Name: Enzymatyczna synteza epoksydowanych metabolitów kwasów dokozaheksaenowego, eikozapentaenowego i arachidonowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Poznaj enzymatyczną syntezę enancjoczystych kwasów epoksy tłuszczowych z DHA, EPA i kwasu arachidonowego przy użyciu enzymu BM3. Ta metoda umożliwia szybkie i opłacalne uzyskanie znaczących ilości metabolitów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest finansowana przez R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) oraz fundusze startowe z Michigan State University. Autorzy pragną podziękować dr Jun Yangowi (Uniwersytet Kalifornijski w Davis) i Lalithi Karchalla (Uniwersytet Stanowy Michigan) za pomoc w optymalizacji reakcji enzymatycznej oraz dr Tony'emu Schilmillerowi (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) za pomoc w pozyskiwaniu danych HRMS.

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) przed użyciem wymienionych chemikaliów.
1. Wyrażenie dzikiego typu BM3
<ol>
	<li>Zaszczepić transfekowane pBS-BM3 DH5α E. coli (hojna darowizna od dr F. Ann Walker) w 5 ml sterylnego bulionu LB z 0,5 mg ampicyliny dodanej do probówki hodowlanej o pojemności 20 ml.</li>
	<li>Inkubować kulturę komórkową w wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez 24 godziny przy 200 obr./min. Dodać całonocną kulturę starterową (5 ml) i 100 mg ampicyliny do 1 l sterylnego bulionu LB w kolbie Fernbacha lub Erlenmeyera. Wytrząsać w temperaturze 37 °C przez 6 godzin przy 200 obr./min, a następnie w temperaturze 30 °C przez 18 godzin przy 200 obr./min.</li>
	<li>Zebrać i odwirować kulturę komórkową w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 1 000 x g. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -78 °C do czasu oczyszczenia enzymatycznego. 
	UWAGA: Supernatant może być sterylizowany chemicznie przez traktowanie wybielaczem lub sterylizowany za pomocą autoklawu, a następnie wylewany do odpływu.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie BM3.
<ol>
	<li>Liza komórek
	<ol>
		<li>Rozmrozić osad komórkowy na lodzie i ponownie zawiesić w 40 ml lodowatego (4 °C) buforu do rozpuszczania (10 mM Tris, 0,01 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 0,01 mM EDTA; pH 7,8). 
		UWAGA: PMSF jest toksyczny w kontakcie.</li>
		<li>Będąc na lodzie, sonikuj komórki przez 1 minutę za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego (ustawienie mocy wyjściowej 10, obciążenie 100%), a następnie 1-minutową przerwę na lodzie w celu lizy komórek. Powtórz tę procedurę 6 razy. Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 4 °C przez 30 minut w temperaturze 11 000 x g w celu osadzenia resztek komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia powinowactwa
	<ol>
		<li>Przygotować kolumnę do chromatografii z silną anionowymiennością (patrz tabela materiałów; średnica: 2,8 cm x 6 cm, objętość kolumny: 37 ml) przez przemywanie 5 objętościami kolumny (CV) buforu A (10 mM Tris, pH 7,8) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać lizaty komórkowe do zrównoważonej kolumny i przemyć kolumnę 3 CV zimnego buforu A. Usunąć BM3, przemłukując kolumnę zimnym buforem B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).</li>
		<li>Zebrać czerwonawo-brązową frakcję eluentu. Jeśli białko nie jest używane natychmiast, wymieszaj je z równą objętością glicerolu i błyskawicznie zamroź ciekłym azotem. Zamrożony roztwór przechowywać w temperaturze -78 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Epoksydacja DHA przez BM3
<ol>
	<li>Przygotować reakcję, dodając 0,308 g (0,940 mmol) DHA w 18,8 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do 2 l buforu reakcyjnego do mieszania (0,12 M fosforanu potasu, 5 mM MgCl2, pH 7,4) wraz z 20 nM rozmrożonego enzymu BM3. Stężenie enzymu można określić za pomocą metody testu spektralnego tlenku węgla/ditionitu19.</li>
	<li>Podczas mieszania roztworu należy rozpocząć reakcję od dodania 1 równoważnika NADPH (zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, sól tetrasodowa, 0,808 g, 0,940 mmol) rozpuszczony w buforze reakcyjnym. Mieszaj reakcję przez 30 minut, bulgocząc powietrzem przez mieszaninę reakcyjną za pomocą balonu wypełnionego powietrzem przymocowanego do strzykawki i igły.</li>
	<li>Za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów) sprawdzić absorbancję mieszaniny reakcyjnej przy długości fali 340 nm, aby określić, czy NADPH jest wyczerpany. Jeśli nie ma pozostałej absorbancji wskazującej na zużycie NADPH, reakcja jest zakończona. 
	UWAGA: Zazwyczaj reakcja kończy się po 30 minutach.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną ugasić przez powolne dodawanie 1 M kwasu szczawiowego kroplami, aż pH roztworu osiągnie 4.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja EDP
<ol>
	<li>Ekstrahować spiekany roztwór buforowy 2 litrami eteru dietylowego (bezwodnego, bez nadtlenku) 3 razy. Zebrać warstwę eteru (6 l) i osuszyć bezwodnym siarczanem magnezu (MgSO4).</li>
	<li>PrzefiltrowaćMgSO4 z roztworu i skoncentrować wysuszoną warstwę eteru na wyparce obrotowej, aby uzyskać surową pozostałość EDP.</li>
	<li>Oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej z błyskiem (wystarczy wkład z krzemionką o masie 40 g). Zacznij od 10% octanu etylu (EtOAc) w heksanach i zwiększaj do 60% EtOAc w heksanach w ciągu 22 minut 
	UWAGA: Trzy główne piki są uzyskiwane i zbierane, eluując w kolejności 1. nieprzereagowany DHA; 2. mieszanina izomerów EDP; oraz 3. dwuepoksyd (normalne produkty nadmiernego utleniania (patrz <silna klasa = "xfig" > rysunek 1)).</li>
	<li>Połącz frakcje i skoncentruj je na wyparce obrotowej. Z tego przykładu uzyskano 0,074 g (24%) nieprzereagowanego DHA, 0,151 g (47%) izomerów EDP i 0,076 g (22%) diepoksydu.</li>
</ol>
5. Estryfikacja EDP, separacja 16(S),17(R)- i 19(R),20(R)-EDP oraz zmydlanie estrów
UWAGA: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazometan) jest bardzo toksyczny zarówno przez kontakt, jak i przez wdychanie. Stosować wyłącznie w dygestorium z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć epoksydy (0,151 g, 0,435 mmol) w kolbie okrągłodennej lub małej fiolce z 2 ml bezwodnego metanolu (MeOH) i 3 ml bezwodnego toluenu, dodać mieszadło i dodać TMS-diazometan (1,2 ekwiwalentu molowego lub 0,26 ml 2 M roztworu 2 M w heksanach) pod wpływem argonu.</li>
	<li>Odczekaj 10 minut i dodaj dodatkowy TMS-diazometan (0,050 ml), aż pozostanie bladożółty kolor.</li>
	<li>Po 30 minutach ostrożnie zagęścić mieszaninę za pomocą wyparki obrotowej i oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej z błyskiem. Eluować 4% EtOAc w heksanach (przy użyciu 40 g kolumny lub wkładu z żelem krzemionkowym) przez 22 minuty. W tym przykładzie ester metylowy 19,20-EDP (0,116 g, 74%) i ester metylowy 16,17-EDP (0,029 g, 19%) otrzymano jako klarowne oleje (całkowita wydajność, 93%).</li>
	<li>Zebrać frakcje zawierające oczyszczone regioizomery estrów metylowych EDP. Najpierw eluuje ester metylowy 19(S),20(R)-EDP, a następnie ester metylowy 16(S),17(R)-EDP.</li>
	<li>Jeśli pozostaną jakiekolwiek frakcje mieszane (zawierające oba izomery; można je ocenić za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w heksanie/EtOAc 8:1 i zabarwić nadmanganianem potasu (KMnO4)), należy je ponownie schromatografować tym samym systemem rozpuszczalników, co poprzednio.</li>
	<li>Zagęścić frakcje zawierające poszczególne regioizomery. 
	UWAGA: W tym momencie tożsamość i czystość można ocenić za pomocą NMR (przy użyciu CDCl3 jako rozpuszczalnika; patrz legenda dla Rysunek 2).</li>
	<li>Aby przekształcić poszczególne regioizomery estrów metylowych EDP do ich form kwasowych, należy rozcieńczyć ester EDP w THF:woda (około 0,7 ml/0,1 mmol estru). Dodać 2 M wodny roztwór LiOH (odpowiednik 3 molowców) i mieszać przez noc. 
	UWAGA: Kompletność reakcji można ocenić za pomocą TLC, przy użyciu heksanów 3:1/EtOAc, barwienia KMnO4; Produkt posiada współczynnik retencji ~0,3.</li>
	<li>Powoli gasić reakcję kwasem mrówkowym, aż pH mieszaniny osiągnie 3-4. Dodaj wodę i octan etylu (1-2 ml / 0,100 mmol estru) i oddziel warstwy. Ekstrahować warstwę wody za pomocą EtOAc (3 x 5 ml), przemyć nasyconym roztworem solanki (NaCl) i wysuszyć warstwę EtOAc na bezwodnym siarczanie sodu (Na2SO4).</li>
	<li>Zagęścić roztwór octanu etylu za pomocą wyparki obrotowej, dodać heksany (10 ml) i ponownie zagęścić. Powtórz dwukrotnie, aby azeotropowo usunąć resztki kwasu mrówkowego. Oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej z błyskiem, eluując 10-30% EtOAc przez 15 minut.</li>
	<li>Skoncentrować pożądane frakcje i wysuszyć w próżni, aby uzyskać oczyszczony kwas. 
	UWAGA: Na tym etapie można ocenić czystość enancjomeryczną (za pomocą chiralnego HPLC, patrz legendy dla <silna klasa="xfig">Rysunek 3 - <silna klasa="xfig">Rysunek 4 dla kolumny i warunków). Czystość chemiczną można ocenić za pomocą HPLC C18 (achiralnej) (patrz tabela materiałów i odniesienie 14).</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li>
<li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li>
<li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxyeicosatrienoic+acids%2C+hypertension%2C+and+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li>
<li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211(2016).</li>
<li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K%28%2B%29-channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li>
<li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li>
<li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+TC+%22Trends+in+the+use+of+complementary+health+approaches+among+adults%3A+United+States%2C+2002%E2%80%932012%22">Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012</a>. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).</li>
<li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li>
<li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li>
<li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins%3A+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-%2C+dihydroxy-%2C+and+epoxy-fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).</li>
<li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhan%2C+MA+%22Method+for+the+synthesis+of+DHA%22">Method for the synthesis of DHA</a>. , WO2012126088A1 (2012).</li>
<li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+synthesis+of+17%2C18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li>
<li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li>
<li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical%2C+enantiospecific+syntheses+of+14%2C15-EET+and+leukotoxin+B+%28vernolic+acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li>
<li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li>
<li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li>
<li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li>
<li>Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , 
 <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019).</li>
<li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+site+substitution%2C+F87V%2C+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+%2814S%2C+15R%29-arachidonic+acid+epoxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy tutaj prostą operacyjnie i opłacalną metodę otrzymywania dwóch najobficiej występujących epoksydowych metabolitów DHA - 19,20 i 16,17-EDP. Te epoksydowe kwasy tłuszczowe można wytwarzać w wysoce enancjomerycznym (jako ich izomery S,R) przy użyciu enzymu BM3 typu dzikiego. Poniżej opisano kilka krytycznych punktów, które można wykorzystać do rozwiązywania problemów oraz rozszerzenia naszej metody o przygotowanie enancjoczystych metabolitów epoksydowych AA i EPA.
W...

Ponieważ zainteresowanie rolą, jaką wielonienasycone kwasy tłuszczowe (szczególnie wielonienasycone kwasy tłuszczowe omega-3 i omega-6) odgrywają w biologii człowieka, w ostatnich latach wzrosło zainteresowanie badaczami, którzy wykazują szeroki zakres atrakcyjnych korzyści, jakie wykazują ich metabolity. W szczególności dużym zainteresowaniem zwrócono się na metabolity epoksydowych kwasów tłuszczowych wytwarzane przez enzymy z klasy cytochromu P450. Na przykład wiele epoksydów PUFA, w tym kwasy epoksyeikozatrienowe (EET), kwasy epoksydokozapentaenowe (EDP) i kwasy epoksyeikozatetraenowe (EEQ), odgrywa kluczową rolę w regulacji ciśnienia krwi i stanu zapalnego1,2,3,4,5. Co ciekawe, wiadomo, że specyficzne enancjomery i regioizomery epoksydów AA i EPA mają różny wpływ na zwężenie naczyń krwionośnych6,7. Podczas gdy fizjologiczne działanie enancjomerów i regioizomerów EET i EEQ zostało udokumentowane, niewiele wiadomo na temat wpływu analogicznych kwasów epoksydokozapentaenowych (EDP) utworzonych z DHA. Powszechne stosowanie oleju rybnego8, który jest bogaty zarówno w EPA, jak i DHA, również wzbudziło zainteresowanie EDPs9. Uważa się, że korzyści płynące z tych suplementów wynikają częściowo z metabolitów DHA (16,17-EDP i 19,20-EDP są najliczniejsze), ponieważ poziomy EDP in vivo bardzo dobrze współgrają z ilością DHA w diecie10,11.
Badanie mechanizmów i celów tych epoksydowych kwasów tłuszczowych za pomocą metabolomiki, biologii chemicznej i innych metod okazało się wyzwaniem, częściowo dlatego, że istnieją one jako mieszaniny regio- i stereo-izomerów, a metoda uzyskania czystych ilości enancjomerów i regioizomerów jest wymagana. Konwencjonalne środki do chemicznej syntezy tych związków okazały się nieskuteczne. Stosowanie nadtlenokwasów, takich jak kwas meta-chloroperoksybenzoesowy, do epoksydacji ma wiele wad, w szczególności brak selektywności epoksydowej, co wymaga kosztownego i żmudnego oczyszczania poszczególnych regioizomerów i enancjomerów. Całkowita synteza metabolitów DHA i EPA jest możliwa, ale ma również wady, które sprawiają, że jest niepraktyczna w przypadku syntezy na dużą skalę, takich jak wysokie koszty i niskie plony12,13. Wydajna ogólna produkcja może być osiągnięta dzięki syntezie enzymatycznej, ponieważ reakcje enzymatyczne są regio- i stereoselektywne14. Badania pokazują, że enzymatyczna epoksydacja AA i EPA (z BM3) jest zarówno regioselektywna, jak i enancjoselektywna15,16,17,18, ale ta procedura nie została przetestowana z DHA ani na dużą skalę. Ogólnym celem naszej metody było zwiększenie skali i optymalizacja tej chemoenzymatycznej epoksydacji w celu szybkiego wytworzenia znacznych ilości czystych epoksydowych kwasów tłuszczowych jako ich indywidualnych enancjomerów. Korzystając z przedstawionej tu metody, naukowcy mają dostęp do prostej i opłacalnej strategii syntezy EDP i innych metabolitów epoksydowych PUFA.

<table><tbody><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>Bezwodny siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td>NA</td></tr><tr><td>Bezwodny metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>Bezwodny siarczan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421-500</td><td>NA</td></tr><tr><td>Bezwodny toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>NA Kwas arachidonowy (AA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>Wrażliwy na powietrze.&nbsp;</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO (klasa biologii molekularnej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>Kwas dokozaheksaenowy (DHA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-84A</td><td>Wrażliwy na powietrze.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td>NA</td></tr><tr><td>Kwas eikozapentaenowy (EPA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>&nbsp; U-99A</td><td>Wrażliwy na powietrze.&nbsp;</td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>34858</td><td>NA</td></tr><tr><td>Wkłady kolumnowe Flash o rozmiarach 25, 40, 4, 12 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>Alternatywnie można zastosować konwencjonalną chromatografię kolumnową</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (klasa HPLC)</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td>NA</td></tr><tr><td>Heksany</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>NA</td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>Wodorotlenek litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>2444-01</td><td></td></tr><tr><td>NA Metanol (klasa HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-41-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>NADPH Sól tetrasodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>Wrażliwy na powietrze.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas szczawiowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 transfekowany DH5&alfa; E. coli</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA PMSF (fluorek fenylometanosulfonylu)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Toksyczny!</td></tr><tr><td>Nadmanganian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>do barwienia TLC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow żywica (GE Healthcare, nauki przyrodnicze)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-0515-01</td><td>Do oczyszczania enzymu z anionamitenitami</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-Diazometan (2,0 M w heksanach)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>362832</td><td>Bardzo toksyczny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><<tr><td>strong>Również niezbędne:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny system oczyszczania flash (użyliśmy Buchi Reveleris X2)&nbsp;</td><td>Kolumna HPLC Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td><td>Wirówka Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zdolna do 10 000 x g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chiralna kolumna HPLC (Lux celuloza-3), 250 x 4,6 mm, 5 i mikro; M, 1000 & Aring ;)</td><td>Zaopatrzenie Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General chemistry: lejek separacyjny o pojemności 2 l, zlewki i kolby Erlenmeyera o pojemności 1000-2000 l, fiolki 20 ml, fiolki HPLC, małe kolby okrągłodenne i mieszadła.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (używamy pompy analitycznej Shimadzu Prominence LC-20AT i detektora UV-vis SPD-20A</td> Spektrofotometr <td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td>NMR: Spektrometr Agilent DD2 (500 MHz)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dysmembrator Sonic lub homogenizator ultradźwiękowy</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatyczna synteza epoksydowanych metabolitów kwasów dokozaheksaenowego, eikozapentaenowego i arachidonowego

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Epoksydowane metabolity różnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), określane jako epoksydowe kwasy tłuszczowe, pełnią szeroki zakres ról w fizjologii człowieka. Metabolity te są wytwarzane endogennie przez enzymy z klasy cytochromu P450. Ze względu na ich zróżnicowane i silne działanie biologiczne, istnieje duże zainteresowanie badaniem tych metabolitów. Określenie unikalnych ról tych metabolitów w organizmie jest trudnym zadaniem, ponieważ epoksydowe kwasy tłuszczowe muszą być najpierw pozyskiwane w znacznych ilościach i o wysokiej czystości. Pozyskiwanie związków ze źródeł naturalnych jest często pracochłonne, a rozpuszczalne hydrolazy epoksydowe (sEH) szybko hydrolizują metabolity. Z drugiej strony, otrzymywanie tych metabolitów w reakcjach chemicznych jest bardzo nieefektywne, ze względu na trudności w uzyskaniu czystych regioizomerów i enancjomerów, niskie plony oraz rozległe (i kosztowne) oczyszczanie. W tym miejscu przedstawiamy wydajną syntezę enzymatyczną kwasów 19(S),20(R)- i 16(S),17(R)-epoksydokozapentaenowych (EDP) z DHA poprzez epoksydację BM3, bakteryjnym enzymem CYP450 wyizolowanym pierwotnie z Bacillus megaterium (który łatwo ulega ekspresji w Escherichia coli). Charakterystykę i oznaczanie czystości przeprowadza się za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i spektrometrii mas (MS). Procedura ta ilustruje korzyści płynące z enzymatycznej syntezy metabolitów epoksydowych PUFA i ma zastosowanie do epoksydacji innych kwasów tłuszczowych, w tym kwasu arachidonowego (AA) i kwasu eikozapentaenowego (EPA) w celu wytworzenia analogicznych kwasów epoksyeikozatrienowych (EET) i kwasów epoksyeikozatetraenowych (EEQ).

Chromatogram z flash-chromatografii kolumnowej (wykonanej przy użyciu zautomatyzowanego systemu do oczyszczania metodą flash, opisanego poniżej), uzyskany podczas oczyszczania surowej mieszaniny z epoksydacji enzymatycznej, przedstawiono na Rysunku 1. Po estryfikacji i rozdziale regioizomerów otrzymano czyste estry metylowe 16(S),17(R)-EDP oraz 19(S),20(R)-EDP. Zazwyczaj występują one w przybliżonym stosunku od 1:4 do 1:5, ...

Prezentujemy metodę przydatną do syntezy enzymatycznej na dużą skalę i oczyszczania specyficznych enancjomerów i regioizomerów epoksydów kwasu arachidonowego (AA), kwasu dokozaheksaenowego (DHA) i kwasu eikozapentaenowego (EPA) za pomocą bakteryjnego enzymu cytochromu P450 (BM3).

Enzymatyczna synteza epoksydowanych metabolitów kwasów dokozaheksaenowego, eikozapentaenowego i arachidonowego

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Tak więc nasz protokół pozwala nam przygotować enancjomeryczne epoksydowe kwasy tłuszczowe, a ta metoda może pomóc w postępie badań nad mechanizmami, za pomocą których te metabolity działają w organizmie. Historycznie rzecz biorąc, czyste epoksydowe kwasy tłuszczowe są bardzo trudne do uzyskania. Tak więc nasz protokół jest prosty, szybki, opłacalny i pozwala nam przygotować znaczne ilości tych metabolitów.Tak, opracowaliśmy protokół dla DHA, ale działa on również bardzo dobrze w przypadku EPA i kwasu arachidonowego. Pracuj szybko, ponieważ niektóre odczynniki są wrażliwe na powietrze, w szczególności DHA i NADPH, i pamiętaj, aby sparować wszystko z wyprzedzeniem, aby konfiguracja była prosta. Należy również pamiętać o zagrożeniach.Nasz protokół wykorzystuje techniki zarówno enzymologiczne, jak i chemii organicznej. Wizualizacja ma kluczowe znaczenie dla pomocy czytelnikom i widzom, którzy nie są zaznajomieni ze specjalistycznymi technikami w tych dziedzinach. Do zaszczepienia należy użyć sterylnej pętli lub pipety zanurzonej w bulionie glicerolowym transfekowanego DH5-alfa E. coli pBS-BM3 w pięciu mililitrach sterylnego bulionu LB uzupełnionego 0,5 miligrama ampicyliny.Inkubować kulturę komórkową w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny przy 200 obr./min. Następnie dodaj pięciomililitrową kulturę starterową i 100 miligramów ampicyliny do jednego litra sterylnego bulionu LB w kolbie Erlenmeyera. Wstrząsaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin przy 200 obr./min, a następnie w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 18 godzin przy 200 obr./min.Następnie zebrać kulturę komórkową do probówek wirówkowych i odwirować kulturę komórkową w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 1 000 razy g. Odlać supernatant do innej kolby. Odkazić wybielaczem lub za pomocą autoklawu i przechowywać osad komórkowy w temperaturze minus 78 stopni Celsjusza do czasu oczyszczenia enzymu.Aby przeprowadzić lizę komórek, najpierw rozmrozić osad komórkowy na lodzie i ponownie zawiesić w 40 mililitrach lodowatego buforu do rozpuszczania zawierającego Tris, PMSF i EDTA. Będąc na lodzie, sonikuj komórki przez jedną minutę za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego, z ustawieniem mocy wyjściowej 10 i pracą 100, a następnie jednominutową przerwę na lodzie w celu lizy komórek. Powtórz tę procedurę sześć razy.Odwiruj lizat komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut w temperaturze 11 000 razy g, aby rozdrobnić resztki komórek. Aby przeprowadzić chromatografię powinowactwa, w chłodni lub lodówce z przesuwanymi drzwiami, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, należy najpierw przygotować kolumnę do chromatografii z silną anionitami, przemując żywicę pięcioma objętościami kolumny buforu A 10-milimolowego Tris o pH 7,8. Następnie dodać supernatant lizatów komórkowych do zrównoważonej kolumny i przemyć kolumnę trzema objętościami zimnego buforu A. Następnie eluować BM3, przemywając kolumnę sześcioma objętościami kolumny zimnego buforu B 10-milimolowego Tris i 600-milimolowego chlorku sodu.Zebrać czerwonawo-brązową frakcję eluentu. Jeśli białko nie jest używane natychmiast, wymieszaj je z równą objętością glicerolu i błyskawicznie zamroź ciekłym azotem. Zamrożony roztwór przechowywać w temperaturze minus 78 stopni Celsjusza.Aby przeprowadzić epoksydację DHA, należy najpierw określić stężenie rozmrożonego enzymu BM3, zgodnie z metodą testu spektralnego ditionitu tlenku węgla. Następnie, w zlewce zawierającej dwa litry buforu reakcyjnego mieszanego na magnetycznej płytce mieszającej, dodać 0,94 milimoli DHA rozcieńczonego w 18,8 mililitra DMSO i enzym BM3 rozcieńczony do 20 nanomolowych. Podczas mieszania roztworu rozpocznij reakcję epoksydacji, dodając 8,7 mililitra buforu reakcyjnego zawierającego 0,94 milimoli NADPH.Mieszać reakcję przez 30 minut, bulgocząc powietrzem do mieszaniny reakcyjnej za pomocą balonu wypełnionego powietrzem przymocowanego do strzykawki i igły przyklejonej taśmą do wnętrza zlewki. Następnie należy pobrać jeden mikrolitr mieszaniny reakcyjnej i umieścić go w spektrofotometrze NanoDrop, aby zmierzyć absorbancję przy 340 nanometrach. Użyj wody jako półfabrykatu.Jeśli nie ma pozostałej absorbancji, co wskazuje, że NADPH został zużyty, reakcja jest zakończona. Mieszaninę reakcyjną należy ugasić, powoli dodając kroplami jednomolowy kwas szczawiowy, aż pH roztworu osiągnie około czterech. Teraz wyekstrahuj stłumiony roztwór buforowy dwoma litrami bezwodnego, wolnego od nadtlenków eteru dietylowego.Za pomocą lejka separacyjnego potrząśnij i oddziel warstwy, a następnie zbierz eter do kolby Erlenmeyera. Powtórz jeszcze dwa razy i dodaj około 50 gramów bezwodnego siarczanu magnezu, aby wysuszyć eter. Na lejek filtra próżniowego wlej wysuszony eter, aby przefiltrować siarczan magnezu i przenieś przefiltrowaną warstwę eteru do kolby okrągłodennej wyparki obrotowej.Dostosuj prędkość obrotową do średniej i uruchom próżnię, aby zagęścić ciecz w celu uzyskania surowej pozostałości EDP. Załaduj pozostałość do 40-gramowego wkładu krzemionkowego, aby przeprowadzić chromatografię kolumnową flash za pomocą automatycznej maszyny do oczyszczania błyskawicznego. Zacznij od 10% octanu etylu w heksanach i zwiększaj do 60% octanu etylu w heksanach w ciągu 22 minut.Frakcje są automatycznie zbierane w probówkach. Następnie połącz frakcje z każdego piku do kolby okrągłodennej, umieść na wyparce obrotowej i rozpocznij parowanie. Otrzymuje się trzy frakcje: DHA, izomery EDP i diepoksyd.Aby estryfikować otrzymane 0,151 grama epoksydu, w kolbie okrągłodennej lub małej fiolce dodaj dwa mililitry bezwodnego metanolu i trzy mililitry bezwodnego toluenu i dodaj mieszadło. Połączyć kolbę z balonem wypełnionym argonem przez gumową przegrodę i igłę i dodać 0,26 mililitra dwumolowego TMS-diazometanu przez strzykawkę, mieszając. Odczekaj 10 minut i dodaj dodatkowe 05 mililitrów TMS-diazometanu, aż pojawi się bladożółty kolor.Po 30 minutach ostrożnie zagęścić mieszaninę za pomocą wyparki obrotowej i użyć 40-gramowego wkładu kolumnowego z żelem krzemionkowym na maszynie do chromatografii błyskawicznej w celu oczyszczenia pozostałości. Elutę o izokratycznym stężeniu 4% octanu etylu w heksanach przez 22 minuty. Najpierw zebrać frakcje zawierające oczyszczone eluaty estrów metylowych 19S, 20R-EDP, a następnie ester metylowy 16S, 17R-EDP.Teraz oceń frakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej w mieszaninie heksanu i octanu etylu w proporcji osiem do jednego. Zabarwić nadmanganianem potasu, aby sprawdzić, czy nie ma mieszanych frakcji zawierających oba izomery. Skoncentrować frakcje odpowiadające każdemu pikowi na wyparce obrotowej, a następnie zważyć na wadze w celu określenia ilości otrzymanych estrów EDP.Jeśli pozostaną frakcje mieszane, należy je ponownie przeprowadzić chromatografię z użyciem tego samego systemu rozpuszczalników, jaki był poprzednio stosowany. Zagęścić każdą frakcję zawierającą pojedynczy regioizomer na wyparce obrotowej. Aby przekształcić poszczególne regioizomery estrów metylowych EDP do ich form kwasowych, rozcieńczyć ester EDP w małej fiolce z około 0,7 mililitra THF na 0,1 milimola estru wraz z 0,175 mililitra wody.Schłodzić fiolkę do zera stopni Celsjusza w łaźni lodowej, dodać trzy odpowiedniki roztworu wodorotlenku litu i mieszać na płytce mieszającej pod argonem przez noc, ogrzewając do temperatury pokojowej. Rano wygasić reakcję, powoli dodając kwas mrówkowy, aż pH mieszaniny osiągnie trzy do czterech. Następnie dodaj wodę i dwa mililitry octanu etylu, aby oddzielić warstwy.Ekstrahować warstwę wody 10 mililitrami octanu etylu trzykrotnie, przemyć 20 mililitrami nasyconego roztworu solanki i dodać kilka gramów bezwodnego siarczanu sodu do roztworu, aby wysuszyć warstwę octanu etylu. Zagęścić roztwór octanu etylu za pomocą wyparki obrotowej, dodać 10 mililitrów heksanów i ponownie zagęścić. Powtórz dwukrotnie, aby azeotropowo usunąć resztki kwasu mrówkowego.Oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej z błyskiem, eluując 10-30% octanem etylu przez 15 minut. Skoncentruj żądane frakcje w wyparce obrotowej i wysusz w próżni, aby uzyskać oczyszczony kwas. Chromatogram kolumny błyskowej otrzymany po oczyszczeniu surowej mieszaniny z epoksydacji enzymatycznej jest pokazany tutaj.Uzyskano trzy główne piki, elucję w kolejności, po pierwsze, nieprzereagowany DHA, po drugie, mieszaninę izomerów EDP, a po trzecie, diepoksyd, które są normalnymi produktami nadmiernego utleniania. Po estryfikacji i rozdzieleniu regioizomerów, widma protonowego NMR wskazują, że otrzymano estry metylowe 16S, 17R-EDP i 19S, 20R-EDP o wysokiej czystości. Chiralna HPLC potwierdziła enancjomeryczną czystość form kwasowych EDP.Upewnij się, że bulion jest sterylny podczas obchodzenia się i zaszczepiania, aby uniknąć zanieczyszczenia. Epoksydacja może być stosowana do innych kwasów tłuszczowych. Spróbowaliśmy tego również z kwasami arachidonowym i eikozapentaenowym i uzyskaliśmy dobre plony tych enancjoczystych epoksydów, a więc 14, 15-EET i 17, 18-EEQ.Tak więc protokół, który umożliwia naukowcom dostęp do epoksydowych kwasów tłuszczowych, może pomóc w badaniach nad biologicznymi funkcjami tych związków, co może prowadzić do ich wykorzystania jako leków prowadzących. Niebezpieczne substancje chemiczne to PMSF, który jest niebezpieczny przez kontakt, oraz TMS-diazometan, który jest bardzo toksyczny przez kontakt i wdychanie. Dlatego te ostatnie powinny być używane w dygestoriach i z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.

enzymatic-synthesis-epoxidized-metabolites-docosahexaenoic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Opisujemy protokół katalizowanego światłem wytwarzania nadtlenku wodoru — kofaktora przemian oksydacyjnych.

Dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem

Chiralne aminoalkohole są wszechstronnymi cząsteczkami do wykorzystania jako rusztowania w syntezie organicznej. Zaczynając od L-lizyny, syntetyzujemy aminoalkohole w enzymatycznej reakcji kaskadowej łączącej diastereoselektywne utlenianie C-H katalizowane przez dioksygenazę, a następnie rozszczepienie ugrupowania kwasu karboksylowego odpowiedniego aminokwasu hydroksylowego przez dekarboksylazę.

Enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

Ta praca opisuje solidną i prostą metodę wykrywania i ilościowego oznaczania endokannabinoidu 2-arachidonoiloglycerolu (2-AG) u C. elegans. Analityczny deuterowany wzorzec nas przygotowany i stosowany do oznaczania ilościowego 2-AG przez rozcieńczenie izotopowe i chromatografię cieczową - jonizację elektronową - tandemową spektrometrię mas (LC-ESI-MS / MS).

Synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy tanią metodę ilościową wykorzystującą spektrometrię mas z tlenkiem deuteru i chromatografią gazową (GCMS) do analizy całkowitej lipogenezy de novo kwasów tłuszczowych w brunatnej tkance tłuszczowej in vivo.

Ilościowe oznaczanie syntezy kwasów tłuszczowych de novo w brunatnej tkance tłuszczowej przy użyciu tlenku deuteru

Krzyżowo sprzężone fluorofory krzyżowe oparte na jądrach 1,4-distyryl-2,5-bis(arylethynylo)benzenu i benzobisoksazolu mogą być używane do jakościowej identyfikacji różnych analitów Lewisa kwasowych i zasadowych Lewisa. Metoda ta opiera się na różnicach w kolorach emisyjnych krzyży, które obserwuje się po dodaniu analitu. Strukturalnie blisko spokrewnione gatunki można odróżnić od siebie.

Identyfikacja jakościowa kwasów karboksylowych, kwasów boronowych i amin przy użyciu fluoroforów krzyżowych

Synteza, aktywacja i charakterystyka celowo zaprojektowanych metaloorganicznych materiałów szkieletowych jest wyzwaniem, zwłaszcza gdy bloki budulcowe są niekompatybilne lub niechciane polimorfy są termodynamicznie faworyzowane nad pożądanymi formami. Opisujemy, w jaki sposób zastosowania wspomaganej rozpuszczalnikiem wymiany łączników, dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego proszku w kapilarnach i aktywacji poprzez suszenie nadkrytycznym CO2 mogą rozwiązać niektóre z tych wyzwań.

Synteza i charakterystyka funkcjonalizowanych struktur metaloorganicznych

Opisana jest synteza zol-żel za pośrednictwem surfaktantu nanosized monosodium titanate, wraz z przygotowaniem odpowiedniego materiału modyfikowanego nadtlenkiem. Przedstawiono również reakcję wymiany jonowej z Au(III).

Synteza i chemia reakcji nanometrażowego tytanianu sodu

Opisano protokół syntezy i charakterystyki koloidów pokrytych cząstkami supramolekularnymi. Te supramolekularne koloidy ulegają samoorganizacji po aktywacji wiązań wodorowych między cząsteczkami zakotwiczonymi na powierzchni przez światło UV.

Synteza i charakterystyka koloidów supramolekularnych

Poznaj enzymatyczną syntezę enancjoczystych kwasów epoksy tłuszczowych z DHA, EPA i kwasu arachidonowego przy użyciu enzymu BM3. Ta metoda umożliwia szybkie i opłacalne uzyskanie znaczących ilości metabolitów.

Enzymatyczna synteza epoksydowanych metabolitów kwasów dokozaheksaenowego, eikozapentaenowego i arachidonowego

Przeglądaj więcej filmów