Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Przedstawione tu metody pozwalają na ilościowe określenie zmian DNA wywołanych stresem oksydacyjnym, przyczyniając się do zrozumienia mechanizmów patofizjologicznych, które mogą być celem w profilaktyce i leczeniu chorób. Głównymi zaletami są selektywność i czułość. Selektywność jest istotną zaletą podczas pracy ze złożonymi próbkami biologicznymi.

HPLC sprzężona z tandemową spektrometrią mas ewoluowała jako złoty standard dla tego typu kwantyfikacji za pomocą matryc biologicznych. Stres oksydacyjny jest częstym zjawiskiem w różnych procesach patofizjologicznych. Podwyższony poziom adduktów etheno wykryto w tkankach lub moczu pacjentów z chorobami zapalnymi.

Uszkodzenia DNA dostarczają również informacji na temat zdarzeń endogennych wywołanych narażeniem na zanieczyszczenia. Jeśli zmiany DNA są zwiększone, ekspozycja może być na poziomie, który zwiększa na przykład ryzyko rozwoju raka. Zmiany można określić ilościowo w DNA z dowolnego systemu komórkowego i alternatywnie w moczu, osoczu, pożywce do hodowli śliny z adaptacjami w przygotowaniu próbki.

Na początek użyj płytki hodowlanej umieszczonej na lodzie jako podstawy, aby przeciąć kawałek tkanki skalpelem. Zważ jeden gram tkanki w każdej 50-mililitrowej tubie z nakrętką do natychmiastowego użycia. Pozostałą tkankę trzymaj na suchym lodzie przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Do każdej probówki dodaj 10 mililitrów komercyjnego roztworu do lizy komórek zawierającego 0,5-milimolową deferoksaminę i trzymaj na lodzie. Ustawić homogenizator tkanek na niską prędkość, około 60 do 90 obr./min. Homogenizuj tkanki na lodzie przez kilka minut, aż roztwór będzie bez fragmentów tkanek.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu proteinazy K do każdej homogenizowanej próbki. Wstrząśnij probówkami przez odwrócenie i trzymaj je w temperaturze pokojowej przez noc. Rano dodaj 40 mikrolitrów roztworu rybonukleazy A, wstrząśnij przez odwrócenie i utrzymuj probówki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Dodaj pięć mililitrów komercyjnego roztworu do wytrącania białek, energicznie wiruj i wiruj w temperaturze 2000 razy g, cztery stopnie Celsjusza, przez 10 minut. Przenieść supernatanty do 50-mililitrowych probówek zawierających 10 mililitrów zimnego izopropanolu. Delikatnie odwróć probówki kilka razy, aż do zaobserwowania wytrąconego DNA.

Użyj pipety Pasteura zamkniętej na końcu, aby zebrać wytrącone DNA. Przenieś zebrane DNA do probówek zawierających cztery mililitry 10-milimolowego buforu Tris i jednomilimolową deferoksaminę o pH siedem w celu rozpuszczenia. Po całkowitym rozpuszczeniu DNA w probówkach, dodaj cztery mililitry roztworu chloroformu zawierającego 4% alkoholu izoamylowego do każdej probówki.

Odwróć probówki 10 razy w celu homogenizacji, odwiruj w temperaturze 2 000 razy g, cztery stopnie Celsjusza, przez 10 minut i przenieś górne fazy do nowych probówek. Powtórzyć płukanie górnej fazy roztworem chloroformu jeszcze dwa razy. Następnie dodaj osiem mililitrów absolutnego etanolu i 0,4 mililitra pięciomolowego roztworu chlorku sodu, aby wytrącić DNA.

Ponownie zbierz wytrącone DNA i przenieś je do trzech mililitrów 70% etanolu. Powtórz pranie z 70% etanolem jeszcze raz. Ostrożnie wyrzucić roztwór etanolu i odwrócić probówki zawierające wytrącone DNA na bibułę chłonną, aby usunąć nadmiar roztworu.

Po przygotowaniu próbek hydrolizy DNA z wzorcem izotopowym 15N5 1, N6-eteno-deoksyadenozyną i wzorcem izotopowym 15N5 1, N2-eteno-deoksyguanozyny zgodnie z manuskryptem, przenieść 10 mikrolitrów każdej próbki do probówek w celu ilościowego określenia normalnych deoksynukleozydów za pomocą HPLC-UV. Pozostałą objętość poddać ekstrakcji do fazy stałej. Aby wykonać HPLC, najpierw eluuj kolumnę C18 podłączoną do wkładu C18 SecurityGuard o gradiencie 0,1% kwasu mrówkowego i metanolu.

Ustaw program gradientu tak, aby działał od zera do 25 minut z zerem do 18% metanolu, od 25 do 27 minut z 18 do 0% metanolu, a następnie od 27 do 37 minut z 0% metanolem przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę i 30 stopni Celsjusza. Następnie wstrzyknąć objętość od dwóch do sześciu mikrolitrów na każdą próbkę zarezerwowaną do normalnej kwantyfikacji deoksynukleozydów. Ustaw detektor DAD na 260 nanometrów w celu integracji pików deoksyguanozyny i deoksyadenozyny.

Aby przeprowadzić ekstrakcję do fazy stałej do analiz 1, N6-etheno-deoksyadenozyny i 1, N2-etheno-deoksyguanozyny, najpierw załaduj wkłady serią roztworów o objętości jednego mililitra. Dodaj 100% metanolu, wodę dejonizowaną, hydrolizowaną próbkę DNA, wodę dejonizowaną, 10% metanolu, 15% metanolu i na koniec 100% metanolu do pobrania. Następnie postępuj zgodnie z rękopisem.

Po przygotowaniu próbek do hydrolizy DNA 15N5 wzorca izotopowego 8-okso-deoksyguanozyny, przenieść 80 mikrolitrów każdej próbki do fiolek do analizy w systemie HPLC-ESI-MS/MS. Pozostałe 20 mikrolitrów należy zarezerwować do ilościowego oznaczania deoksyguanozyny na HPLC-UV, jak to miało miejsce poprzednio. W celu analizy 8-okso-deoksyguanozyny na HPLC-ESI-MS/MS należy eluować kolumnę A C18 sprzężoną z wkładem C18 SecurityGuard z gradientem rozpuszczalnika A i B przy natężeniu przepływu 150 mikrolitrów na minutę i 25 stopni Celsjusza.

Uruchom pompę binarną z zerem do 15% rozpuszczalnika B w ciągu pierwszych 25 minut, 15 do 80% rozpuszczalnika B od 25 do 28 minut, 80% rozpuszczalnika B od 28 do 31 minut, 80% rozpuszczalnika B od 31 do 33 minut i 0% rozpuszczalnika B od 33 do 46 minut. Pierwsze 16 minut eluentu z kolumny A należy skierować na marnotrawstwo. Kondycjonować kolumnę B za pomocą pompy izokratycznej roztworem 15% metanolu w wodzie zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego przy natężeniu przepływu 150 mikrolitrów na minutę.

Po sześciu minutach sprawdzić chromatogram, aby upewnić się, że wzorzec 8-okso-deoksyguanozyny wymywa się z kolumny A. W odstępie od 16 do 32 minut przestawić zawór w pozycję umożliwiającą połączenie między kolumną A a kolumną B. Zamknąć zawór po 32 minutach, aby wymyć 8-okso-deoksyguanozynę z drugiej kolumny i uzyskać ostry pik chromatograficzny. W celu analizy 1, N6-eteno-deoksyadenozyny i 1, N2-eteno-deoksyguanozyny, należy eluować kolumnę C18 sprzężoną z wkładem C18 SecurityGuard z gradientem rozpuszczalnika A i B przy natężeniu przepływu 130 mikrolitrów na minutę i 25 stopni Celsjusza. Uruchomić pompę binarną z 0% rozpuszczalnika B przez pierwsze 10 minut, od zera do 20% rozpuszczalnika B przez 10 do 39 minut, 20 do 75% rozpuszczalnika B od 39 do 41 minut, 75% rozpuszczalnika B od 41 do 46 minut, 75% rozpuszczalnika B od 46 do 47 minut, i 0% rozpuszczalnika B od 47 do 60 minut.

Za pomocą zaworu przełączającego należy skierować pierwsze 35 minut eluentu do odpadów, a frakcję trwającą od 35 do 42 minut do źródła ESI. Upewnij się, że wzorce addukcji eluują się z kolumny w ustawionym interwale. Zintegrować piki wzorca izotopowego 8-okso-deoksyguanozyny 15N5 8-okso-deoksyguanozyny, 1, N6-eteno-deoksyadenozyny, wzorca izotopowego 15N5 1, N6-eteno-deoksyadenozyny, 1, N2-eteno-deoksyguanozyny i wzorca izotopowego 15N5 1, N2-eteno-deoksyguanozyny z analiz HPLC-ESI-MS/MS.

Obliczyć stosunki powierzchni dla krzywych kalibracyjnych i próbek. Ustal krzywe kalibracyjne i oblicz ilość zmian chorobowych w każdej wstrzykniętej próbce. Zintegrować piki deoksyguanozyny i deoksyadenozyny z analiz HPLC-UV.

Na tych obszarach należy wyznaczyć krzywe kalibracyjne i obliczyć ilości deoksyguanozyny i deoksyadenozyny u zwierząt w każdej wstrzykniętej próbce. Obliczyć frakcje molowe dla 8-okso-deoksyguanozyny nad deoksyguanozyną, 1, N6-eteno-deoksyadenozyny nad deoksyadenozyną i 1, N2-eteno-deoksyguanozyny nad deoksyguanozyną, co daje liczbę zmian na milion normalnej deoksyguanozyny lub deoksyadenozyny. Reprezentatywny chromatogram oczyszczonego DNA otrzymanego metodą HPLC-UV wykazuje obecność czterech normalnych deoksynukleozydów, wolnych od rybonukleozydów RNA, co świadczy o czystości DNA.

Pokazano reprezentatywne chromatogramy z HPLC-ESI-MS/MS 8-okso-deoksyguanozyny, 1, N6-eteno-deoksyadenozyny i 1, N2-eteno-deoksyguanozyny w próbkach DNA tkanek myszy. Chromatogram uzyskany z detekcją UV pokazuje cztery normalne deoksynukleozydy eluujące z pierwszej kolumny do około 10 minut, z dobrym oddzieleniem od 8-okso-deoksyguanozyny, eliminując niepożądane zakłócenia. Ważną rzeczą, o której należy pamiętać w przypadku dokładnych określeń ilościowych, jest to, aby w krzywych kalibracyjnych i próbkach zawsze znajdowały się te same ilości wzorców wewnętrznych w objętości wtrysku.

Przedstawione tutaj metody mogą być dostosowane do oznaczania ilościowego innych zmodyfikowanych deoksynukleozydów. Rozszerzenie pasma zmodyfikowanych deoksynukleozydów pozwala na lepsze zrozumienie leżących u ich podstaw mechanizmów patofizjologicznych. Możemy badać rolę uszkodzeń oksydacyjnych w różnych sytuacjach, takich jak narażenie na ksenobiotyki, cukrzyca i złośliwa transformacja komórek, pomagając w ten sposób w opracowywaniu strategii profilaktycznych i leczniczych.