Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Model fibryli preformowanych alfa-synukleiną jest używany przez laboratoria na całym świecie do badania synukleinopatii. Chociaż model ten jest z powodzeniem stosowany przez wiele laboratoriów, niektóre grupy doświadczyły niespójności w generowaniu włókienek i wytwarzaniu spójnej patologii alfa-synukleiny. Mamy nadzieję, że ten protokół, który szczegółowo opisuje generowanie włókienek z monomerów alfa-synukleiny i zastosowanie wstępnie uformowanych włókienek in vivo, może odpowiedzieć na pytania, które naukowcy mają na temat stosowania modelu.

Model fibrylu preformowanego alfa-synukleiną podsumowuje kluczowe cechy choroby Parkinsona, takie jak patologia alfa-synukleiny i neurodegeneracja. Wykazano, że prowadzi to do umiarkowanych zaburzeń motorycznych w niektórych modelach zwierzęcych. Powstawanie inkluzji zawierających fosforylowaną alfa-synukleinę i wydłużony czas w kierunku neurodegeneracji oferuje naukowcom różne etapy w całej progresji synukleinopatii, do zbadania i ukierunkowania potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Demonstruje przygotowanie niestandardowych szklanych igieł nasz technik laboratoryjny, Christopher Kemp. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić monomery alfa-synukleiny na lodzie. Ponownie zawiesił rozmrożone monomery, delikatnie przesuwając rurkę.

I odwirować w temperaturze 15 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie przenieś supernatant do czystej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i zapisz przeniesioną ilość. Rozcieńczyć monomery 1x dPBS do końcowego stężenia 5 mg na ml.

Krótko zwirować, aby wymieszać i krótko odwirować, aby zebrać cały płyn na dnie probówki. Następnie użyj folii samoprzylepnej, aby zamknąć pokrywę probówki mikrowirówki. Umieść rurkę w orbitalnym mikserze termicznym z pokrywką na siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min.

Po upływie siedmiu dni zawartość probówki powinna wydawać się mętna. Po pierwsze, załóż wszystkie niezbędne środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i osłonę twarzy. Następnie w kapturze do hodowli komórkowej podłącz sondę o średnicy 3,2 mm do konwertora.

Ustaw amplitudę sonikatorów na 30% i pulsuj na jedną sekundę własną i jedną sekundę wyłączoną, a czas na jedną minutę. Rozmrozić włókienka w temperaturze pokojowej i jeszcze w kapturze hodowlanym rozcieńczyć włókienka sterylnym dPBS. Następnie zwilż tkankę laboratoryjną 70% etanolem i użyj jej do wytarcia sondy sonikatora, aby ją wyczyścić.

Zanurz końcówkę sondy w podwójnie destylowanej wodzie i naciśnij impuls 10 razy, aby jeszcze bardziej wyczyścić sondę. Następnie wytrzyj sondę do sucha chusteczką laboratoryjną. Umieść oczyszczoną końcówkę sondy w probówce z rozcieńczonymi włókienkami i umieść końcówkę na dnie probówki.

Sonikuj rozcieńczone fibryle przy użyciu wcześniej ustawionych parametrów, przesuwając sondę w górę iw dół podczas każdego impulsu, aby upewnić się, że wszystkie fibryle w cieczy są sonikowane. Po sonikacji należy krótko odwirować przez jedną sekundę przy 2 000 g, aby zebrać cały płyn z boków probówki. Zanurz końcówkę sondy w 1% SDS i naciśnij impuls 10 razy, aby wyczyścić sondę.

Następnie wyjmij końcówkę z SDS i zanurz ją w podwójnie destylowanej wodzie i pulsuj 10 razy. Przetrzyj sondę chusteczką laboratoryjną zwilżoną 70% etanolem i wytrzyj ją do sucha suchą chusteczką laboratoryjną. Odłącz sondę od konwertera i schowaj.

Następnie przetrzyj wszystkie powierzchnie w masce 1% SDS, a następnie 70% etanolem. Aby rozpocząć, umieść silikonowaną szklaną rurkę kapilarną w szklanym ściągaczu do igieł. Włącz element grzejny i pozwól, aby dołączone ciężarki rozciągnęły rozgrzaną szklaną rurkę kapilarną.

Następnie za pomocą nożyczek przeciąć wyciągniętą szklaną rurkę kapilarną w najcieńszym miejscu pośrodku i wyjmij szklaną igłę ze ściągacza szklanych igieł. Następnie za pomocą nożyczek przyciąć rurkę z folii termokurczliwej do około 40 mm. Nasuń folię termokurczliwą na metalową igłę strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów.

Użyj otwartego ognia do podgrzania i przyklej folię termokurczliwą do igły, jednocześnie obracając igłę, aby równomiernie rozgrzać ciepło. Ostrożnie nasunąć większy koniec wyciągniętej szklanej igły na metalową igłę strzykawki. Następnie przyciąć rurkę z folią termokurczliwą na około 40 mm i ostrożnie nasunąć ją na szklaną igłę, tak aby zachodziła na podstawę szklanej igły i metalową igłę strzykawki.

Użyj otwartego ognia do podgrzania folii termokurczliwej, aby przymocować szklaną igłę do metalowej igły. Aby dodatkowo zabezpieczyć igłę i zapobiec potencjalnym wyciekom, przyciąć dodatkową długość rurki z folii termokurczliwej do około 40 mm i ostrożnie nasunąć ją na szklaną igłę, tak aby zachodziła na podstawę szklanej igły i metalową igłę strzykawki. Użyj otwartego ognia do podgrzania folii termokurczliwej, aby przymocować szklaną igłę do metalowej igły.

Następnie za pomocą nożyczek przyciąć szklaną igłę tak, aby końcówka miała około 8 mm długości. Aby przetestować igłę, napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml dołączoną igłą o rozmiarze 26 wodą destylowaną. Wyjąć metalowy tłok z niestandardowej strzykawki ze szklaną igłą i włożyć igłę strzykawki wypełnionej wodą do podstawy niestandardowej strzykawki.

Sprawdzić powierzchnię styku szklanej igły i metalowej igły pod kątem wycieków i potwierdzić stały przepływ wody. Następnie napełnij probówkę mikrowirówki wodą destylowaną. Użyj niestandardowej strzykawki ze szklaną igłą, aby pobrać wodę destylowaną.

Sprawdzić igłę, aby upewnić się, że płyn jest pobierany do strzykawki i czy nie ma pęcherzyków. Jeśli występują bąbelki lub jeśli woda nie jest wciągana do igły, przycinanie igły może pomóc złagodzić ciśnienie. Następnie ostrożnie przechowuj strzykawkę z dołączonymi szklanymi igłami w pudełkach na strzykawki, dopóki nie będzie potrzebna do operacji.

Badanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej potwierdza obecność długich włókienek. Dla porównania, monomery alfa-synukleiny są widoczne z jęczmienia i nie mają dostrzegalnego kształtu. Analoidalne potwierdzenie włókienek jest następnie potwierdzane za pomocą testu tioflawiny T.

Reprezentatywny test pokazuje, że monomery dPBS i myszy wytwarzają niższy sygnał we względnych jednostkach fluoru w porównaniu z mysimi PFF. Ludzki monomer alfa-synukleiny wytwarza podobny sygnał do monomeru myszy. Podczas gdy ludzkie PFF również wytwarzają wyższy sygnał niż monomery.

Aby ocenić obecność włókienek pelitowalnych, przeprowadza się test sedymentacji. Zarówno w mysich, jak i ludzkich próbkach PFF, naruszenie supernatu powinno mieć więcej białka w osadzie niż supernatant. W przeciwieństwie do tego, większość białka z monomerów myszy i ludzi jest obecna w supernatancie, a niewielka ilość w osadzie.

Zarówno mysie, jak i ludzkie PFF są sonikowane w celu wytworzenia PFF o odpowiedniej długości do wysiewu inkluzji alfa synukleiny. Kompleksowe badanie około 500 włókienek ujawnia, że średnia długość włókienek myszy wynosi około 44 nanometrów. Z czego 86,6% PFF mierzy 60 nanometrów lub mniej.

Ludzkie PFF mają jednak średnią długość około 55,9 nanometrów, przy czym 69,6% PFF mierzy 60 nanometrów lub mniej. Badanie in vivo skuteczności PFF potwierdza się za pomocą immunohistochemii. Inkluzje utworzone w istocie czarnej mają podobne właściwości do ciał Lewy'ego, ponieważ zawierają fosforylowaną alfa synukleinę, zawierają struktury aminelizowane i barwią się tioflawiną S oraz są odporne na trawienie proteinazy K.

Sonikacja może wystawić osobę sonikującą na działanie wstępnie uformowanych włókienek w aerozolu. W związku z tym należy nosić odpowiedni strój ochronny, a sonikację wykonywać w kapturze, aby zminimalizować ryzyko narażenia.