Name: Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj protokół wytwarzania włókienek preformowanych alfa-synukleiny z monomerów i ich zastosowanie in vivo w modelach choroby Parkinsona. Metoda obejmuje kontrolę jakości i precyzyjną iniekcję neurochirurgiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty Fundacji Michaela J. Foxa, Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NS099416) oraz Weston Brain Institute.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li>
<li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li>
<li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Over+Quantity%3A+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
<li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
<li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).</li>
<li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson%27s+Disease+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li>
<li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li>
<li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein%2C+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788(2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li>
<li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li>
<li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li>
</ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk i Caryl Sortwell są obecnie zaangażowani w ustalenia umowne z Fundacją Michaela J. Foxa w celu kontroli jakości materiału α-syn generowanego przez Proteos, Inc. Współautorka Nicole Polinski jest pracownikiem Fundacji Michaela J. Foxa, która zawarła umowę z Proteos, Inc. na produkcję monomeru α-syn. Współautorzy Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley i Nicholas Kanaan nie mają nic do ujawnienia.

Produkcja α-syn PFF zdolnych do wysiewania neuronów i prowadzenia do inkluzji podobnych do ciał Lewy'ego zależy od wielu czynników i etapów. Krytycznym czynnikiem jest to, że monomery używane do generowania włókienek muszą być specjalnie opracowane do fibrylizacji 4,9,14,15. Jeśli monomery nie są sformułowane do fibrylizacji, fibryle mogą się nie tworzyć lub fibryle, które się tworzą, mogą nie wytwarzać patologii α-syn. Podobnie bufor, w którym znajdują się monomery, również wpływa na fibrylizację. W związku z tym, aby uzyskać najlepsze wyniki, stężenie soli powinno wynosić około 100 mM NaCl, a pH między 7,0 a 7,3. Pierwszym krokiem, który wprowadza zmienność, jest metoda, za pomocą której określa się początkową zawartość białka, przy czym pomiar przy A280 prawdopodobnie da dokładniejsze wyniki i dlatego jest to metoda preferowana. Rozbieżność w stężeniu białka może zmniejszyć skuteczność procesu fibrylacji, a także zmienić założone stężenie PFF stosowane w eksperymentach. Oba mogą prowadzić do spadku wydajności wysiewu i różnic w partiach między eksperymentami.
Wstępne etapy kontroli jakości potwierdzą krytyczne cechy PFF, w szczególności to, że mają one konformację fibrylarną (mikroskopia elektronowa), zawierają struktury amyloidowe (test tioflawiny T) i są granulowane (test sedymentacyjny). Ważne jest, aby pamiętać, że wyniki testu tioflawiny T będą się zmieniać w czasie i nie są bezpośrednią miarą ilości obecnych struktur amyloidowych, a raczej test tioflawiny T powinien być stosowany tylko jako wskaźnik obecności struktur amyloidowych w próbce. Tioflawina T jest zwykle stosowana w testach in vitro, takich jak wyżej wymieniony test, aby wykazać, że fibryle zawierają struktury amyloidowe. Alternatywnie, tioflawina S jest stosowana w tkankach do wykrywania struktur amyloidowych, jak pokazano na rycinie 7. Jeśli chodzi o test sedymentacji, wyniki pokazują jedynie, że PFF występują głównie we frakcji granulowanej. Ponieważ próbki są prowadzone w warunkach denaturacji, na żelach znajduje się pojedyncze wyraźne pasmo o wielkości około 14 kDa, wielkości monomerów α-syn. W przeciwieństwie do wielu prążków obecnych przy wyższych masach cząsteczkowych, których można by się spodziewać w przypadku PFF, gdyby zastosowano żel natywny lub niedenaturujący. Wreszcie, pomyślne przejście wszystkich tych początkowych etapów kontroli jakości nie gwarantuje działania polegającego na zasiewaniu inkluzji α-syn. Z tego powodu należy przeprowadzić eksperymenty z hodowlą komórkową lub małą kohortą zwierząt, którym wstrzyknięto chirurgicznie, w celu zbadania skuteczności PFF przed użyciem w większych eksperymentach.
Sonikacja jest kluczowym krokiem w procesie, a parametry będą się różnić w zależności od zastosowanego modelu sonikatora. Parametry sonikacji muszą być zastosowane i zweryfikowane, aby wykazać, że wyprodukowano krótkie fragmenty PFF. Wielkość włókienek ma wpływ na wysiew, przy czym krótszy filament wysiewa się bardziej efektywnie. Chociaż krótsze włókienki wysiewają się bardziej efektywnie, efekt ten stabilizuje się, a optymalna długość PFF wynosi około 50 nm 4,18. Ważne jest również, aby nie poddawać próbek nadmiernymi sonikacjami i nie wystawiać PFF na nadmierne ciepło, ponieważ może to obniżyć wydajność wysiewu. Te sonikowane PFF powinny być testowane pod kątem skuteczności w hodowlach małych komórek lub eksperymentach in vivo przed użyciem w eksperymentach na większą skalę. Ponieważ różne sesje sonikacji mogą potencjalnie wprowadzać zmienność, należy odpowiednio zaplanować eksperymentalne grupy leczenia.
Podczas dostarczania PFF in vivo, lokalizacja miejsca wstrzyknięcia i całkowita ilość użytych PFF może wpływać na liczbę neuronów, u których rozwiną się inkluzje, a także na zakres neurodegeneracji 7,14. Współrzędne w protokole stanowią punkt wyjścia, ale powinny zostać przetestowane w laboratorium, aby upewnić się, że pożądany region docelowy rozwija patologię α-syn przed użyciem w eksperymentach na dużą skalę. W razie potrzeby można użyć barwnika śledzącego lub kulek fluorescencyjnych jako sposobu na przetestowanie kierowania regionalnego przed użyciem PFF. Ilość PFF stosowanych in vivo różni się w zależności od grupy, przy czym większość grup używa łącznie od 5 do 20 μg PFF w jednym lub podzielonym między dwa miejsca wstrzyknięcia 1,2,3,4,5,6,7,14. Ponieważ liczba miejsc wstrzyknięcia, lokalizacja miejsc wstrzyknięć i ilość wstrzykniętych PFF mogą wpływać na wyniki i progresję synukleinopatii, przed użyciem modelu do testowania potencjalnych interwencji lub badania czasowych cech modelu należy scharakteryzować dalsze wyniki zastosowanych parametrów.
Wybierając model do wykorzystania do testowania środków terapeutycznych lub badania progresji choroby, należy wybrać zastosowany model tak, aby jak najlepiej odpowiadał na zadane pytanie. Nie wszystkie modele będą posiadały pewne cechy chorobowe choroby Parkinsona lub będą oferować ramy czasowe potrzebne do przetestowania potencjalnych interwencji. Model PFF podsumowuje kluczowe cechy choroby Parkinsona, takie jak patologia α-syn i neurodegeneracja, i może prowadzić do umiarkowanych zaburzeń motorycznych. Model oferuje przewidywalny i długotrwały przebieg w czasie, w którym inkluzje tworzą się na kilka miesięcy przed neurodegeneracją. Pozwala to naukowcom na zbadanie i wykorzystanie różnych faz przedłużającej się progresji synukleinopatii. Oczekuje się, że obecne i przyszłe wykorzystanie modelu w ujęciu ogólnym będzie korzystne w badaniach nad progresją choroby i opracowywaniem nowych terapii.

Choroba Parkinsona (PD) charakteryzuje się przede wszystkim pośmiertną charakterystyką dwóch głównych cech patologicznych: rozległą i postępującą patologią alfa-synukleiny (α-syn) oraz zwyrodnieniem nigrostriatalnym. Po wstrzyknięciu myszom lub szczurom typu dzikiego, α-syn preformowane fibryle (PFF) indukują postępującą akumulację patologicznej α-syn, co może skutkować przedłużającą się degeneracją neuronów dopaminowych istoty czarnej pars compacta (SNpc) w ciągu wielu miesięcy, a także deficytami sensomotorycznymi1,2,3,4,5,6. Neurony są wystawione na działanie włókien α-syn, albo poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie domózgowe, albo dodane do pożywki hodowanych neuronów. Kiedy PFF są wprowadzane do neuronów, PFF działają, aby "zasiać" tworzenie inkluzji poprzez szablonowanie i akumulację endogennego α-syn do fosforylowanych inkluzji1,7,8,9. Inkluzje mają podobne właściwości do ciał Lewy'ego: zawierają α-syn fosforylowany w serynie 129 (pSyn), ubikwitynę i p62; posiadają czwartorzędowe struktury amyloidowe, jak wykazano w przypadku dodatniego barwienia tioflawiną; i są odporne na trawienie proteinazy K1,3,5,7,8,9,10,11,12. Ekspozycja na PFF prowadzi do powstania inkluzji α-syn w pierwotnych i niektórych unieśmiertelnionych neuronach w hodowli, a także u myszy, szczurów i naczelnych in vivo1,2,3,4,5,6,7,8,9,13. Ważne jest, aby pamiętać, że PFF nie doprowadzą do powstania inkluzji α-syn we wszystkich modelach hodowli komórkowych, a niektóre hodowane neurony będą się lepiej wysiewać niż inne.
Inną ważną cechą modelu PFF in vivo α-syn są wyraźne sekwencyjne fazy patologiczne, które pojawiają się w ciągu kilku miesięcy. U gryzoni, po wstrzyknięciu śródprążkowiowym, tworzenie inkluzji α-syn zwykle osiąga szczyt w SNpc i wielu regionach korowych w ciągu 1-2 miesięcy. Po tym szczycie agregacji następuje zwyrodnienie nigrostriatalne ≈2-4 miesiące później1,3,5. Te odrębne etapy patologiczne zapewniają naukowcom platformę, za pomocą której mogą badać i opracowywać strategie, które 1) zmniejszają agregację α-syn, 2) usuwają już powstałe inkluzje α-syn i/lub 3) zapobiegają późniejszej neurodegeneracji. Model PFF ma wyraźne zalety i wady w porównaniu z modelami nadekspresji α-syn za pośrednictwem wektorów neurotoksycznych, transgenicznych i wirusowych, jak wcześniej recenzowano6. Wybór modelu lub podejścia powinien być uzależniony od tego, który model najlepiej odpowiada pytaniu, które zadają sobie badacze.
Chociaż model PFF został z powodzeniem wykorzystany przez wiele laboratoriów, nadal istnieją grupy, które doświadczyły niespójności w generowaniu włókienek i wytwarzaniu spójnych α-syn patologii14. Przykłady niespójności obejmują PFF, które wytwarzają niewielką lub żadną patologię α-syn, wydajność wysiewu z partii na partię, a nawet niepowodzenie w tworzeniu włókienek. W związku z tym standaryzacja generowania α-syn PFF i stosowania in vivo ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dokładną interpretację wpływu nowych interwencji terapeutycznych. Poniższy protokół przedstawia kroki wymagane do wytworzenia PFF z monomerów α-syn, kontrolę jakości in vitro PFF po utworzeniu, sonikację i pomiar PFF przed użyciem oraz sugestie ułatwiające skuteczne wstrzyknięcie PFF in vivo szczurom lub myszom.

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-alfa-synukleinowe (fosforylowane przez serynę 129)</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-alfa-synukleinowe</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bicynchonowy</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,036 cala)</td><td> Medical</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,044")</td> <td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoTop Podgrzewana pokrywa</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon Siatki do mikroskopii elektronowej</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Szklana rurka kapilarna (średnica zewnętrzna 0,53 mm; średnica wewnętrzna 0,09 mm; długość 54 mm)</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do igieł szklanych</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki monomer alfa-synukleiny do generowania wstępnie uformowanych włókienek</td><td>Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>Mysi monomer alfa-synukleiny do generowania wstępnie uformowanych włókien</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowa medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,021 cala)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>końcówką</td> <td>Qsonica 3,2 mmQsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator Qsonica Q125</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Tioflawina S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Tioflawina T</td><td>EMD Milipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor Chromogenny zestaw do oznaczania endotoksyn LAL Genscript</td><td></td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Wykorzystanie modelu in vivo synukleinopatii z fibrylu alfa-synukleiny (α-syn PFF) zyskuje na popularności wśród badaczy dążących do modelowania synukleinopatii choroby Parkinsona i zwyrodnienia nigrostriatalnej. Standaryzacja generowania α-syn PFF i aplikacji in vivo ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia spójnej, solidnej patologii α-syn. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania włókienek z monomerycznej α-syn, etapy kontroli jakości po fibrylacji oraz sugerowane parametry skutecznego neurochirurgicznego wstrzykiwania α-syn PFF szczurom lub myszom. Począwszy od monomerycznej α-syn, fibrylacja zachodzi w ciągu 7-dniowego okresu inkubacji podczas wstrząsania w optymalnych warunkach buforowych, stężeniu i temperaturze. Kontrola jakości po fibrylacji jest oceniana na podstawie obecności włókienek granulowanych za pomocą testu sedymentacji, tworzenia konformacji amyloidu w włókienkach za pomocą testu tioflawiny T oraz wizualizacji włókienek pod mikroskopem elektronowym. Podczas gdy pomyślna walidacja przy użyciu tych testów jest niezbędna do osiągnięcia sukcesu, nie są one wystarczające, aby zagwarantować, że PFF zapoczątkują inkluzje α-syn w neuronach, ponieważ taka aktywność agregacji każdej partii PFF powinna być testowana w hodowli komórkowej lub w kohortach zwierząt pilotażowych. Przed użyciem PFF muszą zostać poddane sonikacji w ściśle znormalizowanych warunkach, a następnie badaniom za pomocą mikroskopii elektronowej lub dynamicznego rozpraszania światła, aby potwierdzić, że długości włókien mieszczą się w optymalnym zakresie wielkości, przy średniej długości 50 nm. PFF mogą być następnie dodawane do pożywek do hodowli komórkowych lub stosowane u zwierząt. Patologia wykrywalna przez barwienie immunologiczne dla fosforylowanego α-syn (psyn; seryna 129) jest widoczna kilka dni lub tygodni później odpowiednio w hodowlach komórkowych i modelach gryzoni.

Generowanie włókien z monomerów α-syn rozpoczyna się od oznaczenia stężenia monomerów. Do pomiaru zawartości białka można zastosować zarówno test BCA, jak i pomiar absorbancji przy 280 nm (A280); jednak wyniki testu BCA sugerowały wyższe stężenie niż metoda A280. PFF pochodzące z mysiego monomeru α-syn miały wartość BCA wynoszącą 14,05 ± 0,2 oraz A280 wynoszącą 8,05 ± 0,03 µg/µL (Rysunek 1). Podobnie PFF pochodzące z ludzkiego monomeru α-syn również wydawały się mieć wyższe stężenie, z wartością BCA 12,95 ± 0,38 i A280 7,83 ± 0,05 µg/µL (Rysunek 1). Pomiary A280 są specyficzne dla α-syn dzięki uwzględnieniu współczynników ekstynkcji i to te wyniki wykorzystano do rozcieńczenia monomerów przed 7-dniową inkubacją.
Przed inkubacją ciecz zawierająca monomery α-syn była klarowna, jednak po wytworzeniu się fibryl powinna stać się mętna. Badanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej potwierdziło obecność długich fibryli o szerokości 10-20 nm (Rycina 4). W porównaniu z nimi monomery α-syn były ledwo widoczne i nie posiadały wyraźnego kształtu (Rycina 4). Po wizualnym potwierdzeniu struktur włóknistych kolejnym parametrem PFF, który należy potwierdzić, jest amyloidna konformacja fibryli, co wykonuje się za pomocą testu z tioflawiną T. Tioflawina T wykazuje wzmocnioną fluorescencję po związaniu z amyloidem, zatem zwiększony sygnał fluorescencyjny z próbek wskazuje na obecność amyloidu. Przykładowo, tioflawina w dPBS wygenerowała sygnał 3 287 ± 580 względnych jednostek fluorescencji (RFU), monomer α-syn mysi wygenerował sygnał 4 174 ± 158 RFU, a mysie PFF wygenerowały sygnał 59 754 ± 6 24 RFU (Rycina 5). Dla porównania, ludzki monomer α-syn wygenerował podobny sygnał co monomer mysi, wynoszący 4 158 ± 105 RFU, natomiast ludzkie PFF wygenerowały wyższy sygnał 1 235 967 ± 13 747 RFU w porównaniu do mysich PFF (Rycina 5). Aby ocenić obecność fibryli zdolnych do sedymentacji, przeprowadzono test sedymentacyjny. Fibryle osadzają się podczas wirowania. W próbkach mysich i ludzkich PFF w frakcji nadosadu powinno znajdować się więcej białka w osadzie niż w nadosadzie (Rycina 6). W przeciwieństwie do tego, większość białka z mysich i ludzkich monomerów znajdowała się w nadosadzie, przy niewielkiej ilości w osadzie (Rycina 6). Dzięki wizualnemu potwierdzeniu obecności PFF w mikroskopii elektronowej, stwierdzeniu struktur amyloidowych oraz zdolności fibryli do sedymentacji, PFF przeszły wszystkie etapy kontroli jakości in vitro.
Zarówno mysie, jak i ludzkie PFF poddano sonikacji, aby uzyskać włókna o odpowiedniej długości do inicjowania powstawania inkluzji α-syn4,18. PFF rozcieńczono do pożądanego stężenia 4 µg/µL i poddano sonikacji. Bezpośrednio przed zabiegiem wykonano obrazowanie 25 reprezentatywnych fibryl za pomocą mikroskopii elektronowej i zmierzono je w celu doraźnej kontroli rozmiaru włókien. Sonikowane mysie PFF miały długość 48,8 ± 3,1 nm, natomiast ludzkie PFF miały długość 52,1 ± 4,4 nm; zatem PFF obu gatunków miały odpowiednią długość (50 nm lub mniej), aby wywołać aktywność zasiewania. Bardziej szczegółowa analiza około 500 fibryl pozwoliła określić średnią długość i rozkład długości sonikowanych włókien mysich. Średnia długość wynosiła 4,4 ± 0,6 nm, przy czym 86,6% PFF miało długość 60 nm lub mniej (Rysunek 4). W porównaniu z nimi ludzkie PFF miały średnią długość 5,9 ± 1,1 nm, a 69,6% PFF miało długość 60 nm lub mniej (Rysunek 4).
Po wewnątrzprążkowym wstrzyknięciu sonikowanych mysich PFF do organizmów szczurów, zgodnie z wcześniejszym opisem3,5, seria przekrojów tkanek została poddana obróbce 2 miesiące po zabiegu, kiedy liczba neuronów zawierających inkluzje w SNpc zazwyczaj osiąga szczyt, w celu potwierdzenia obecności inkluzji fosforylowanego α-syn5. Neurony z inkluzjami, wskazane przez barwienie immunohistochemiczne na pSyn (przeciwciało w Tabeli Materiałów), występują w SNpc (Rycina 7), a także w innych obszarach mózgu unerwiających prążkowie (jądro węchowe przednie, kora ruchowa, obręża, piriformowa, przedlimbiczna, somatosensoryczna, entorynalna i wyspowa, ciało migdałowate, prążkowie)1,3,4,5,19. Inkluzje te wykazują właściwości podobne do ciał Lewy'ego, takie jak wiązanie tioflawiny S oraz oporność całkowitego α-syn na proteinazę K (Rycina 7), co wykazano w barwieniu immunohistochemicznym (przeciwciało i proteinaza K w Tabeli Materiałów). Potwierdzenie siewania wewnątrz mózgu wskazuje na pomyślną kontrolę jakości in vivo, co pozwala na sonikację z tą samą partii wcześniej zamrożonych i zachowanych aliquotów PFF przy identycznych parametrach, z walidacją długości, w większych eksperymentach.
<img alt="Oznaczanie stężenia białka za pomocą wirowania, testu BCA, mieszania wstrząsarzu i inkubacji; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Metody generowania fibryli α-syn. Schemat kroków niezbędnych do otrzymania włókien z monomerów α-syn. Monomery są wirowane przez 10 min (15 0 x g, w 4 °C). Nadpływ przenosi się do czystej probówki, a stężenie białka określa się poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm lub za pomocą testu BCA. Wykres przedstawia stężenia monomerów α-syn ludzkich i mysich. Słupki wskazują średnie grupowe, a słupki błędów reprezentują ±1 błąd standardowy średniej. Po określeniu stężenia białka monomery α-syn rozcieńcza się, krótko miesza w wortexie i inkubuje przez 37 °C przez 7 dni, podczas mieszania na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 10 obr./min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat przenoszenia siatek z etapami użycia octanu uranylu i wody; przedstawia porównanie strony matowej i błyszczącej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Metody barwienia w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Schemat barwienia negatywowego do mikroskopii elektronowej. A) Zdjęcia przedstawiające siatki do preparatów do mikroskopii elektronowej. Siatka posiada stronę matową lub jasną oraz stronę błyszczącą lub ciemną. Strona błyszcząca/ciemna jest pokryta wspierającą warstwą filmu z formvaru i węgla. B) Ilustracja procedury barwienia. Siatkę nanosi się błyszczącą/ciemną stroną dołu na pierwszą kroplę ddH2przez 1 min, a nadmiar jest odsączany za pomocą papieru filtracyjnego. Proces powtarza się z drugą kroplą ddH2O.2O, rozcieńczone PFF lub monomery, dwie krople octanu uranylu oraz dwie dodatkowe krople ddH2O2Siatki można przechowywać w pudełku do siatek do momentu obrazowania. Pasek skali = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces uszczelniania szklanej rurki kapilarnej za pomocą rurek termokurczliwych; schemat krok po kroku z pomiarami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Montaż szklanych strzykawek z igłami wykonanymi na zamówienie. Schemat kroków niezbędnych do montażu strzykawek z przymocowaną szklaną igłą. Silikonizowane szklane kapilary są rozciągane i przecinane w połowie, aby uzyskać szklane igły. Tubing termokurczliwy jest wykorzystywany do przygotowania metalowej igły i utworzenia wewnętrznej uszczelki podczas nasuwania szklanej igły na igłę metalową. Następnie dodaje się kolejne dwie warstwy tubingu termokurczliwego, które nakładają się na podstawę szklanej igły i igłę metalową, a następnie stosuje się obróbkę termiczną w celu zabezpieczenia szklanej igły i utworzenia wodoszczelnego uszczelnienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa; monomer, PFF, sonikowane PFF; wykres rozkładu długości; włókna białkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Wizualizacja monomerów α-syn i α-syn fibryle za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Reprezentatywne mikrografie monomerów i włókien α-syn. Panele górne: monomery α-syn mysie i ludzkie. Panele środkowe: pełnowymiarowe PFF α-syn mysie i ludzkie. Panele dolne: PFF α-syn mysie i ludzkie po sonikacji. Wykres dolny: rozkład długości sonikowanych PFF α-syn mysich i ludzkich. Pasek skali = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres testu z tioflawiną T: fluorescencja (RFU); mysz, człowiek; PFF vs. dPBS, monomer." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5Potwierdzenie struktur amyloidowych za pomocą testu z tioflawiną T. Pomiar sygnału fluorescencyjnego w próbkach monomerów i PFF $\alpha$-synucleiny mysiej i ludzkiej. Po lewej: wyniki dla monomerów $\alpha$-syn i PFF $\alpha$-syn mysich. Po prawej: wyniki dla monomerów $\alpha$-syn i PFF $\alpha$-syn ludzkich. Na każdym wykresie przedstawiono ujemną kontrolę dPBS. Wszystkie pomiary wyrażono w względnych jednostkach fluorescencji (RFU). Słupki wskazują średnie grupowe, a słupki błędów reprezentują $\pm$1 błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Żel do analizy sedymentacyjnej, białka mysie i ludzkie; analiza monomerów i PFF; wyniki rozdziału białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6Analiza sedymentacyjna w celu oceny zdolności do tworzenia osadu α-syn. Obrazy żeli barwionych Coomassie. Widoczne prążki znajdują się na wysokości około 14 kDa w odniesieniu do drabinki białkowej. Po lewej: monomery i PFF mysie. Po prawej: monomery i PFF ludzkie. Dla wszystkich próbek monomerów i PFF przedstawiono resuspenderowany osad (P) oraz nadsącz (S). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="potwierdzenie patologii α-synukleiny, immunostaining, pSyn, tioflawina S, wyniki analizy białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rycina 7Cechy inkluzji w modelu szczura potwierdzające patologię α-syn. Reprezentatywne mikrografie z części zwartej istoty czarnej 2 miesiące po wstrzyknięciu. Lewo: Neurony zawierające pSyn, przeciwbarwione fioletem krezylowym. Środek: Neurony wykazujące pozytywną reakcję z tioflawiną S. Prawo: Ink grieving zawierające α-syn, odporne na proteinazę K. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Model fibryli preformowanych alfa-synukleiną jest używany przez laboratoria na całym świecie do badania synukleinopatii. Chociaż model ten jest z powodzeniem stosowany przez wiele laboratoriów, niektóre grupy doświadczyły niespójności w generowaniu włókienek i wytwarzaniu spójnej patologii alfa-synukleiny. Mamy nadzieję, że ten protokół, który szczegółowo opisuje generowanie włókienek z monomerów alfa-synukleiny i zastosowanie wstępnie uformowanych włókienek in vivo, może odpowiedzieć na pytania, które naukowcy mają na temat stosowania modelu.Model fibrylu preformowanego alfa-synukleiną podsumowuje kluczowe cechy choroby Parkinsona, takie jak patologia alfa-synukleiny i neurodegeneracja. Wykazano, że prowadzi to do umiarkowanych zaburzeń motorycznych w niektórych modelach zwierzęcych. Powstawanie inkluzji zawierających fosforylowaną alfa-synukleinę i wydłużony czas w kierunku neurodegeneracji oferuje naukowcom różne etapy w całej progresji synukleinopatii, do zbadania i ukierunkowania potencjalnych interwencji terapeutycznych.Demonstruje przygotowanie niestandardowych szklanych igieł nasz technik laboratoryjny, Christopher Kemp. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić monomery alfa-synukleiny na lodzie. Ponownie zawiesił rozmrożone monomery, delikatnie przesuwając rurkę.I odwirować w temperaturze 15 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie przenieś supernatant do czystej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i zapisz przeniesioną ilość. Rozcieńczyć monomery 1x dPBS do końcowego stężenia 5 mg na ml.Krótko zwirować, aby wymieszać i krótko odwirować, aby zebrać cały płyn na dnie probówki. Następnie użyj folii samoprzylepnej, aby zamknąć pokrywę probówki mikrowirówki. Umieść rurkę w orbitalnym mikserze termicznym z pokrywką na siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min.Po upływie siedmiu dni zawartość probówki powinna wydawać się mętna. Po pierwsze, załóż wszystkie niezbędne środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i osłonę twarzy. Następnie w kapturze do hodowli komórkowej podłącz sondę o średnicy 3,2 mm do konwertora.Ustaw amplitudę sonikatorów na 30% i pulsuj na jedną sekundę własną i jedną sekundę wyłączoną, a czas na jedną minutę. Rozmrozić włókienka w temperaturze pokojowej i jeszcze w kapturze hodowlanym rozcieńczyć włókienka sterylnym dPBS. Następnie zwilż tkankę laboratoryjną 70% etanolem i użyj jej do wytarcia sondy sonikatora, aby ją wyczyścić.Zanurz końcówkę sondy w podwójnie destylowanej wodzie i naciśnij impuls 10 razy, aby jeszcze bardziej wyczyścić sondę. Następnie wytrzyj sondę do sucha chusteczką laboratoryjną. Umieść oczyszczoną końcówkę sondy w probówce z rozcieńczonymi włókienkami i umieść końcówkę na dnie probówki.Sonikuj rozcieńczone fibryle przy użyciu wcześniej ustawionych parametrów, przesuwając sondę w górę iw dół podczas każdego impulsu, aby upewnić się, że wszystkie fibryle w cieczy są sonikowane. Po sonikacji należy krótko odwirować przez jedną sekundę przy 2 000 g, aby zebrać cały płyn z boków probówki. Zanurz końcówkę sondy w 1% SDS i naciśnij impuls 10 razy, aby wyczyścić sondę.Następnie wyjmij końcówkę z SDS i zanurz ją w podwójnie destylowanej wodzie i pulsuj 10 razy. Przetrzyj sondę chusteczką laboratoryjną zwilżoną 70% etanolem i wytrzyj ją do sucha suchą chusteczką laboratoryjną. Odłącz sondę od konwertera i schowaj.Następnie przetrzyj wszystkie powierzchnie w masce 1% SDS, a następnie 70% etanolem. Aby rozpocząć, umieść silikonowaną szklaną rurkę kapilarną w szklanym ściągaczu do igieł. Włącz element grzejny i pozwól, aby dołączone ciężarki rozciągnęły rozgrzaną szklaną rurkę kapilarną.Następnie za pomocą nożyczek przeciąć wyciągniętą szklaną rurkę kapilarną w najcieńszym miejscu pośrodku i wyjmij szklaną igłę ze ściągacza szklanych igieł. Następnie za pomocą nożyczek przyciąć rurkę z folii termokurczliwej do około 40 mm. Nasuń folię termokurczliwą na metalową igłę strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów.Użyj otwartego ognia do podgrzania i przyklej folię termokurczliwą do igły, jednocześnie obracając igłę, aby równomiernie rozgrzać ciepło. Ostrożnie nasunąć większy koniec wyciągniętej szklanej igły na metalową igłę strzykawki. Następnie przyciąć rurkę z folią termokurczliwą na około 40 mm i ostrożnie nasunąć ją na szklaną igłę, tak aby zachodziła na podstawę szklanej igły i metalową igłę strzykawki.Użyj otwartego ognia do podgrzania folii termokurczliwej, aby przymocować szklaną igłę do metalowej igły. Aby dodatkowo zabezpieczyć igłę i zapobiec potencjalnym wyciekom, przyciąć dodatkową długość rurki z folii termokurczliwej do około 40 mm i ostrożnie nasunąć ją na szklaną igłę, tak aby zachodziła na podstawę szklanej igły i metalową igłę strzykawki. Użyj otwartego ognia do podgrzania folii termokurczliwej, aby przymocować szklaną igłę do metalowej igły.Następnie za pomocą nożyczek przyciąć szklaną igłę tak, aby końcówka miała około 8 mm długości. Aby przetestować igłę, napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml dołączoną igłą o rozmiarze 26 wodą destylowaną. Wyjąć metalowy tłok z niestandardowej strzykawki ze szklaną igłą i włożyć igłę strzykawki wypełnionej wodą do podstawy niestandardowej strzykawki.Sprawdzić powierzchnię styku szklanej igły i metalowej igły pod kątem wycieków i potwierdzić stały przepływ wody. Następnie napełnij probówkę mikrowirówki wodą destylowaną. Użyj niestandardowej strzykawki ze szklaną igłą, aby pobrać wodę destylowaną.Sprawdzić igłę, aby upewnić się, że płyn jest pobierany do strzykawki i czy nie ma pęcherzyków. Jeśli występują bąbelki lub jeśli woda nie jest wciągana do igły, przycinanie igły może pomóc złagodzić ciśnienie. Następnie ostrożnie przechowuj strzykawkę z dołączonymi szklanymi igłami w pudełkach na strzykawki, dopóki nie będzie potrzebna do operacji.Badanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej potwierdza obecność długich włókienek. Dla porównania, monomery alfa-synukleiny są widoczne z jęczmienia i nie mają dostrzegalnego kształtu. Analoidalne potwierdzenie włókienek jest następnie potwierdzane za pomocą testu tioflawiny T.Reprezentatywny test pokazuje, że monomery dPBS i myszy wytwarzają niższy sygnał we względnych jednostkach fluoru w porównaniu z mysimi PFF. Ludzki monomer alfa-synukleiny wytwarza podobny sygnał do monomeru myszy. Podczas gdy ludzkie PFF również wytwarzają wyższy sygnał niż monomery.Aby ocenić obecność włókienek pelitowalnych, przeprowadza się test sedymentacji. Zarówno w mysich, jak i ludzkich próbkach PFF, naruszenie supernatu powinno mieć więcej białka w osadzie niż supernatant. W przeciwieństwie do tego, większość białka z monomerów myszy i ludzi jest obecna w supernatancie, a niewielka ilość w osadzie.Zarówno mysie, jak i ludzkie PFF są sonikowane w celu wytworzenia PFF o odpowiedniej długości do wysiewu inkluzji alfa synukleiny. Kompleksowe badanie około 500 włókienek ujawnia, że średnia długość włókienek myszy wynosi około 44 nanometrów. Z czego 86,6% PFF mierzy 60 nanometrów lub mniej.Ludzkie PFF mają jednak średnią długość około 55,9 nanometrów, przy czym 69,6% PFF mierzy 60 nanometrów lub mniej. Badanie in vivo skuteczności PFF potwierdza się za pomocą immunohistochemii. Inkluzje utworzone w istocie czarnej mają podobne właściwości do ciał Lewy'ego, ponieważ zawierają fosforylowaną alfa synukleinę, zawierają struktury aminelizowane i barwią się tioflawiną S oraz są odporne na trawienie proteinazy K.Sonikacja może wystawić osobę sonikującą na działanie wstępnie uformowanych włókienek w aerozolu. W związku z tym należy nosić odpowiedni strój ochronny, a sonikację wykonywać w kapturze, aby zminimalizować ryzyko narażenia.

generation-alpha-synuclein-preformed-fibrils-from-monomers-use

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny myszowi w celu wywołania zapalenia nerwów. Włókienka są wstrzykiwane dootrzewnowo transgenicznej myszy wykazującej ekspresję zmutowanych białek alfa-synukleiny. Po dotarciu do ośrodkowego układu nerwowego fibryle wnikają do neuronów i indukują agregację zmutowanych białek. Agregaty rozprzestrzeniają się na sąsiednie neurony, mikroglej i astrocyty. Rozpoznanie agregatów powoduje, że mikroglej indukuje zapalenie nerwów, uszkadzając neurony.

Indukcja zapalenia nerwów u myszy poprzez wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Obecny protokół opisuje metodę donosowego podawania agregatów α-synukleiny. Metoda ta dostarcza informacji na temat propagacji α-synukleiny z błony śluzowej węchu do opuszki węchowej w chorobie Parkinsona.

Technika donosowego podawania agregatów α-synukleiny

Poznaj protokół wytwarzania włókienek preformowanych alfa-synukleiny z monomerów i ich zastosowanie in vivo w modelach choroby Parkinsona. Metoda obejmuje kontrolę jakości i precyzyjną iniekcję neurochirurgiczną.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Przeglądaj więcej filmów