Opracowanie ukierunkowanych populacji indukowanych miejscowymi zmianami chorobowymi w genomach (TILLING) w małych uprawach zbóż metodą mutagenezy metanosulfonianu etylu

Protokół ten szczegółowo opisuje rozwój silnych populacji TILLING o wysokiej częstotliwości mutacji przez mutagenezę EMS w uprawach małych zbóż. Populacje opracowane w ramach projektu TILLING mogą być wykorzystywane do genomiki funkcjonalnej, a także do odkrywania genów w przestrzeni genetycznej w małych uprawach zbóż. Populacje TILLING opracowane przy użyciu tej techniki charakteryzują się wysoką częstością mutacji, a protokół ten można zastosować do dowolnego genotypu.

Wykrywanie mutacji w oparciu o test Cel-1 można przeprowadzić przy użyciu podstawowego sprzętu laboratoryjnego. Najważniejszym krokiem jest określenie optymalnego stężenia EMS. W związku z tym należy sporządzić krzywą dawkowania EMS specjalnie dla danej populacji.

Na początek namocz 100 nasion z interesującym genotypem w każdym z sześciu 250-mililitrowych szklanych kolb, zawierających 50 mililitrów wody destylowanej. Wstrząsaj z prędkością 100 obr./min przez osiem godzin w temperaturze pokojowej w celu wchłonięcia. Następnie w dygestorium przygotuj 50 mililitrów roztworów EMS o pięciu różnych stężeniach, mieszając ciecz EMS i wodę destylowaną.

Po spożyciu wody należy zdekantować z pięciu kolb. Dodać 50 mililitrów roztworu EMS do każdej z pięciu kolb zawierających wchłonięte nasiona. Potrząsać kolbami przez 16 godzin przy 75 obr./min w temperaturze pokojowej.

Teraz przelej roztwór EMS do pustej butelki na odpady i wlej zaprawione nasiona na gazę umieszczoną na pustej butelce na odpady, aby zbierać osobno dla każdego zabiegu. Użyj dodatkowej wody, aby pomóc w nalewaniu nasion. Rozpyl również kilka mililitrów roztworu inaktywującego EMS na ściankę zanieczyszczonych kolb.

I zanurz zużyte końcówki pipet w roztworze na 24 godziny. Dezaktywować użyty roztwór EMS, dodając jedną objętość roztworu inaktywującego EMS do leczenia przez 24 godziny. Za pomocą opaski zaciskowej trzymaj nasiona zaprawione EMS w gazie i myj pod bieżącą wodą z kranu przez dwie godziny.

Po umyciu przesadź każde nasiono indywidualnie do trenażerów korzeni zawierających ziemię doniczkową. Uprawiaj rośliny w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza przez 16-godzinny okres świetlny. Po 15 dniach od przesadzenia sprawdź rośliny i policz liczbę nasion, które nie wykiełkowały.

Rejestruj dane dotyczące przeżywalności roślin. Jeśli wskaźnik przeżycia nie mieści się w przedziale od 40 do 60%, przeprowadź drugą rundę optymalizacji dawkowania ze zmodyfikowanym stężeniem, aż do osiągnięcia pożądanego wskaźnika śmiertelności od 40 do 60%Po eksperymencie mutagenezy zbierz tkankę liści roślin M2 w 96-dołkowym pudełku do pobierania tkanek. Tkanka jest pobierana z roślin M2, które zostały wyhodowane z samodzielnie wyhodowanych roślin M1.

Z każdej rośliny M1 pokazana jest jedna roślina M2. Ekstrahuj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA roślinnego z systemem oczyszczania DNA zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie załaduj dwa mikrolitry ekstraktu DNA do płytek LV z 16 gniazdami.

Określ ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru na długościach fal 260 i 280 nanometrów. Rozcieńczyć stężenie DNA do 25 nanogramów na mikrolitr wodą wolną od nukleaz. Utwórz czterokrotne pule DNA po 200 mikrolitrów, łącząc DNA z każdej studzienki w czterech 96 blokach dołków w płytę basenową, zachowując tożsamość rzędu i kolumny każdej próbki.

Następnie przygotuj probówkę z mieszanką główną PCR dla starterów specyficznych dla genów, dodając do każdej probówki bufor PCR, startery do przodu i do tyłu oraz polimerazę DNA zgodnie z manuskryptem. Podwielokrotną mieszaninę wzorcową umieścić w dołkach 96-dołkowej płytki PCR. Następnie dodaj zbiorczą matrycę DNA.

Załaduj probówki PCR do termocyklera i użyj profilu przyziemienia, aby uruchomić reakcję PCR na termocyklerze. Aby wygenerować heterodupleksy między niedopasowanymi DNA, inkubuj produkty PCR w termocyklerze w innym programie. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra domowej endonukleazy Cel-1 do każdego z heterodupleksowanych produktów PCR.

Inkubować przez 45 minut w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Następnie zakończ reakcję Cel-1, dodając 2,5 mikrolitra 0,5 molowego EDTA o pH ósmym. Załaduj 30,5 mikrolitra każdego produktu poddanego działaniu Cel-1 zmieszanego z pięcioma mikrolitrami barwnika na 3% żel agarozowy i pracuj pod napięciem 100 woltów przez dwie i pół godziny.

Aby zdekonwoluować pule mutantów, określ zygotyczność mutantów, przeprowadzając dwie reakcje PCR dla pojedynczego DNA M2, w których pierwsza reakcja zawiera 2,5 mikrolitra DNA M2 i 2,5 mikrolitra DNA typu dzikiego, a druga reakcja zawiera tylko pięć mikrolitrów DNA M2. Protokół ten pokazuje mutagenizację EMS małych upraw zbóż i charakterystykę mutanta. Krzywa dawkowania wskazuje optymalne dawki EMS dla pożądanych 50% wskaźników przeżycia dla trzech różnych gatunków pszenicy.

Obecność łatwych do zidentyfikowania fenotypów w populacji M2 potwierdza skuteczność mutagenezy w populacjach drobnoziarnistych. Oto cztery przykłady zmutowanych fenotypów w populacjach M2 TILLING, mutant albinos w populacji jęczmienia M2, mutant chloriny w populacji jęczmienia M2, różnorodny mutant z różowymi przebarwieniami w populacji Aegilops tauschii M2 oraz mutant o niskiej trwałości w populacji Triticum monococcum M2. Identyfikacja mutantów przy użyciu Cel-1 na platformach z żelu agarozowego pokazuje potencjalną pulę mutantów zidentyfikowaną z 12 pul mutantów za pomocą unikalnych rozszczepionych pasm.

Dekonwolucja pul mutantów określiła zygotyczność mutacji i pomogła wyśledzić mutację aż do poszczególnych próbek. Pula A4 miała heterozygotyczne mutacje, na które wskazują rozszczepione prążki zarówno w próbkach DNA typu dzikiego w ramce 4, jak i w ramce 4. Pula H5 zawierała mutacje homozygotyczne, ponieważ unikalne rozszczepione prążki były obecne tylko w próbce DNA typu dzikiego Box 5 H5.

Najważniejszym krokiem jest określenie optymalnego stężenia EMS, aby osiągnąć wskaźnik śmiertelności od 40 do 60%. Po opracowaniu populacji TILLING o wysokiej częstości mutacji, można ją wykorzystać do funkcjonalnej charakterystyki dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto populacja może być źródłem użytecznej zmienności genetycznej dla poprawy upraw.

Uprawa roli jest szeroko stosowana w funkcjonalnych badaniach genomicznych na roślinach modelowych i uprawnych. Zakres uzyskanych mutacji może być chybiony, nokautowany, cichy, a nawet nietrafiony. EMS jest mutagenem.

Dlatego podczas obsługi EMS należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. Odkaż resztki roztworów i zużyte końcówki do pipet.