Name: Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji uszkodzeń DNA wywołanych stresem oksydacyjnym w tkankach myszy narażonych na działanie pyłu PM 2.5. Technika HPLC-MS/MS zapewnia wysoką czułość i selektywność analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Proc. 2012/22190-3 i 2012/08616-8), CNPq (Proc. 454214/2014-6 i 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) i CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira i A. A. F. Oliveira otrzymali stypendia FAPESP (Proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) i CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. Di Mascio, P. H. N. Saldiva i A. P. M. Loureiro otrzymali stypendia CNPq.
Niektóre rysunki i tabele zawarte w tej pracy zostały pierwotnie opublikowane w Oliveira A.A.F. et al. Genotoksyczne i epigenotoksyczne efekty u myszy narażonych na stężony pył zawieszony (PM2.5) z miasta São Paulo, Brazylia. Toksykologia cząstek i włókien. 15, 40 (2018).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym problemem stwierdzonym w analizach 8-oksodGuo metodami HPLC jest możliwa indukcja jego powstawania podczas procedur ekstrakcji DNA, hydrolizy DNA i koncentracji hydrolizatów DNA22,38. W celu zminimalizowania problemu tworzenia się artefaktów 8-oksodGuo, zaleca się dodawanie deferoksaminy do wszystkich roztworów do ekstrakcji, przechowywania i hydrolizy DNA, stosowanie metody chaotropowej jodku sodu i unikanie fenolu w ekstrakcji DNA, a także stosowanie il...

Niektóre reaktywne formy tlenu (ROS) są zdolne do utleniania wiązań podwójnych węgla w zasadach DNA oraz niektórych atomów węgla w fragmencie deoxyrybozy, co prowadzi do powstawania utlenionych zasad i pęknięć nici DNA1. Jako cząsteczka o ładunku ujemnym, bogata w atomy azotu i tlenu, DNA jest również celem grup elektrofilowych, które reagują kowalencyjnie z miejscami nukleofilowymi (azotem i tlenem), tworząc produkty nazywane adduktami DNA2. Zatem addukty DNA i utlenione zasady DNA są przykładami uszkodzeń DNA, które stanowią przydatne biomarkery w ocenie toksyczności substancji elektrofilowych, substancji generujących reaktywne elektrofile w procesie biotransformacji lub indukujących stres oksydacyjny1,2. Chociaż zmodyfikowane zasady DNA mogą być usuwane z DNA poprzez naprawę przez wycinanie zasad lub nukleotydów (BER lub NER), wywołanie nierównowagi między powstawaniem a usuwaniem uszkodzeń DNA na korzyść tych pierwszych prowadzi do stopniowego wzrostu ich poziomu w DNA w czasie3. Skutkiem tego jest zwiększenie częstości mutacji DNA, obniżenie ekspresji genów oraz zmniejszenie aktywności białek2,4,5,6,7, co są to efekty ściśle powiązane z rozwojem chorób. Mutacje DNA mogą wpływać na różnorodne funkcje komórkowe, takie jak sygnalizacja komórkowa, cykl komórkowy, integralność genomu, stabilność telomerów, epigenom, struktura chromatyny, splicing RNA, homeostaza białkowa, metabolizm, apoptoza i różnicowanie komórek8,9. Strategie mające na celu spowolnienie tempa mutacji komórkowych i rozwoju chorób przewlekłych (np. nowotworów, chorób neurodegeneracyjnych) opierają się na wiedzy o źródłach mutacji, wśród których znajdują się uszkodzenia DNA i ich przyczyny.
Nadmiar endogennie generowanych reaktywnych form tlenu (ROS), powstający w wyniku ekspozycji na zanieczyszczenia, uporczywego stanu zapalnego, patofizjologii chorób (np. cukrzycy) itp., stanowi istotną przyczynę uszkodzeń biomolekuł, w tym uszkodzeń DNA i lipidów1. Przykładowo, wysoce reaktywny rodnik hydroksylowy (OH), powstający w wyniku redukcji H2O2 przez jony metali przejściowych (Fe2+, Cu+), utlenia zasady DNA, część cukrową DNA oraz wielonienasycone kwasy tłuszczowe z szybkością kontrolowaną dyfuzyjnie10. spośród 80 już scharakteryzowanych utlenionych nukleobaz3, najdokładniej zbadaną jest 8-okso-7,8-dihydroguanina (8-oxoGua) lub 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-oxodGuo, Rysunek 1), czyli uszkodzenie zdolne do indukcji transwersji GT w komórkach ssaków10,11. Powstaje ona w wyniku jednoelektronowego utleniania guaniny lub ataku rodnika hydroksylowego bądź tlenu singletowego na guaninę w DNA1. Wielonienasycone kwasy tłuszczowe są innymi ważnymi celami wysoce reaktywnych utleniaczy, takich jak •OH, które inicjują proces peroksydacji lipidów1,12. Prowadzi to do powstania hydroperoksydów kwasów tłuszczowych, które mogą rozkładać się do elektrofilowych aldehydów i epoksyaldehydów, takich jak malondialdehyd, 4-hydroksy-2-nonenal, 2,4-decadienal, 4,5-epoksy-(2E)-decenal, heksenal, akroleina, krotonaldehyd, które są w stanie tworzyć mutagenne egzocykliczne addukty DNA, takie jak addukty malondialdehydowe, propanowe lub etenowe1,12,13. Zasugerowano, że addukty etenowe 1,N2-eteno-2'-deoksyguanozyna (1,N2-εdGuo, Rysunek 1) oraz 1,N6-eteno-2'-deoksyadenozyna (1,N6-εdAdo, Rysunek 1) mogą służyć jako potencjalne biomarkery w patofizjologii stanu zapalnego14,15.
<img alt="Struktury chemiczne zmodyfikowanych nukleozydów; schemat 8-oxo-dG, 1,N²-etheno-dG, 1,N⁶-etheno-dA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Struktury chemiczne uszkodzeń DNA ilościowo określonych w niniejszym badaniu. dR = 2´-dezoksyryboza. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Badania przeprowadzone na początku lat 80. XX wieku umożliwiły czułą detekcję 8-oxodGuo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ECD). Ilościowe oznaczenie 8-oxodGuo metodą HPLC-ECD w kilku systemach biologicznych poddanych warunkom utleniającym doprowadziło do uznania 8-oxodGuo za biomarker uszkodzeń zasad w DNA indukowanych utlenianiem1,16. Chociaż metoda HPLC-ECD jest niezawodna i pozwala na oznaczanie 8-oxodGuo w niskim zakresie fmol17, pomiary te opierają się na dokładności czasu retencji analitytu w celu jego identyfikacji oraz na rozdzielczości chromatograficznej w celu uniknięcia interferencji z innymi składnikami próbki. Ponieważ detekcja elektrochemiczna wymaga zastosowania soli (np. fosforanu potasu, octanu sodu) w fazie ruchomej, utrzymanie odpowiednich warunków analitycznych wiąże się z koniecznością rutynowego czyszczenia kolumny i sprzętu.
Alternatywnie, zastosowanie bakteryjnego enzymu naprawy DNA, formamidopirymidynowej glikozylazy DNA (FPG), a następnie ludzkiej 8-oksoguaninowej glikozylazy 1 (hOGG1), do wykrywania i usuwania 8-oxoGua z DNA, pojawiło się jako sposób na indukcję miejsc alkaliolabilnych w DNA. Miejsca alkaliolabilne są przekształcane w pęknięcia nici DNA, co umożliwia bardzo czułą pośrednią kwantyfikację 8-oxoGua za pomocą alkalicznej elektroforezy pojedynczych komórek w żelu („test kometowy”). Głównymi zaletami tego rodzaju analizy są wysoka czułość oraz możliwość przeprowadzenia badań bez konieczności ekstrakcji DNA z komórek. Metoda ta pozwala na oznaczenie najniższych poziomów stacjonarnych 8-oxoGua w DNA, zazwyczaj 7-10 razy niższych niż poziomy uzyskiwane metodami bioanalitycznymi opartymi na HPLC. Jest to jednak pomiar pośredni 8-oxoGua, a do głównych wad należą brak swoistości lub nieznana wydajność stosowanych enzymów naprawczych1,16,18.
Analizy immunochemiczne stanowią inny zestaw metod stosowanych do wykrywania 8-oxoGua1 oraz egzozyklicznych adduktów DNA, takich jak 1,N6-dAdo i 1,N2-dGuo12. Pomimo wysokiej czułości, wadą stosowania przeciwciał do wykrywania uszkodzeń DNA jest brak specyficzności wynikający z reakcji krzyżowej z innymi składnikami próbek biologicznych, w tym z normalnymi zasadami DNA1,12. Egzozykliczne addukty DNA, w tym 1,N6-dAdo i 1,N2-dGuo, mogą być również wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą wysoce czułych testów z wykorzystaniem znakowania po syntezie 32P-postlabeling12. Wysoka czułość metody 32P-postlabeling umożliwia zastosowanie bardzo małych ilości DNA (np. 10 µg) w celu wykrycia około 1 adduktu na 1010 normalnych zasad19. Jednakże niektórymi wadami są stosowanie substancji radioaktywnych, brak specyficzności chemicznej oraz niska dokładność19,20.
Wspólnym ograniczeniem cytowanych powyżej metod jest niska selektywność lub swoistość w detekcji pożądanych cząsteczek. W tym kontekście HPLC sprzężone z tandemową spektrometrią mas z jonizacją elektrosprayową (HPLC-ESI-MS/MS oraz HPLC-MS3) stało się złotym standardem w oznaczaniu ilościowym zmodyfikowanych nukleozydów w matrycach biologicznych, takich jak DNA, mocz, osocze i ślina1,19,20. Zaletami metod HPLC-ESI-MS/MS są czułość (zazwyczaj w niskim zakresie fmol) oraz wysoka swoistość zapewniona przez i) rozdział chromatograficzny, ii) charakterystyczny i znany wzór fragmentacji cząsteczek w komorze kolizyjnej spektrometru mas oraz iii) precyzyjny pomiar wybranego stosunku masy do ładunku (m/z) w trybie monitorowania wielu reakcji (MRM)1,19. Zastosowanie izotopowo znakowanych standardów wewnętrznych daje dodatkową korzyść w postaci korekty strat cząsteczek podczas hydrolizy DNA i etapów wzbogacania analitytu, a także różnic w jonizacji analitytu pomiędzy próbkami. Pomaga to również w identyfikacji właściwego piku chromatograficznego w przypadku wystąpienia więcej niż jednego piku1,12,19,20.
W celu oznaczania ilościowego 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo oraz 1,N2-dGuo w DNA wyekstrahowanym z różnych próbek biologicznych zastosowano kilka metod opartych na HPLC-ESI-MS/MS12,15,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29. Cząstki drobne (PM2.5) przenoszą związki organiczne i nieorganiczne, takie jak wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), nitro-WWA, aldehydy, ketony, kwasy karboksylowe, chinoliny, metale i jony rozpuszczalne w wodzie, które mogą wywoływać stan zapalny i stres oksydacyjny – warunki sprzyjające uszkodzeniom biomolekuł i rozwojowi chorób30,31,32,33. Przedstawiamy tutaj zwalidowane metody HPLC-ESI-MS/MS, które z sukcesem zastosowano do oznaczania ilościowego 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo oraz 1,N2-dGuo w DNA płuc, wątroby i nerek myszy A/J w celu oceny skutków ekspozycji na PM2.5 w powietrzu zewnętrznym34.

<table><tbody><tr><td>[15N5]-2'-deoksyadenozyna</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-3895-25</td><td></td></tr><tr><td>[15N5]-2'-deoksyguanozyna</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-3899-CA-10</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>412413000</td><td></td></tr><tr><td>alkaliczne fosfataza z błony śluzowej jelit bydlęcych</td><td>Sigma</td><td>P5521</td><td></td></tr><tr><td>octan amonu</td><td>Merck</td><td>101116</td><td></td></tr><tr><td>grasica cielęca DNA</td><td>Sigma</td><td>D1501</td><td></td></tr><tr><td>roztwór do lizy komórek</td><td>QIAGEN</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>412653</td><td></td></tr><tr><td>deferoksamina</td><td>Sigma</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>deoksyrybonukleaza I (DNaza I)</td><td>Bio Basic Inc</td><td>DD0649</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>414542</td><td></td></tr><tr><td>kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>System HPLC-ESI-MS/MS HPLC</td><td>: Agilent 1200 series&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td><td>HPLC: pompa dwubiegunowa (G1312B), pompa izokratyczna (G1310A), piec kolumnowy z kolumnowym zaworem przełączającym (G1316B), detektor matrycy diodowej (G1315C), automatyczny sampler (G1367C).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ESI-MS/MS: Liniowy kwadrupolowy spektrometr masowy z pułapką jonową, model 4000 QTRAP.</td><td></td></tr><tr><td>System HPLC/DAD</td><td>Shimadzu</td><td>Dwie pompy (LC-20AT), detektor matrycy fotodiodowej (DAD-20AV), automatyczny wtryskiwacz (Proeminence SIL-20AC), piec kolumnowy (CTO-10AS/VP)</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna HPLC (średnica wewnętrzna 50 x 2,0 mm, 2,5 i mikro; m, C18)</td><td>Kolumna HPLC Phenomenex</td><td>00B-4446-B0</td><td></td></tr><tr><td>(średnica wewnętrzna 150 x 2,0 mm, 3,0 i mikro; m, C18)</td><td>Kolumna HPLC Phenomenex</td><td>00F-4251-B0</td><td></td></tr><tr><td>(średnica wewnętrzna 250 x 4,6 mm, 5,0 i mikro; m, C18)</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4252-E0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC C18 wkład ochronny (średnica wewnętrzna 4,0 x 3,0 mm)</td><td>Phenomenex</td><td>AJO-4287</td><td></td></tr><tr><td>alkohol izoamylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32658</td><td></td></tr><tr><td>alkohol izopropylowy (izopropanol)</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>A412790010</td><td></td></tr><tr><td>ketaminy</td><td>Ceva</td><td>Nazwa handlowa: Dopalen</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>349377</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>L022909K7</td><td></td></tr><tr><td>fosfodiesterazy I z Crotalus atrox</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td></td></tr><tr><td>roztwór do wytrącania białek</td><td>QIAGEN</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>rybonukleaza A</td><td>Sigma</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>sód chlorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>SPE-C18 (Strata-X)</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S100-TAK</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroksymetylo)-aminometan</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>489983</td><td></td></tr><tr><td>ksylazyna</td><td>Syntec do Brasil</td><td>Nazwa handlowa: Xilazin</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja trzech zmian dna za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Addukty DNA i utlenione zasady DNA są przykładami uszkodzeń DNA, które są użytecznymi biomarkerami do oceny toksyczności substancji, które są elektrofilowe, generują reaktywne elektrofile podczas biotransformacji lub wywołują stres oksydacyjny. Wśród utlenionych zasad nukleinowych najlepiej przebadaną jest 8-okso-7,8-dihydroguanina (8-oxoGua) lub 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-oxodGuo), biomarker oksydacyjnie indukowanego uszkodzenia zasad w DNA. Aldehydy i aldehydy epoksydowe powstające w procesie peroksydacji lipidów są cząsteczkami elektrofilowymi zdolnymi do tworzenia mutagennych egzocyklicznych adduktów DNA, takich jak addukty eteno 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyna (1,N 2-εdGuo) i 1,N 6-eteno-2'-deoksyadenozyna (1,N6-εdAdo), które zostały zasugerowane jako potencjalne biomarkery w patofizjologii stanu zapalnego. Selektywne i czułe metody ich oznaczania ilościowego w DNA są niezbędne do opracowania strategii prewencyjnych mających na celu spowolnienie tempa mutacji komórek i rozwoju chorób przewlekłych (np. raka, chorób neurodegeneracyjnych). Spośród czułych metod dostępnych do ich wykrywania (wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona z detektorami elektrochemicznej lub tandemowej spektrometrii mas, test kometowy, testy immunologiczne, 32P-posttaging), najbardziej selektywne są metody oparte na wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-ESI-MS/MS). Selektywność jest istotną zaletą podczas analizy złożonych próbek biologicznych, a HPLC-ESI-MS/MS rozwinął się jako złoty standard kwantyfikacji zmodyfikowanych nukleozydów w matrycach biologicznych, takich jak DNA, mocz, osocze i ślina. Zastosowanie izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych zwiększa przewagę w postaci poprawek na ubytki cząsteczek podczas etapów hydrolizy DNA i wzbogacania analitu, a także na różnice w jonizacji analitu między próbkami. Pomaga również w identyfikacji prawidłowego piku chromatograficznego, gdy występuje więcej niż jeden pik.
Prezentujemy tutaj sprawdzone, czułe, dokładne i precyzyjne metody HPLC-ESI-MS/MS, które zostały z powodzeniem zastosowane do oznaczania ilościowego 8-oxodGuo, 1,N 6-dAdo i 1,N 2-dGuo w DNA płuc, wątroby i nerek myszy A/J do oceny skutków ekspozycji na PM2.5 w otoczeniu.

Średnie stężenia DNA (± SD) uzyskane z wątroby myszy (~ 1 g tkanki), płuc (~ 0,2 g tkanki) i nerek (~ 0,4 g tkanki) wynosiły odpowiednio 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021 oraz 3 223 ± 723 µg/mL w końcowej objętości 200 µL. Na Rysunku 3 przedstawiono reprezentatywny chromatogram oczyszczonego DNA uzyskany metodą HPLC-DAD. Obecność czterech 2'-deoksynukleozydów, wolnych od rybonukleozydów RNA, które eluentują bezpośrednio przed odpowiadającymi im 2'-deoksynukleozyda...

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Przedstawione tu metody pozwalają na ilościowe określenie zmian DNA wywołanych stresem oksydacyjnym, przyczyniając się do zrozumienia mechanizmów patofizjologicznych, które mogą być celem w profilaktyce i leczeniu chorób. Głównymi zaletami są selektywność i czułość. Selektywność jest istotną zaletą podczas pracy ze złożonymi próbkami biologicznymi.HPLC sprzężona z tandemową spektrometrią mas ewoluowała jako złoty standard dla tego typu kwantyfikacji za pomocą matryc biologicznych. Stres oksydacyjny jest częstym zjawiskiem w różnych procesach patofizjologicznych. Podwyższony poziom adduktów etheno wykryto w tkankach lub moczu pacjentów z chorobami zapalnymi.Uszkodzenia DNA dostarczają również informacji na temat zdarzeń endogennych wywołanych narażeniem na zanieczyszczenia. Jeśli zmiany DNA są zwiększone, ekspozycja może być na poziomie, który zwiększa na przykład ryzyko rozwoju raka. Zmiany można określić ilościowo w DNA z dowolnego systemu komórkowego i alternatywnie w moczu, osoczu, pożywce do hodowli śliny z adaptacjami w przygotowaniu próbki.Na początek użyj płytki hodowlanej umieszczonej na lodzie jako podstawy, aby przeciąć kawałek tkanki skalpelem. Zważ jeden gram tkanki w każdej 50-mililitrowej tubie z nakrętką do natychmiastowego użycia. Pozostałą tkankę trzymaj na suchym lodzie przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Do każdej probówki dodaj 10 mililitrów komercyjnego roztworu do lizy komórek zawierającego 0,5-milimolową deferoksaminę i trzymaj na lodzie. Ustawić homogenizator tkanek na niską prędkość, około 60 do 90 obr./min. Homogenizuj tkanki na lodzie przez kilka minut, aż roztwór będzie bez fragmentów tkanek.Następnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu proteinazy K do każdej homogenizowanej próbki. Wstrząśnij probówkami przez odwrócenie i trzymaj je w temperaturze pokojowej przez noc. Rano dodaj 40 mikrolitrów roztworu rybonukleazy A, wstrząśnij przez odwrócenie i utrzymuj probówki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Dodaj pięć mililitrów komercyjnego roztworu do wytrącania białek, energicznie wiruj i wiruj w temperaturze 2000 razy g, cztery stopnie Celsjusza, przez 10 minut. Przenieść supernatanty do 50-mililitrowych probówek zawierających 10 mililitrów zimnego izopropanolu. Delikatnie odwróć probówki kilka razy, aż do zaobserwowania wytrąconego DNA.Użyj pipety Pasteura zamkniętej na końcu, aby zebrać wytrącone DNA. Przenieś zebrane DNA do probówek zawierających cztery mililitry 10-milimolowego buforu Tris i jednomilimolową deferoksaminę o pH siedem w celu rozpuszczenia. Po całkowitym rozpuszczeniu DNA w probówkach, dodaj cztery mililitry roztworu chloroformu zawierającego 4% alkoholu izoamylowego do każdej probówki.Odwróć probówki 10 razy w celu homogenizacji, odwiruj w temperaturze 2 000 razy g, cztery stopnie Celsjusza, przez 10 minut i przenieś górne fazy do nowych probówek. Powtórzyć płukanie górnej fazy roztworem chloroformu jeszcze dwa razy. Następnie dodaj osiem mililitrów absolutnego etanolu i 0,4 mililitra pięciomolowego roztworu chlorku sodu, aby wytrącić DNA.Ponownie zbierz wytrącone DNA i przenieś je do trzech mililitrów 70% etanolu. Powtórz pranie z 70% etanolem jeszcze raz. Ostrożnie wyrzucić roztwór etanolu i odwrócić probówki zawierające wytrącone DNA na bibułę chłonną, aby usunąć nadmiar roztworu.Po przygotowaniu próbek hydrolizy DNA z wzorcem izotopowym 15N5 1, N6-eteno-deoksyadenozyną i wzorcem izotopowym 15N5 1, N2-eteno-deoksyguanozyny zgodnie z manuskryptem, przenieść 10 mikrolitrów każdej próbki do probówek w celu ilościowego określenia normalnych deoksynukleozydów za pomocą HPLC-UV. Pozostałą objętość poddać ekstrakcji do fazy stałej. Aby wykonać HPLC, najpierw eluuj kolumnę C18 podłączoną do wkładu C18 SecurityGuard o gradiencie 0,1% kwasu mrówkowego i metanolu.Ustaw program gradientu tak, aby działał od zera do 25 minut z zerem do 18% metanolu, od 25 do 27 minut z 18 do 0% metanolu, a następnie od 27 do 37 minut z 0% metanolem przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę i 30 stopni Celsjusza. Następnie wstrzyknąć objętość od dwóch do sześciu mikrolitrów na każdą próbkę zarezerwowaną do normalnej kwantyfikacji deoksynukleozydów. Ustaw detektor DAD na 260 nanometrów w celu integracji pików deoksyguanozyny i deoksyadenozyny.Aby przeprowadzić ekstrakcję do fazy stałej do analiz 1, N6-etheno-deoksyadenozyny i 1, N2-etheno-deoksyguanozyny, najpierw załaduj wkłady serią roztworów o objętości jednego mililitra. Dodaj 100% metanolu, wodę dejonizowaną, hydrolizowaną próbkę DNA, wodę dejonizowaną, 10% metanolu, 15% metanolu i na koniec 100% metanolu do pobrania. Następnie postępuj zgodnie z rękopisem.Po przygotowaniu próbek do hydrolizy DNA 15N5 wzorca izotopowego 8-okso-deoksyguanozyny, przenieść 80 mikrolitrów każdej próbki do fiolek do analizy w systemie HPLC-ESI-MS/MS. Pozostałe 20 mikrolitrów należy zarezerwować do ilościowego oznaczania deoksyguanozyny na HPLC-UV, jak to miało miejsce poprzednio. W celu analizy 8-okso-deoksyguanozyny na HPLC-ESI-MS/MS należy eluować kolumnę A C18 sprzężoną z wkładem C18 SecurityGuard z gradientem rozpuszczalnika A i B przy natężeniu przepływu 150 mikrolitrów na minutę i 25 stopni Celsjusza.Uruchom pompę binarną z zerem do 15% rozpuszczalnika B w ciągu pierwszych 25 minut, 15 do 80% rozpuszczalnika B od 25 do 28 minut, 80% rozpuszczalnika B od 28 do 31 minut, 80% rozpuszczalnika B od 31 do 33 minut i 0% rozpuszczalnika B od 33 do 46 minut. Pierwsze 16 minut eluentu z kolumny A należy skierować na marnotrawstwo. Kondycjonować kolumnę B za pomocą pompy izokratycznej roztworem 15% metanolu w wodzie zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego przy natężeniu przepływu 150 mikrolitrów na minutę.Po sześciu minutach sprawdzić chromatogram, aby upewnić się, że wzorzec 8-okso-deoksyguanozyny wymywa się z kolumny A. W odstępie od 16 do 32 minut przestawić zawór w pozycję umożliwiającą połączenie między kolumną A a kolumną B. Zamknąć zawór po 32 minutach, aby wymyć 8-okso-deoksyguanozynę z drugiej kolumny i uzyskać ostry pik chromatograficzny. W celu analizy 1, N6-eteno-deoksyadenozyny i 1, N2-eteno-deoksyguanozyny, należy eluować kolumnę C18 sprzężoną z wkładem C18 SecurityGuard z gradientem rozpuszczalnika A i B przy natężeniu przepływu 130 mikrolitrów na minutę i 25 stopni Celsjusza. Uruchomić pompę binarną z 0% rozpuszczalnika B przez pierwsze 10 minut, od zera do 20% rozpuszczalnika B przez 10 do 39 minut, 20 do 75% rozpuszczalnika B od 39 do 41 minut, 75% rozpuszczalnika B od 41 do 46 minut, 75% rozpuszczalnika B od 46 do 47 minut, i 0% rozpuszczalnika B od 47 do 60 minut.Za pomocą zaworu przełączającego należy skierować pierwsze 35 minut eluentu do odpadów, a frakcję trwającą od 35 do 42 minut do źródła ESI. Upewnij się, że wzorce addukcji eluują się z kolumny w ustawionym interwale. Zintegrować piki wzorca izotopowego 8-okso-deoksyguanozyny 15N5 8-okso-deoksyguanozyny, 1, N6-eteno-deoksyadenozyny, wzorca izotopowego 15N5 1, N6-eteno-deoksyadenozyny, 1, N2-eteno-deoksyguanozyny i wzorca izotopowego 15N5 1, N2-eteno-deoksyguanozyny z analiz HPLC-ESI-MS/MS.Obliczyć stosunki powierzchni dla krzywych kalibracyjnych i próbek. Ustal krzywe kalibracyjne i oblicz ilość zmian chorobowych w każdej wstrzykniętej próbce. Zintegrować piki deoksyguanozyny i deoksyadenozyny z analiz HPLC-UV.Na tych obszarach należy wyznaczyć krzywe kalibracyjne i obliczyć ilości deoksyguanozyny i deoksyadenozyny u zwierząt w każdej wstrzykniętej próbce. Obliczyć frakcje molowe dla 8-okso-deoksyguanozyny nad deoksyguanozyną, 1, N6-eteno-deoksyadenozyny nad deoksyadenozyną i 1, N2-eteno-deoksyguanozyny nad deoksyguanozyną, co daje liczbę zmian na milion normalnej deoksyguanozyny lub deoksyadenozyny. Reprezentatywny chromatogram oczyszczonego DNA otrzymanego metodą HPLC-UV wykazuje obecność czterech normalnych deoksynukleozydów, wolnych od rybonukleozydów RNA, co świadczy o czystości DNA.Pokazano reprezentatywne chromatogramy z HPLC-ESI-MS/MS 8-okso-deoksyguanozyny, 1, N6-eteno-deoksyadenozyny i 1, N2-eteno-deoksyguanozyny w próbkach DNA tkanek myszy. Chromatogram uzyskany z detekcją UV pokazuje cztery normalne deoksynukleozydy eluujące z pierwszej kolumny do około 10 minut, z dobrym oddzieleniem od 8-okso-deoksyguanozyny, eliminując niepożądane zakłócenia. Ważną rzeczą, o której należy pamiętać w przypadku dokładnych określeń ilościowych, jest to, aby w krzywych kalibracyjnych i próbkach zawsze znajdowały się te same ilości wzorców wewnętrznych w objętości wtrysku.Przedstawione tutaj metody mogą być dostosowane do oznaczania ilościowego innych zmodyfikowanych deoksynukleozydów. Rozszerzenie pasma zmodyfikowanych deoksynukleozydów pozwala na lepsze zrozumienie leżących u ich podstaw mechanizmów patofizjologicznych. Możemy badać rolę uszkodzeń oksydacyjnych w różnych sytuacjach, takich jak narażenie na ksenobiotyki, cukrzyca i złośliwa transformacja komórek, pomagając w ten sposób w opracowywaniu strategii profilaktycznych i leczniczych.

quantification-three-dna-lesions-mass-spectrometry-assessment-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

Ten protokół opisuje techniki kwantyfikacji i charakterystyki aberracji chromosomowych in vitro w makrofagach myszy RAW264.7 po leczeniu cząstkami powietrza atmosferycznego.

Analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Prezentujemy metodę wykrywania chemicznych modyfikacji białek atmosferycznych 3-nitrotyrozyny za pomocą krążków o średnicy 6 mm wyciętych z filtrów wstępnych próbnika powietrza za pomocą wysokowydajnego detektora chromatografii cieczowej i elektrochemicznego (HPLC-ECD).

Wykrywanie 3-nitrotyrozyny w środowisku atmosferycznym za pomocą wysokowydajnego systemu chromatografii cieczowej z detektorem elektrochemicznym

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół eksperymentalny do pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych w celu oceny dawki ekspozycji wewnętrznej na poziomie indywidualnej ekspozycji na cząstki stałe.

Pomiar zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych narażonych na cząstki stałe zawierające węgiel

Niniejsze badanie opisuje metodę pozwalającą na szybką i jednoznaczną diagnostykę chorób wirusowych roślin w czasie około pół dnia, wykorzystując połączenie wspomaganego mikrofalowo przygotowania próbek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz metod barwienia negatywowego.

Szybka diagnostyka chorób wirusowych roślin z wykorzystaniem wspomagania mikrofalowego za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę kwantyfikacji uszkodzeń DNA wywołanych stresem oksydacyjnym w tkankach myszy narażonych na działanie pyłu PM 2.5. Technika HPLC-MS/MS zapewnia wysoką czułość i selektywność analizy.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Przeglądaj więcej filmów