnych od ścinania. W przypadku braku znanej pary ligand-receptor, jednolity test ścinania może również wykryć wp...

Mechanoreceptory to białka, które reagują na bodźce mechaniczne, takie jak ciśnienie czy mechaniczne zakłócenia/deformacje. W przypadku niektórych mechanoreceptorów wyczuwanie tych mechanicznych zakłóceń jest jednoznaczne z funkcją typów komórek, w których są one wyrażane. Weźmy na przykład receptory rozciągania w neuronach baroreceptorowych; Te mechanowrażliwe kanały jonowe regulują ciśnienie krwi, wykrywając "rozciąganie" naczyń krwionośnych1,2. W uchu wewnętrznym kanały jonowe na komórkach rzęsatych wykrywają deformacje mechaniczne spowodowane przez fale dźwiękowe3, a mechanoreceptory niskoprogowe skóry (LTMRs) ułatwiają przekazywanie informacji dotykowych4. W innych przypadkach mechanoreceptory dostarczają komórce ważnych informacji w celu ustanowienia adhezji lub wzrostu. Komórki mogą wyczuwać sztywność swojego lokalnego środowiska i mogą polegać na siłach kurczliwych za pośrednictwem cytoszkieletu aktynowego i integryn, aby dyktować wzrost lub rozprzestrzenianie się5,6.
Podczas badania interakcji receptor-ligand w modelach komórkowych lub tkankowych, istnieją powszechne testy, które mogą szybko i dokładnie raportować efekty zmiany temperatury, pH, stężenia ligandów, toniczności, potencjału błonowego i wielu innych parametrów, które mogą się różnić in vivo. Jednak te same testy mogą być niewystarczające, jeśli chodzi o wykrycie udziału siły mechanicznej w aktywacji receptora. Niezależnie od tego, czy komórki wyczuwają swoje mikrośrodowisko, wykrywają fale dźwiękowe, czy reagują na rozciąganie, jedną wspólną cechą wyżej wymienionych mechanoreceptorów jest to, że uczestniczą w interakcjach, w których ligand, receptor lub oba te elementy są zakotwiczone na powierzchni. Testy opracowane w celu zbadania wpływu sił mechanicznych na oddziaływania receptorów często odzwierciedlają ten paradygmat. Mikrofluidyka i komory przepływowe są wykorzystywane do badania wpływu przepływu ścinającego na komórki i receptory7,8. Tego typu eksperymenty mają tę zaletę, że umożliwiają precyzyjne dostrojenie szybkości ścinania za pomocą ustalonych prędkości przepływu. Inne techniki wykorzystują fluorescencyjne sondy molekularne do wykrywania sił wywieranych przez komórki na powierzchniach bogatych w ligandy, uzyskując dokładny odczyt wielkości i orientacji sił zaangażowanych w interakcję9,10.
Oprócz mechanosensacji występującej, gdy jeden lub obaj partnerzy są zakotwiczeni na powierzchni, naprężenia ścinające mogą wpływać na białka i komórki w roztworze. Jest to często obserwowane w komórkach/białkach krwi, które są stale w krążeniu i może objawiać się poprzez aktywację mechanoreceptorów, które są normalnie zakotwiczone powierzchniowo11, lub poprzez ekspozycję sekwencji docelowych, które zostałyby zasłonięte w warunkach statycznych12. Jednak stosunkowo mniej technik bada wpływ siły ścinającej na cząstki w roztworze. Niektóre podejścia w roztworze wprowadzają ścinanie poprzez wirowanie komórek w zawiesinie płynu o różnych prędkościach i czasie trwania, chociaż podejścia te mogą nie pozwalać na bardzo precyzyjne określenie generowanego naprężenia ścinającego. Lepkościomierze rotacyjne mierzą lepkość, przykładając określoną siłę ścinającą do płynów. W niniejszym artykule opisano zastosowaną metodę określania wpływu określonych szybkości ścinania laminarnego na komórki lub fragmenty komórek w roztworze.
Jednym z najbardziej ekspresyjnych białek na powierzchni płytek krwi jest kompleks Ib-IX glikoproteiny (GP). GPIb-IX jest głównym receptorem dla białka osocza czynnika von Willebranda (VWF). Razem, ta para receptor-ligand od dawna jest uznawana za podstawę odpowiedzi płytek krwi na naprężenie ścinające13. W przypadku uszkodzenia naczyń krwionośnych VWF wiąże się z odsłoniętym kolagenem w macierzy podśródbłonkowej14, rekrutując w ten sposób płytki krwi do miejsca uszkodzenia poprzez interakcję VWF-GPIb-IX. Zaangażowanie VWF w miejsce wiązania w podjednostce GPIbα, jeśli GPIb-IX pod wpływem fizjologicznego naprężenia ścinającego indukuje rozwijanie się błonowo-proksymalnej domeny mechanosensorycznej (MSD), która z kolei aktywuje GPIb-IX15. W niedawnym badaniu wykazaliśmy, że przeciwciała przeciwko GPIbα, podobnie jak te wytwarzane u wielu pacjentów z małopłytkowością immunologiczną (ITP), są również zdolne do indukowania sygnalizacji płytek krwi poprzez MSD rozwijające się pod wpływem stresu ścinającego11. Jednak w przeciwieństwie do VWF, który ułatwia indukowaną ścinaniem aktywację GPIb-IX poprzez unieruchomienie kompleksu w normalnym krążeniu, przeciwciała dwuwartościowe są w stanie sieciować płytki krwi za pośrednictwem GPIb-IX i rozwijać MSD w krążeniu. W ten sposób mechanoreceptor, który jest normalnie aktywowany przez unieruchomienie powierzchni pod ścinaniem, może być aktywowany w roztworze. W niniejszym raporcie pokażemy, w jaki sposób test jednorodnego ścinania oparty na lepkościomierzu został wykorzystany do wykrycia wpływu określonych poziomów naprężeń ścinających na aktywację receptora w roztworze.

<table><tbody><tr><td>APC anty-ludzki CD62P (P-Selectin)</td><td>BioLegend</td><td>304910</td><td></td></tr><tr><td>Brookfield Cap 2000+ Wiskozymetr</td><td>Brookfield-FITC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Erythrina cristagalli lektyna (ECL)</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1141</td><td></td></tr><tr><td>Pooled Normal Human Plasma</td><td>Precision Biologic</td><td>CCN-10</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer Jasnoniebieska probówka do pobierania krwi (cytrynian sodu)</td><td>BD</td><td>369714</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer Zestaw do pobierania krwi, 21G x &frac34; " Igła</td><td>BD</td><td>367287</td><td></td></tr></tbody></table>

jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Wiele biologicznych komórek/tkanek wyczuwa właściwości mechaniczne swojego lokalnego środowiska za pomocą mechanoreceptorów, białek, które mogą reagować na siły takie jak ciśnienie czy zakłócenia mechaniczne. Mechanoreceptory wykrywają swoje bodźce i przekazują sygnały za pomocą wielu różnych mechanizmów. Niektóre z najczęstszych ról mechanoreceptorów to reakcje neuronalne, takie jak dotyk i ból, lub komórki rzęsate, które działają w równowadze i słuchu. Mechanosensacja jest również ważna dla typów komórek, które są regularnie narażone na stres ścinający, takich jak komórki śródbłonka, które wyściełają naczynia krwionośne lub komórki krwi, które doświadczają ścinania w normalnym krążeniu. Lepkościomierze to urządzenia, które wykrywają lepkość płynów. Lepkościomierze rotacyjne mogą być również używane do przykładania znanej siły ścinającej do płynów. Zdolność tych instrumentów do wprowadzania równomiernego ścinania do płynów została wykorzystana do badania wielu płynów biologicznych, w tym krwi i osocza. Wiskozymetria może być również stosowana do nakładania ścinania na komórki w roztworze oraz do testowania wpływu ścinania na określone pary ligand-receptor. W tym przypadku wykorzystujemy wiskozymetrię stożkowo-płytkową do zbadania wpływu endogennych poziomów naprężeń ścinających na płytki krwi traktowane przeciwciałami przeciwko kompleksowi receptorów mechanosensorycznych GPIb-IX.

Rysunek 1 przedstawia, w jaki sposób model spustowy aktywacji GPIb-IX, wprowadzony pierwotnie w celu wyjaśnienia zależnej od ścinania aktywacji receptora zakotwiczonego w ścianie naczynia, może również wspierać aktywację płytek krwi sieciowanych przez ligand wielowartościowy. Rysunek 2 pokazuje odczyty aktywacji ludzkich płytek krwi traktowanych dwoma przeciwciałami celującymi w domenę N-końcową GPIb-IX (6B4 i 11A8) oraz jednym przeciwciałem kontrolnym (normalne...

Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Protokół ten pozwala nam odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących sposobu, w jaki ścinanie działa na komórki w roztworze i zapewnia znaczną kontrolę nad czasem trwania i wielkością ścinania. W przeciwieństwie do innych technik, które wykrywają wpływ ścinania na komórki, które są unieruchomione, ta technika pozwala nam zastosować ścinanie do komórek w roztworze i nadaje się do stosowania w całym spektrum metod wykrywania sygnałów. Po pobraniu krwi obwodowej od zdrowego, dorosłego dawcy, który wyraził na to zgodę, w 4,5-mililitrowej probówce z 3,8% cytrynianem trisodowym, odwiruj krew w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego i użyj końcówki pipety przeciętej pod kątem 45 stopni, aby ostrożnie usunąć powstałą górną, mętną, żółtą warstwę osocza bogatopłytkowego.Uzyskaj liczbę płytek krwi za pomocą pełnej morfologii krwi i dostosuj liczbę płytek krwi do około 2,5 razy 10 do piątej płytki krwi na mikrolitr z połączonym ludzkim osochem ubogim w płytki krwi. Następnie umieść zawiesinę w temperaturze 22 stopni Celsjusza, delikatnie obracając. W przypadku leczenia ligandem należy powoli dodawać przeciwciało lub ligand będący przedmiotem zainteresowania do osocza bogatopłytkowego i delikatnie mieszać płytki krwi.Podczas inkubacji włącz lepkościomierz stożkowo-płytkowy i ustaw temperaturę płytki na 22 stopnie Celsjusza. Po pięciu do 10 minutach przenieś osocze bogatopłytkowe poddane działaniu produktów ziarnistych na leskozymetr stożkowy z kontrolowaną temperaturą bezpośrednio na środku płytki, uważając, aby cała próbka została osadzona między stożkiem a płytką w miejscu kontaktu. Aby zastosować ścinanie do próbki, oblicz ścinanie zgodnie z instrukcją lepkościomierza i zastosuj ścinanie do próbki z odpowiednią szybkością i czasem trwania.Pod koniec aplikacji podnieś stożek około dwóch milimetrów od płytki, tak aby próbka pozostała w kontakcie zarówno z płytką, jak i stożkiem, a następnie użyj końcówki do pipety z żelem, aby zebrać od pięciu do 10 mikrolitrów ze środka objętości próbki. Następnie inkubować ściętą próbkę z przeciwciałami przeciwko interesującym markerom powierzchniowym przez 20 minut w temperaturze pokojowej i utrwalać próbki w 2% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Aby przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej, należy zebrać co najmniej 20 000 zdarzeń dla każdego warunku i określić ilościowo siłę sygnału każdego markera fluorescencyjnego, używając wartości wysokości dla intensywności każdego fluoroforu.Następnie użyć kontroli ujemnej z albuminą surowicy bydlęcej lub nośnikiem, aby narysować bramkę, wykluczając ujemne zdarzenia fluorescencyjne tła, i określić ilościowo procent zdarzeń wewnątrz bramki dla wszystkich warunków eksperymentalnych. Ekspresja markera aktywacji płytek krwi w odpowiedzi na przyłożenie siły ścinającej jest nieregulowana w sposób zależny od czasu. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne odczyty aktywacji ludzkich płytek krwi w obecności dwóch przeciwciał skierowanych przeciwko N-końcowej domenie glikoproteiny 1b-IX i jednego przeciwciała kontrolnego w warunkach ścinania i statyczności.Ekspresja wszystkich trzech markerów aktywacji była znacznie zwiększona w obecności sił ścinających i przeciwciał celujących, w porównaniu z warunkami statycznymi lub w obecności przeciwciał kontrolnych. Warto zauważyć, że leczenie przeciwciałem o sile niewiążącej zbyt małej, aby wywołać aktywację glikoproteiny 1b-IX, nie powoduje regulacji w górę markera aktywacji płytek krwi w warunkach siły statycznej lub ścinającej. Ponadto osocze od pacjentów z małopłytkowością immunologiczną zawierające przeciwciała przeciwko glikoproteinie 1b-IX wyzwala odpowiedzi zależne od ścinania, w przeciwieństwie do osocza od pacjentów bez przeciwciał ukierunkowanych na glikoproteinę 1b-IX.Oprócz analiz cytometrycznych przepływowych, komórki, które zostały wystawione na ścinanie, mogą być również poddawane lizie pod kątem western blot, ELISA i analizy masowej w celu określenia wszelkich zmian poziomu białka. Jak zawsze, podczas korzystania z próbek krwi lub ludzi, należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny i postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa w laboratorium i patogenów przenoszonych przez krew w Twojej instytucji.

a-uniform-shear-assay-for-human-platelet-cell-surface-receptors-via

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Ten film pokazuje metodę oceny wpływu naprężeń ścinających na płytki krwi. Leczenie przeciwciałami indukuje dysocjację i zmiany konformacyjne w kompleksach mechanoreceptorowych, aktywując płytki krwi i wyrażając markery na powierzchni. Markery te obserwuje się za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Wpływ naprężenia ścinającego na płytki krwi leczone przeciwciałami przeciwko receptorom mechanosensorycznym

Opisujemy prostą metodę izolacji umytych płytek krwi od ludzkiej krwi, a następnie pomiary agregacji płytek krwi wywołanej przez agonistę za pomocą mętności. Jako przykład stosujemy tę metodę do badania odpowiedzi agregacyjnej ludzkich płytek krwi na kolagen po wstępnej inkubacji z inhibitorem kanału Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Zmętnienie na ludzkich płukanych płytkach krwi: wpływ inhibitora pannexin1 Brilliant Blue FCF na agregację indukowaną kolagenem

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Ten protokół przedstawia ilościowe określanie właściwości mechanicznych nowotworowych i nienowotworowych linii komórkowych in vitro. Konserwatywne różnice w mechanice komórek nowotworowych i prawidłowych mogą działać jako biomarker, który może mieć wpływ na rokowanie i diagnozę.

Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Metabolizm płytek krwi jest interesujący, szczególnie w odniesieniu do roli nadmiernej i hipoaktywności płytek krwi w krwawieniach i zaburzeniach zakrzepowych. Izolowanie płytek krwi z osocza jest konieczne w przypadku niektórych testów metabolicznych; Przedstawiono metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi.

Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Obecny protokół dostarcza obszerny zestaw procedur niezbędnych do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, które wykazują nakładające się cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi.

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Poznaj jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej. Ta metoda umożliwia kontrolowane badanie aktywacji płytek krwi w warunkach roztworu.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Przeglądaj więcej filmów