Name: Znakowanie naczyń krwionośnych w mózgu teleostowym i przysadce mózgowej za pomocą perfuzji serca z utrwalaczem DiI (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Poznaj metodę znakowania naczyń krwionośnych w mózgu i przysadce mózgowej ryb teleostów za pomocą perfuzji serca z utrwalaczem DiI. Technika ta jest szybka, prosta i adaptowalna do różnych gatunków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Shinji Kanda za demonstrację perfuzji serca za pomocą roztworu utrwalającego w medace, Pani Lourdes Carreon G Tan za pomoc w hodowli medaka oraz Panu Anthony'emu Peltierowi za ilustracje. Praca ta została sfinansowana przez NMBU oraz Norweską Radę ds. Badań Naukowych, grant nr 248828 (program Digital Life Norway).

Wszystkie czynności związane ze zwierzętami były wykonywane zgodnie z zaleceniami dotyczącymi opieki i dobrostanu zwierząt badawczych na Norweskim Uniwersytecie Nauk Przyrodniczych oraz pod nadzorem uprawnionych badaczy.
1. Przygotowanie instrumentów i roztworów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy DiI, rozpuszczając 5 mg kryształu DiI w plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml z 1 ml 96 % EtOH. Wiruj przez 30 s i przykryj folią aluminiową. 
	nuta: Roztwór podstawowy DiI można przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj uchwyt na ryby (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), przycinając kawałek styropianu do 5 cm długości, 3 cm szerokości i 2 cm grubości, a następnie przyklejając go do plastikowego naczynia o średnicy 9 cm. Wykonaj 3 cm otwór w kształcie łódki za pomocą ostrza skalpela w styropianie.</li>
	<li>Przygotuj system perfusingowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), dodając plastikową kaniulę o długości 30-50 cm na końcu igły.</li>
	<li>Przygotuj 40 ml świeżego 4% roztworu paraformaldehydu (PFA), rozcieńczając 10 ml 16% PFA 30 ml buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS) w plastikowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przygotować 10 ml roztworu utrwalającego/DiI, rozcieńczając 1 ml roztworu podstawowego DiI w 9 ml świeżo przygotowanego 4% PFA w plastikowej probówce o pojemności 10 ml. Przechowywać w ciemności do momentu użycia. 
	nuta: Kryształy DiI, które nie są rozpuszczone, mogą być przechowywane w probówce z roztworem podstawowym, a nowy etanol może być dodany w celu przygotowania nowego roztworu podstawowego DiI (patrz krok 1.1).</li>
	<li>Przygotuj 50 ml bulionu z tricainą (MS-222).
	<ol>
		<li>Rozpuścić 200 mg proszku trikainy w 48 mlH2O. Dodać 2 ml 1 M zasady Tris (pH 9). Doprowadzić do pH 7 za pomocą 1 M HCl i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć 5 ml bulionu Trikainy w 50 ml czystej wody w małej szklance.</li>
	<li>Przygotuj kilka pipet szklanych o średnicy 5 cm (<klasa mocna="xfig">Rysunek 2), rozciągając szklaną kapilarnę za pomocą ściągacza do pipet, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie i perfuzja
UWAGA: PFA jest toksycznym związkiem lotnym, dlatego sekcja i perfuzja powinny być wykonywane w kapturze lub w wentylowanym pomieszczeniu, a użytkownik musi mieć na sobie maskę przeciwgazową.
<ol>
	<li>Przed sekcją przygotuj narzędzia do preparowania, w tym małe nożyczki oraz jeden ostry i jeden mocny kleszcz.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę przygotowanym roztworem PFA/DiI, umieszczając go w probówce o pojemności 50 ml i pobierając. Następnie umieść igłę z kaniulą na końcu strzykawki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Przymocuj strzykawkę do stołu za pomocą kilku kawałków taśmy umieszczonych w różnych kierunkach, wyreguluj położenie mikroskopu i gniazda, aby uzyskać dobrą pozycję do wypreparowania i naciśnięcia tłoka strzykawki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). 
	nuta: W tym protokole łokieć służy do dociskania tłoka strzykawki, ale można skorzystać z innych możliwości, np. pomocy innej osoby.</li>
	<li>Poddaj rybę eutanazji z przedawkowaniem tricainy, umieszczając rybę w roztworze przygotowanym w kroku 1.7. Odczekaj 30 s i przetestuj odruchy ryby, chwytając kleszczami za płetwę ogonową. Ryba może być używana, gdy przestała reagować na bodźce.</li>
	<li>Umieść rybę w uchwycie na ryby brzuchem skierowanym do góry i wbij jedną igłę w koniec głowy, a drugą nad ogonem, aby utrzymać rybę na miejscu.</li>
	<li>Otwórz przednią część brzucha nożyczkami, przecinając poziomo powierzchowną warstwę skóry.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń skórę nad sercem, aż zapewniony zostanie swobodny dostęp do komory i opuszki tętniczej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).</li>
	<li>Dodaj szklaną pipetę na końcu kapilary i odłam koniec końcówki szklanej pipety. 
	nuta: Otwór w złamanej końcówce powinien być wystarczająco duży, aby wypuścić płyn, ale nadal wystarczająco mały, aby łatwo dostać się do tkanki. Szklana pipeta może być ponownie użyta, jeśli nie jest pęknięta lub zatkana.</li>
	<li>Zbliżyć szklaną pipetę do komory i zwiększyć ciśnienie w tłoku strzykawki za pomocą kolanka, aby wypchnąć płyn.</li>
	<li>Przypiąć komorę serca szklaną pipetą, jednocześnie zwiększając ciśnienie w strzykawce.</li>
	<li>Bezpośrednio po tym należy przebić zatokę żylną kleszczami, aby krew mogła opuścić krążenie. 
	nuta: Komora serca staje się bardziej krucha z powodu utrwalacza. Staje się również mniej czerwony, gdy krew jest rozcieńczana roztworem utrwalacza/DiI.</li>
	<li>Z komory wyreguluj kąt szklanej pipety, aby znaleźć wejście do bulbus arteriosus. Umieść otwór pipety w tętnicy opuszki, jak pokazano na rysunku Rysunek 2, i zwiększ nacisk na strzykawkę. 
	nuta: Bulbus arteriosus jest przezroczysty, a tkanka elastyczna. Po zastąpieniu krwi DiI/utrwalaczem, szklana pipeta wewnątrz serca powinna stać się bardziej widoczna, a poprzez zwiększenie nacisku rozmiar opuszki tętniczej powinien się rozszerzyć. Ten krok jest kluczowy, aby upewnić się, że zastosowano wystarczające ciśnienie, aby zastąpić całą krew roztworem utrwalającym/DiI i że wszystkie naczynia krwionośne zostały osiągnięte. Często, gdy się powiedzie, PFA wywołuje skurcze mięśni, a ryba będzie się poruszać.</li>
	<li>Kontynuuj wywieranie nacisku na strzykawkę przez 30-60 sekund, nadal trzymając szklaną pipetę wewnątrz opuszki tętniczej.</li>
	<li>Wyjmij szklaną pipetę i igły z ryby.</li>
	<li>Wypreparuj mózg i przysadkę mózgową i inkubuj tkanki w świeżym 4% PFA w PBS przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Sekcja mózgu i przysadki mózgowej została wcześniej szczegółowo opisana na dwa różne sposoby przez Fontaine'a i wsp.26 oraz Ager-Wick et al.27. Z powodu fiksacji, tkanka staje się dość twarda, a kruche połączenie między mózgiem a przysadką może zostać przerwane. Po rozbiorze można również przeprowadzić obróbkę po utrwaleniu przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Płukać tkankę dwukrotnie w PBS przez 10 minut przed przygotowaniem do obrazowania. 
	nuta: Tkanka może być następnie zamontowana między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym z przekładkami pomiędzy nimi i podłożem montażowym do obrazowania konfokalnego (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 4) lub podzielona za pomocą wibratomu, jak opisano szczegółowo w Fontaine et al.26 przed zamontowaniem między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym w celu obrazowania za pomocą mikroskopu stereoskopowego (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
</ol>

<ol><li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Health+and+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li>
<li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li>
<li>Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagistretti%2C+PJ+%22Brain+energy+metabolism+in+Fundamental+neuroscience%22">Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience</a>. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).</li>
<li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts%2C+with+special+emphasis+on+flatfish+%28Pleuronectiformes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li>
<li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li>
<li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+median+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li>
<li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes%2C+amphibians%2C+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22General+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168(1965).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li>
<li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li>
<li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li>
<li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li>
<li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li>
<li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li>
<li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li>
<li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetone%2C+methanol%2C+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure%2C+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka--a+model+organism+from+the+far+East%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetic%22%5BJournal%5D)">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li>
<li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790(2018).</li>
<li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159(2018).</li>
<li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29+reveals+a+putative+novel+developmental+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li>
<li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions%3A+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Perfuzja serca za pomocą DiI była wcześniej używana do oznaczania naczyń krwionośnych u kilku gatunków modelowych24, w tym ryb teleost13.
Ponieważ DiI jest bezpośrednio dostarczane do błony komórkowej śródbłonka przez perfuzję w układzie krwionośnym, możliwe jest zwiększenie stosunku sygnału do szumu poprzez zwiększenie stężenia DiI w roztworze utrwalającym. Ponadto fluorofor zapewnia intensywne barwienie po wzbudzeniu przy minimalnym ...

Naczynia krwionośne odgrywają istotną rolę w organizmie kręgowców, ponieważ dostarczają niezbędnych składników odżywczych, tlenu i sygnałów hormonalnych do wszystkich organów. Ponadto, od czasu odkrycia ich udziału w rozwoju raka1, poświęcono im wiele uwagi w badaniach klinicznych. Chociaż w wielu publikacjach badano mechanizmy umożliwiające wzrost i morfogenezę naczyń krwionośnych oraz zidentyfikowano dużą liczbę genów ważnych dla ich powstawania2, wiele pozostaje do zrozumienia na temat interakcji między komórkami lub tkankami a krążącą krwią.
Wizualizacja układu krwionośnego w mózgu i przysadce mózgowej jest ważna. Neurony w mózgu wymagają dużego dopływu tlenu i glukozy3, a przysadka zawiera do ośmiu ważnych typów komórek produkujących hormony, które wykorzystują przepływ krwi do odbierania sygnałów z mózgu i wysyłania odpowiednich hormonów do różnych narządów obwodowych4,5. Podczas gdy u ssaków system portali u podstawy podwzgórza, zwany środkową wyniosłością, łączy mózg i przysadkę mózgową6, taki wyraźny most krwi nie został opisany u ryb teleost. Rzeczywiście, w teleostach neurony przedwzrokowo-podwzgórzowe bezpośrednio rzutują swoje aksony do pars nervosa przysadki mózgowej7 i głównie unerwiają bezpośrednio różne typy komórek endokrynnych8,9. Jednak niektóre z tych neuronów mają zakończenia nerwowe zlokalizowane w przestrzeni pozanaczyniowej, w bliskim sąsiedztwie naczyń włosowatych krwi10. Dlatego różnica między rybami teleostycznymi a ssakami nie jest tak wyraźna, a związek między naczyniami krwionośnymi a komórkami mózgu i przysadki mózgowej wymaga dokładniejszych badań u ryb teleostowych.
Danio pręgowany ma, pod wieloma względami, anatomicznie i funkcjonalnie porównywalny system naczyniowy do innych gatunków kręgowców11. Stał się potężnym modelem kręgowców do badań sercowo-naczyniowych, głównie dzięki rozwojowi kilku linii transgenicznych, w których składniki układu naczyniowego są znakowane fluorescencyjnymi białkami reporterowymi12. Jednak dokładna anatomia układu krążenia może się różnić w zależności od gatunku, a nawet między dwoma osobnikami należącymi do tego samego gatunku. W związku z tym wizualizacja naczyń krwionośnych może być bardzo interesująca również u innych gatunków teleostów, dla których nie istnieją narzędzia do transgenezy.
Opisano kilka technik oznaczania naczyń krwionośnych zarówno u ssaków, jak i u teleostów. Obejmują one hybrydyzację in situ dla genów specyficznych dla układu krwionośnego, barwienie fosfatazą alkaliczną, mikroangiografię i iniekcje barwnika (przegląd zobacz13). Fluorescencyjny lipofilowy kationowy barwnik indokarbocyjaninowy (DiI) został po raz pierwszy użyty do badania bocznej ruchliwości lipidów błonowych, ponieważ jest zatrzymywany w dwuwarstwach lipidowych i może przez nie migrować14,15,16. Rzeczywiście, cząsteczka DiI składa się z dwóch łańcuchów węglowodorowych i chromoforów. Podczas gdy łańcuchy węglowodorowe integrują się w dwuwarstwowej błonie komórkowej lipidów komórek stykających się z nią, chromofory pozostają na jej powierzchni17. Po dostaniu się do błony cząsteczki DiI dyfundują bocznie w dwuwarstwie lipidowej, co pomaga zabarwić struktury błonowe, które nie mają bezpośredniego kontaktu z roztworem DiI. Wstrzyknięcie roztworu DiI poprzez perfuzję serca spowoduje zatem oznakowanie wszystkich komórek śródbłonka mających kontakt ze związkiem, umożliwiając bezpośrednie znakowanie naczyń krwionośnych. Obecnie DiI jest również używany do innych celów barwienia, takich jak obrazowanie pojedynczych cząsteczek, mapowanie losu i śledzenie neuronów. Co ciekawe, istnieje kilka fluoroforów (o różnych długościach fal emisji) pozwalających na połączenie z innymi etykietami fluorescencyjnymi, a inkorporacja, jak również boczna dyfuzja DiI może zachodzić zarówno w żywych, jak i utrwalonych tkankach18,19.
Formaldehyd, odkryty przez Ferdinanda Bluma w 1893 roku, jest powszechnie stosowany do dnia dzisiejszego jako preferowana substancja chemiczna do utrwalania tkanek20,21. Wykazuje szeroką specyficzność dla większości celów komórkowych i zachowuje strukturę komórkową22,23. Zachowuje również właściwości fluorescencyjne większości fluoroforów, a zatem może być stosowany do utrwalania zwierząt transgenicznych, u których komórki docelowe wykazują ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych.
W tym manuskrypcie, poprzedni protokół opracowany do oznaczania naczyń krwionośnych w małych eksperymentalnych modelach ssaków24 został dostosowany do stosowania u ryb. Cała procedura trwa tylko kilka godzin. Pokazuje, jak perfaktorować utrwalający roztwór formaldehydu zawierający DiI w sercu ryby w celu bezpośredniego znakowania wszystkich naczyń krwionośnych w mózgu i przysadce mózgowej modelowej ryby. Medaka to mała ryba słodkowodna pochodząca z Azji, występująca głównie w Japonii. Jest to model badawczy organizmu z zestawem dostępnych narzędzi molekularnych i genetycznych25. Dlatego identyfikacja naczyń krwionośnych u tego gatunku, a także u innych, pozwoli lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki mózgu i przysadki mózgowej oddziałują z unaczynieniem krwi w całej tkance lub grubych warstwach tkanki.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Strzykawka PP/PE bez igły</td><td>Strzykawki</td><td>Sigma</td><td>Z116866-100EA</td></tr><tr><td>Igły strzykawkowe BD Precisionglide</td> Igły <td>Sigma</td><td>Z118044-100EA</td><td>18G (1,20*40)</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe 10 cm OD 1,2 mm</td><td>Sutter Pipeta</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>szklana BF120-94-10DiI (1,1&prime;-dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;,-tetramethylindocarbocyjanine'perate)</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>LDPE rurka OD 1,7 mm i ID 1,1 mm</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td>canula</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy roztwór soli fizjologicznej (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>Super klej</td><td>żelowy loctite</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina (ms-222)</td><td>sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie naczyń krwionośnych w mózgu teleostowym i przysadce mózgowej za pomocą perfuzji serca z utrwalaczem dii

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Naczynia krwionośne unerwiają wszystkie tkanki kręgowców, umożliwiając im przetrwanie poprzez dostarczanie niezbędnych składników odżywczych, tlenu i sygnałów hormonalnych. Jest to jeden z pierwszych narządów, który zaczyna funkcjonować w trakcie rozwoju. Mechanizmy powstawania naczyń krwionośnych stały się przedmiotem dużego zainteresowania naukowego i klinicznego. Jednak u dorosłych trudno jest uwidocznić układ naczyniowy u większości żyjących zwierząt ze względu na ich lokalizację głęboko w innych tkankach. Niemniej jednak wizualizacja naczyń krwionośnych pozostaje ważna dla kilku badań, takich jak endokrynologia i neurobiologia. Podczas gdy u danio pręgowanego opracowano kilka linii transgenicznych, których naczynia krwionośne są bezpośrednio uwidocznione poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych, takie narzędzia nie istnieją dla innych gatunków teleostów. Wykorzystując medaka (Oryzias latipes) jako model, obecny protokół przedstawia szybką i bezpośrednią technikę oznaczania naczyń krwionośnych w mózgu i przysadce mózgowej poprzez przenikanie przez serce za pomocą utrwalacza zawierającego DiI. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki mózgu i przysadki mózgowej oddziałują z naczyniem krwi w całej tkance lub grubych warstwach tkanki.

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę znakowania naczyń krwionośnych w mózgu i przysadce ryby medaka przy jednoczesnej fiksacji tkanki. Po znakowaniu poprzez wstrzyknięcie do serca roztworu fiksacyjnego zawierającego DiI, naczynia krwionośne można obserwować na skrawkach za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu (Rycina 4) lub w całej tkance za pomocą mikroskopu konfokalnego (Rycina 5). Zarówno na grubych skrawkach tkankowych, jak i w całej tka...

Artykuł opisuje szybki protokół oznaczania naczyń krwionośnych u ryby teleost za pomocą perfuzji serca DiI rozcieńczonego w utrwalacza, używając medaka (Oryzias latipes) jako modelu i skupiając się na tkance mózgu i przysadki mózgowej.

Znakowanie naczyń krwionośnych w mózgu teleostowym i przysadce mózgowej za pomocą perfuzji serca z utrwalaczem DiI

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Ogólnym celem tej procedury jest oznaczenie naczyń krwionośnych w mózgu i przysadce mózgowej ryb teleost, a my używamy perfuzji serca z utrwalaczem zawierającym DiI w modelowym gatunku medaka. Tak więc ta technika, która jest prosta i skuteczna, pomoże odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące anatomii naczyń krwionośnych w mózgu i przysadce mózgowej ryb teleost, a także związku między neuronami lub komórkami endokrynnymi a naczyniami krwionośnymi. Niektóre zalety tej techniki to szybkie i łatwe przygotowanie oraz zdolność adaptacji do gatunków ryb teleost.Aby przygotować uchwyt na ryby, przytnij kawałek styropianu na długość pięciu centymetrów, szerokość trzech centymetrów i grubość dwóch centymetrów, a następnie przyklej polistyren do plastikowego naczynia o średnicy dziewięciu centymetrów. Następnie za pomocą skalpela wykonaj w styropianie trzycentymetrowy otwór w kształcie łódki. Aby przygotować system perfuzyjny, dodaj plastikową kaniulę o długości od 30 do 50 centymetrów na końcu igły systemu perfuzyjnego.Aby przygotować pięciocentymetrowe szklane pipety, użyj ściągacza do pipet, aby rozciągnąć poszczególne szklane kapilary zgodnie z instrukcjami producenta. Przed rozpoczęciem sekcji należy załadować strzykawkę o pojemności 10 mililitrów przygotowanym roztworem utrwalającym DiI i umieścić igłę z kaniulą na końcu strzykawki. Następnie użyj kilku kawałków taśmy umieszczonych w różnych orientacjach, aby przymocować strzykawkę do stołu i wyreguluj położenie mikroskopu i gniazda, aby uzyskać dobrą pozycję do wypreparowania i dociśnięcia tłoka strzykawki łokciem.Następnie umieść uśpioną rybę w uchwycie na ryby brzuchem do góry i zabezpiecz głowę i ogon szpilkami. Użyj nożyczek, aby poziomo przeciąć powierzchowną warstwę skóry, aby otworzyć przedni brzuch, i użyj kleszczy, aby usunąć skórę nad sercem, aż do uzyskania wyraźnego dostępu do komory i opuszki tętniczej. Dodaj szklaną rurkę na końcu kapilary i odłam końcówkę pipety.Przyłóż szklaną rurkę do komory i zwiększ nacisk łokciem na tłok strzykawki, aby wypchnąć płyn, jednocześnie przytrzymując komorę serca pipetą. Następnie natychmiast przedziurawić zatokę żylną kleszczami, aby uwolnić krew z krążenia. Z komory wyreguluj kąt szklanej pipety, aby zlokalizować wejście do opuszki tętniczej i przesuń otwór pipety do wnętrza opuszki tętniczej.Następnie należy docisnąć strzykawkę przez dodatkowe 30 do 60 sekund, trzymając pipetę wewnątrz bańki tętniczej. Aby optymalnie oznakować wszystkie naczynia krwionośne, bardzo ważne jest, aby perfuzja do opuszki tętniczej była wystarczająco długa, aby zastąpić całą krew roztworem utrwalającym DiI. Po około 60 sekundach perfuzji, gdy nie obserwuje się już wycieku krwi, wyjmij szklaną pipetę i igły z ryby, a następnie zbierz mózg i przysadkę do świeżego 4% paraformaldehydu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie opłucz tkanki dwa razy w świeżym PBS przez 10 minut na pranie przed przygotowaniem próbek do obrazowania. Po wstrzyknięciu do serca roztworu utrwalającego zawierającego DiI, jak pokazano, znakowane naczynia krwionośne można obserwować na wycinkach tkanek za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii stereoskopowej lub na całej tkance za pomocą mikroskopii konfokalnej. Należy pamiętać, że w przypadku wstrzyknięcia roztworu do komory serca zamiast do opuszki tętniczej lub w przypadku wstrzyknięcia roztworu ze zbyt niskim ciśnieniem i (lub) na zbyt krótki czas, można zaobserwować nieodpowiednie oznakowanie naczyń.Ponadto, podczas obrazowania tej samej tkanki o tych samych parametrach obrazowania, po kilku dniach można zaobserwować spadek intensywności znakowania, przy czym sygnał wydaje się bardziej rozproszony w próbce tkanki. Wycinki tkanek z linii transgenicznych, w których komórki będące przedmiotem zainteresowania wyrażają fluorescencyjne białka reporterowe, mogą być dalej znakowane pod kątem określonych białek będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu standardowych protokołów immunofluorescencyjnych, co pozwala na badanie interakcji między naczyniami krwionośnymi a innymi typami komórek. Ważne jest, aby dotrzeć do bulbus arteriosus.Gdy zostanie to osiągnięte, dodanie nacisku na tłok strzykawki powinno wywołać rozszerzenie bańki, potwierdzając pomyślny zabieg. Technika ta może być wykorzystana do zbadania interakcji między komórkami endokrynnymi a naczyniami krwionośnymi w przysadce teleost w ogóle, ale może bardziej szczegółowo do zbadania możliwych różnic lub podobieństw między systemami portalowymi u teleostów i ssaków. Ze względu na to polityczne zastosowanie, podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie maski przeciwgazowej i wentylowanego pomieszczenia.

labeling-blood-vessels-teleost-brain-pituitary-using-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców...

DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi

Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania naczyń krwionośnych w skórze zarodkowej i grasicy.

Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

W niniejszej pracy opisujemy tanią, szybką, kontrolowaną i jednorodną procedurę fiksacji z użyciem 4% paraformaldehydu podawanego przez perfuzję układu naczyniowego: poprzez serce szczura, aby uzyskać jak najlepszą konserwację mózgu.

Perfuzyjna fiksacja całego organizmu gryzoni

Obwody neuronalne są zorganizowane topograficznie w przedziały funkcjonalne o specyficznych profilach molekularnych. W niniejszej pracy przedstawiamy praktyczne i techniczne kroki służące do ujawnienia globalnej topografii mózgu z wykorzystaniem wszechstronnego podejścia opartego na barwieniu immunohistochemicznym całych preparatów (wholemount). Demonstrujemy użyteczność tej metody, wykorzystując dobrze poznaną cytoarchitekturę i obwody móżdżku.

Immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Analiza anatomii naczyń mózgowych gryzoni odgrywa istotną rolę w eksperymentalnych badaniach nad udarem. W tym kontekście perfuzja wewnątrz naczyniowa barwionym lateksem jest uważana za standardowe narzędzie od wielu lat. Technika ta wiąże się jednak z wyraźnymi ograniczeniami technicznymi, które obniżają jej powtarzalność. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą powtarzalną wizualizację naczyń mózgowych. Wstrzyknięcie mieszaniny dwóch dostępnych w handlu tuszy na bazie sadzy poprzez lewą...

Dożylna perfuzja tuszem z sadzy pozwala na wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych

Korzystając z lipofilowej techniki barwienia nadchloranem 1,1'-Dioctadecy-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI), Ambystoma mexicanum może ulegać perfuzji naczyniowej, co pozwala na łatwą wizualizację układu naczyniowego.

Perfuzja DiI jako metoda wizualizacji naczyń krwionośnych w Ambystoma mexicanum

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Wstępne dochodzenie potwierdza, że krwotok podpajęczynówkowy (SAH) powoduje zanik perycytów mózgu. Ocena kurczliwości perycytów po SAH wymaga rozróżnienia między żywotnymi i nieżywotnymi perycytami mózgu. W związku z tym opracowano procedurę oznaczania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu jednocześnie w wycinkach mózgu, ułatwiając obserwację przy użyciu mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym

Pokazujemy chemiczne indukowanie dużego rozszerzenia naczyń krwionośnych u myszy jako model do badania dysfunkcji naczyń mózgowych, który może być wykorzystany do modelowania demencji naczyniowej i choroby Alzheimera. Demonstrujemy również wizualizację układu naczyniowego poprzez wstrzykiwanie mieszanki kauczuku silikonowego i zapewnianie jasnych wizualnych wskazówek dotyczących pomiaru zmian wielkości naczyń krwionośnych.

Wizualne podejście do wywoływania dolichoektazji u myszy w celu modelowania dysfunkcji naczyń mózgowych za pośrednictwem dużych naczyń krwionośnych

Poznaj metodę znakowania naczyń krwionośnych w mózgu i przysadce mózgowej ryb teleostów za pomocą perfuzji serca z utrwalaczem DiI. Technika ta jest szybka, prosta i adaptowalna do różnych gatunków.

Znakowanie naczyń krwionośnych w mózgu teleostowym i przysadce mózgowej za pomocą perfuzji serca z utrwalaczem DiI

Przeglądaj więcej filmów