Name: Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Poznaj protokół połączonych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 w komórkach ssaków. Metoda umożliwia systematyczną, wysokoprzepustową analizę funkcji genów na skalę genomową przy użyciu bibliotek sgRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Genome Canada, Ontario Research Fund i Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).

<ol><li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li>
<li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+CRISPR%2FCas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li>
<li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li>
<li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+execution%2C+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR%2FCas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knock-out+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li>
<li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li>
<li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STBL2%3A+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li>
<li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAGEL%3A+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).</li>
<li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.1101/232736">https://doi.org/10.1101/232736</a> (2017).</li>
<li>Pedregosa, F. V., G,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scikit-learn%3A+Machine+Learning+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li>
<li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213(2011).</li>
<li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Am+I+ready+for+CRISPR%3F+A+user%27s+guide+to+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li>
<li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR%2FCas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knock-out+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554(2014).</li>
<li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li>
<li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li>
<li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators%3A+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Ze względu na prostotę użycia i wysoką giętkość, technologia CRISPR jest powszechnie stosowana jako narzędzie z wyboru do precyzyjnej edycji genomu. Zbiorcze badania przesiewowe CRISPR zapewniają metodę badania tysięcy zaburzeń genetycznych w jednym eksperymencie. W badaniach przesiewowych połączonych biblioteki sgRNA służą jako molekularne kody kreskowe, ponieważ każda sekwencja jest unikalna i jest mapowana do docelowego genu. Izolując genomowe DNA z populacji komórek, geny powodujące fenotyp będący przedmiotem zainter...

CRISPR-Cas, skrót od zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych i nukleazy związanej z CRISPR, składa się z pojedynczego białka nukleazy (np. Cas9) w kompleksie z syntetycznym przewodnikiem RNA (sgRNA). Ten kompleks rybonukleoproteinowy jest ukierunkowany na enzym Cas9, aby indukować dwuniciowe pęknięcia DNA w określonym locus1. Dwuniciowe pęknięcia mogą być naprawione poprzez naprawę kierowaną homologią (HDR) lub, częściej, przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), podatny na błędy mechanizm naprawy, który powoduje insercję i/lub delecje (INDELS), które często zakłócają funkcję genu1. Wydajność i prostota CRISPR umożliwia wcześniej nieosiągalny poziom celowania genomowego, który znacznie przewyższa poprzednie technologie edycji genomu [tj. nukleazy palca cynkowego (ZNF) lub nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALENS), z których obie cierpią z powodu zwiększonej złożoności projektu, niższej wydajności transfekcji i ograniczeń w edycji genów multipleksowych2].
Podstawowa aplikacja badawcza do edycji genomu opartego na pojedynczym przewodniku RNA CRISPR pozwoliła naukowcom efektywnie i niedrogo badać funkcje poszczególnych genów i topologię genetycznych sieci interakcji. Zdolność do wykonywania funkcjonalnych badań przesiewowych całego genomu została znacznie zwiększona dzięki zastosowaniu systemu CRISPR-Cas, szczególnie w porównaniu z wcześniejszymi technologiami zaburzeń genetycznych, takimi jak interferencja RNA (RNAi) i mutageneza pułapek genowych. W szczególności RNAi cierpi z powodu silnych efektów off-target i niepełnego knockdownu, co skutkuje niższą czułością i swoistością w porównaniu z CRISPR3,4,5, podczas gdy metody pułapek genowych są możliwe tylko w komórkach haploidalnych do badań przesiewowych utraty funkcji, ograniczając zakres modeli komórkowych, które można przepytać6. Zdolność CRISPR do generowania całkowitego nokautu genów zapewnia bardziej biologicznie solidny system do badania zmutowanych fenotypów, z niskim poziomem szumów, minimalnymi efektami niepożądanymi i stałą aktywnością we wszystkich odczynnikach5. Biblioteki sgRNA CRISPR-Cas9, które celują w cały ludzki genom, są obecnie szeroko dostępne, umożliwiając jednoczesne generowanie tysięcy nokautów genów w jednym eksperymencie3,7,8,9.
Opracowaliśmy unikalne biblioteki lentiwirusowe sgRNA CRISPR-Cas9 dla całego genomu, zwane bibliotekami Toronto Knock-out (TKO) (dostępne przez Addgene), które są kompaktowe i zoptymalizowane pod kątem sekwencji, aby ułatwić badania przesiewowe genomiki funkcjonalnej w wysokiej rozdzielczości. Najnowsza biblioteka, TKOv3, jest ukierunkowana na ~18 000 ludzkich genów kodujących białka z 71 090 przewodnikami zoptymalizowanymi pod kątem wydajności edycji przy użyciu danych empirycznych10. Dodatkowo, TKOv3 jest dostępny jako jednoskładnikowa biblioteka (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) wyrażająca Cas9 i sgRNA na pojedynczym wektorze, łagodząc potrzebę generowania stabilnych komórek eksprymujących Cas9, umożliwiając nokaut całego genomu w szerokim zakresie typów komórek ssaków. TKOv3 jest również dostępny w wektorze bez Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID# 125517) i może być używany w komórkach, które wyrażają Cas911.
Populacja komórek edytowanych przez CRISPR-Cas9 w całym genomie może być narażona na różne warunki wzrostu, z obfitością sgRNA w czasie określaną ilościowo przez sekwencjonowanie nowej generacji, dostarczając odczytu do oceny wypadania lub wzbogacania komórek z identyfikowalnymi perturbacjami genetycznymi. Biblioteki nokautujące CRISPR można wykorzystać do identyfikacji genów, które po perturbacji powodują defekty sprawności komórkowej, umiarkowaną wrażliwość na leki (np. geny wrażliwe lub oporne), regulują ekspresję białek (np. reporter) lub są wymagane do określonej funkcji szlaku i stanu komórkowego12,13,14. Na przykład badania przesiewowe sprawności różnicowej w linii komórek nowotworowych mogą zidentyfikować zarówno zubożenie lub zmniejszenie onkogenów, jak i wzbogacenie lub zwiększenie liczby genów supresorów nowotworów3,14,15. Podobnie, stosowanie pośrednich dawek leków terapeutycznych może ujawnić zarówno oporność na leki, jak i geny uczulenia16,17.
Dostarczony tutaj jest szczegółowy protokół przesiewowy do badania przesiewowego CRISPR-Cas9 w skali genomu przy użyciu bibliotek Toronto Knock-out (TKOv1 lub v3) w komórkach ssaków od generowania biblioteki, wydajności przesiewowej do analizy danych. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem badań przesiewowych przy użyciu bibliotek Toronto Knock-out, może być stosowany i skalowalny do wszystkich bibliotek puli CRISPR sgRNA.

<table><tbody><tr>Filtr <td></td><td></td><td></td><td>0,22 mikrona</td></tr><tr><td>30&deg; Inkubator płytkowy</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>37&deg; C inkubator</td><td></td><td></td><td></td>z wytrząsaniem</tr><tr><td>37&deg; C, 5% CO2 inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>50X bufor TAE</td><td>BioShop</td><td>TAE222.4</td><td></td></tr><tr><td>6 N Roztwór kwasu solnego</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alamar niebieski</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Nadajnik światła niebieskiego</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, izolacja szoku cieplnego, frakcja V. Min. 98%, klasa biotechnologiczna</td><td>Bioshop</td><td>ALB001.250</td><td></td></tr><tr><td>Modyfikacja Dulbecco Orły Technologie Średniego</td><td>Życia</td><td>11995-065</td><td>Pożywki do hodowli Cel</td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji</td><td>BTX</td><td>45-0134</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BTX</td><td>45-0651</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa elektrokompetentne Endura</td><td>Lucigen</td><td>90293</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu GIBCO</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórki do pakowania</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>zalecany numer przejścia < 15</td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny (polibren)</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Polimer kationowy zwiększający wydajność transdukcji</td></tr> Płytki agarowe <tr><td>heksadimetryny (polibren)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB z karbenicyliną</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka LB z karbenicyliną</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0544L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Zredukowane podłoże surowicy</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu maxi</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G (plazmid kopertowy)</td><td></td><td>Addgene Plasmid #12259</td><td>układ lentiwirusowy</td></tr><tr><td>psPAX2 (plazmid opakowania)</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td>układ lentiwirusowy</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Bisent</td><td>400-160-UG</td><td></td></tr><tr><td>QIAszybki zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR</td><td>Test ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>RNAzywa A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>pożywka regeneracyjna S.O.C</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>SYRB Bezpieczne barwienie żelowe DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Toronto KnockOut CRIPSR (TKOv3) - Cas9 w zestawie</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #90203</td><td>Biblioteka CRISPR obejmująca cały genom, zawiera Cas9, 71,090 sgRNA</td></tr><tr><td>Biblioteka Toronto KnockOut CRIPSR (TKOv3) - non-cas9</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #125517</td><td>Biblioteka CRISPR obejmująca cały genom, bez Cas9, roztwór 71 090 sgRNA</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE), pH8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure agaroza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Wizard zestaw do oczyszczania genomowego DNA</td><td>Odczynnik</td> do transfekcji DNA Promega <td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>06 365 809 001</td><td>Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów</td></tr></tbody></table>

połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na crispr w komórkach ssaków

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Edycja genomu za pomocą systemu CRISPR-Cas znacznie zwiększyła możliwości precyzyjnej edycji genomów różnych organizmów. W kontekście komórek ssaków technologia ta stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu w badaniach genomiki funkcjonalnej. Biblioteki przewodnikowych RNA (sgRNA) ukierunkowane na wszystkie otwarte ramki odczytu pozwalają na łatwe generowanie tysięcy zaburzeń genetycznych w jednej puli komórek, które mogą być badane pod kątem określonych fenotypów, aby implikować funkcję genów i procesy komórkowe w sposób bezstronny i systematyczny. Ekrany CRISPR-Cas zapewniają naukowcom prostą, wydajną i niedrogą metodę odkrywania genetycznych planów fenotypów komórkowych. Co więcej, analiza różnicowa badań przesiewowych przeprowadzonych w różnych liniach komórkowych i pochodzących z różnych typów nowotworów może zidentyfikować geny, które są kontekstowo niezbędne w komórkach nowotworowych, ujawniając potencjalne cele dla określonych terapii przeciwnowotworowych. Przeprowadzanie badań przesiewowych całego genomu w komórkach ludzkich może być zniechęcające, ponieważ wiąże się z obsługą dziesiątek milionów komórek i wymaga analizy dużych zestawów danych. Szczegóły tych ekranów, takie jak charakterystyka linii komórkowych, rozważania dotyczące biblioteki CRISPR oraz zrozumienie ograniczeń i możliwości technologii CRISPR podczas analizy, są często pomijane. Poniżej znajduje się szczegółowy protokół pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych opartych na CRISPR-Cas9 dla całego genomu.

Przegląd schematu badań przesiewowych CRISPR w skali całego genomu
Rysunek 1 przedstawia schemat przebiegu pracy w ramach wspólnego (pooled) screeningu CRISPR, rozpoczynającego się od infekcji komórek docelowych lentiwirusem zawierającym bibliotekę CRISPR przy niskim MOI, aby zapewnić pojedyncze zdarzenia integracji i odpowiednią reprezentację biblioteki (zazwyczaj 200- do 1000-krot...

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Ekrany przesiewowe CRISPR zapewniają naukowcom prostą, wydajną i niedrogą metodę badania funkcji łańcucha na poziomie całego genomu. Zaletą CRISPR jest jego elastyczność w edycji dowolnego genu poprzez prostą zmianę sekwencji prowadzącej. Biblioteki przewodników CRISPR umożliwiają naukowcom badanie całego genomu dowolnego organizmu w jednym eksperymencie w bezstronny, systematyczny sposób.Obecnie badania przesiewowe CRISPR są wykorzystywane do identyfikacji niezbędnych genów w setkach nowotworów u ludzi oraz do mapowania interakcji genetycznych. Badania przesiewowe mogą również kompleksowo profilować leki, aby ujawnić mechanizmy działania leków. Opisane tutaj biblioteki CRISPR są ukierunkowane na komórki ludzkie.Dostępne są jednak biblioteki przewodników ukierunkowane na inne gatunki, takie jak myszy, które można badać w podobny sposób. Przeprowadzanie badań przesiewowych całego genomu w komórkach ludzkich może być w praktyce zniechęcające, ponieważ wiąże się z obsługą dziesiątek milionów komórek i wymaga analizy dużych zestawów danych. Przed uruchomieniem badania przesiewowego upewnij się, że linie komórkowe są dokładnie scharakteryzowane.Obejmuje to znajomość czystości linii komórkowej, czasu podwojenia, skuteczności transdukcji lentiwirusa i wrażliwości na środki selekcji antybiotyków. Demonstracja wizualna dostarczy obrazu tego, jak praktycznie obsługiwać miliony komórek wymaganych na ekranie i śledzić tysiące perturbacji w systematyczny sposób. Procedurę zademonstrują Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh i Ryan Climie, technicy z mojego laboratorium.Zacznij od przekształcenia gotowego plazmidu sgRNA CRISPR w komórki elektrokompetentne i hodowania ich zgodnie ze wskazówkami z manuskryptu. Gdy będziesz gotowy do zbioru kolonii, dodaj siedem mililitrów LB z karbenicyliną do każdej płytki i zeskrob kolonie za pomocą rozsiewacza komórek. Użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść zeskrobane komórki do sterylnej jednolitrowej kolby stożkowej i przepłukać płytkę pięcioma mililitrami LB z karbenicyliną.Ponownie przenieść roztwór płuczący do kolby. Odwiruj komórki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie określ wagę mokrego granulatu. Oczyść DNA plazmidu za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu w skali Maxi lub Mega.Przygotuj komórki do transfekcji, wysiewając 293 limfocyty T i inkubując je przez noc. Następnego dnia przygotuj mieszaninę trzech plazmidów transfekcyjnych na 15-centymetrowe płytki. Oblicz ilość plazmidu potrzebną do jednej transfekcji i przygotuj mieszankę plazmidów dla liczby płytek plus jednej, która ma być transfekowana.Następnie przygotuj odczynnik do transfekcji na bazie lipidów dla każdej transfekcji i pożywki surowicy o zmniejszonej zawartości podwielokrotności do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówkowych dla liczby płytek do transfekcji. Dodać odczynnik do transfekcji, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji dodać DNA do odczynnika do transfekcji w stosunku trzy do jednego odczynnika do transfekcji na mikrogramy kompleksu DNA.Delikatnie wymieszaj roztwór i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut. Dodać mieszaninę transfekcji do komórek pakujących i inkubować je zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. W dniu pobrania wirusa należy sprawdzić komórki pod kątem nieprawidłowej i zrośniętej morfologii jako wskaźnika dobrej produkcji wirusa, a następnie zebrać lentiwirusa, zbierając supernatant i przenosząc go do sterylnej probówki wirówkowej.Zacznij od wybrania zasięgu biblioteki RNA przewodnika CRISPR, który ma być utrzymywany na całym ekranie. Na podstawie pokrycia biblioteki określ liczbę komórek wymaganych do jej utrzymania na przewodnik RNA oraz liczbę komórek wymaganych do infekcji przy MOI 0,3. Następnie określ liczbę płytek wymaganych do zapoczątkowania infekcji, a następnie zbierz i wysiew komórki na każdej płytce.Dodać bromek heksadimetryny do wszystkich płytek i dodać wymaganą objętość wirusa do dwóch płytek do badania przesiewowego i kontroli. Nie dodawaj wirusa, aby go kontrolować. Zastąp ten wolumin nośnikiem.Dokładnie wymieszaj płytki, przechylając je i umieść w inkubatorze, upewniając się, że są wypoziomowane. Zbierz zainfekowane komórki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i zbierz trzy repliki granulek komórkowych z połączonych komórek w celu ekstrakcji genomowego DNA. Odwirować komórki 500 razy g przez pięć minut i przemyć je PBS.Oznacz probówki i liofilizuj granulki komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Podziel pulę zainfekowanych komórek na trzy grupy replikacji, upewniając się, że w każdej replikacji zachowane jest pokrycie biblioteki. Zasiej komórki w gęstości, która normalnie byłaby używana podczas ich rozszerzania.Należy użyć tej samej liczby komórek dla każdej kontrpróby i tej samej łącznej liczby komórek między powtórzeniami. Kontynuuj przechodzenie przez komórki i zbierz trzy powtórzenia osadów komórkowych z każdej repliki połączonych zakażonych komórek, aby uzyskać do 15 do 20 podwojeń komórek. Przy każdym przejściu zbierz komórki ze wszystkich płytek w każdej replikacji.Oznacz każdą kulkę oznaczeniem czasu i powtórzenia. Ustaw PCR1 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu z łączną liczbą 100 mikrogramów genomowego DNA przy 3,5 mikrograma genomowego DNA na 50-mikrolitrową reakcję i ustaw identyczne 50-mikrolitrowe reakcje, aby osiągnąć pożądane pokrycie. Ustaw jedną reakcję w probówce PCR zgodnie ze wskazówkami z manuskryptu.Użyj pięciu mikrolitrów zbiorczego produktu PCR1 jako szablonu i użyj unikalnych kombinacji starterów indeksowych dla każdej pojedynczej próbki, aby umożliwić łączenie próbek z biblioteki sekwencjonowania. Po zakończeniu PCR uruchom produkt z probówki PCR na 2% żelu agarozowym przy niskim napięciu przez jedną do 1 1/2 godziny. Wizualizuj produkt na transiluminatorze światła niebieskiego i wytnij pasmo 200 par zasad.Oczyść DNA i zmierz jego ilość i jakość zarówno za pomocą spektrofotometru, jak i fluorometru. Idealna biblioteka przewodnika RNA powinna zawierać każdy pojedynczy przewodnik RNA reprezentowany w podobnych ilościach. Sekwencjonowanie nowej generacji może być wykorzystane do potwierdzenia, że biblioteka ma ścisły rozkład przewodników RNA.Analiza precyzyjno-kompletna może być wykorzystana do oceny wydajności ekranu. Wysokowydajne badanie przesiewowe powinno odzyskać dużą liczbę niezbędnych genów przy czynniku podstawowym większym niż sześć i wskaźniku fałszywych odkryć mniejszym niż 5%Krzywa precyzja-zapamiętanie powinna mieć ostry łokieć i linię prostą do punktu końcowego. Czynnik Bayesa stanowi miarę pewności, że nokaut genu powoduje defekt dopasowania.Wysokie wyniki wskazują na zwiększoną pewność siebie, podczas gdy niskie wyniki sugerują, że nokaut genu zapewnia korzyści w zakresie wzrostu. Pule nokautujące całego genomu mogą być hodowane w obecności nadmiaru leku w celu poszukiwania genów oporności supresorowej. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe pozytywnej selekcji supresora bloku tymidyny, znormalizowane liczby odczytów dla wszystkich przewodnikowych RNA w T0 są wykreślane w stosunku do średniej znormalizowanej liczby odczytów dla próbek traktowanych tymidyną.Kluczowym szczegółem dla pomyślnego przeprowadzenia badań przesiewowych CRISPR jest utrzymanie dobrej dystrybucji każdego przewodnika RNA, począwszy od transfekcji plazmidu do transdukcji komórek. Zminimalizuje to ryzyko wystąpienia efektów losowych, które mogą zniekształcić reprezentację RNA przewodnika i prowadzić do wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. Po zweryfikowaniu ekranu należy przeprowadzić eksperymenty, aby potwierdzić działania, ponieważ ekran główny identyfikuje tylko potencjalne działania.W zależności od biologii trafień można zastosować różne metody. Edycja CRISPR, w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji, umożliwiła badania przesiewowe utraty funkcji w skali genomu w różnych systemach modeli ludzkich. Ze względu na prostotę CRISPR, tego typu ekrany są obecnie szeroko dostępne dla wszystkich badaczy, co pozwala większej liczbie naukowców na wykorzystanie funkcjonalnych metod genetycznych do badania procesów biologicznych i chorób.

pooled-crispr-based-genetic-screens-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę pulową LentiPlex oraz tradycyjne metody sekwencjonowania w celu identyfikacji genów docelowych sprzyjających przeżyciu komórek. Przedstawiamy sposób przygotowania i dekonwolucji screeningu LentiPlex oraz walidacji uzyskanych wyników.

Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNA (RNAi) z wykorzystaniem puli lentiwirusowych shRNA mogą być narzędziem do wykrywania terapeutycznie istotnych syntetycznych celów śmiertelnych w nowotworach złośliwych. Zapewniamy zbiorcze podejście do badań przesiewowych shRNA w celu zbadania efektorów epigenetycznych w ostrej białaczce szpikowej (AML).

Zbiorcze badania przesiewowe biblioteki shRNA w celu identyfikacji czynników modulujących fenotyp oporności na leki

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

Poznaj protokół połączonych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 w komórkach ssaków. Metoda umożliwia systematyczną, wysokoprzepustową analizę funkcji genów na skalę genomową przy użyciu bibliotek sgRNA.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów