Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Ekrany przesiewowe CRISPR zapewniają naukowcom prostą, wydajną i niedrogą metodę badania funkcji łańcucha na poziomie całego genomu. Zaletą CRISPR jest jego elastyczność w edycji dowolnego genu poprzez prostą zmianę sekwencji prowadzącej. Biblioteki przewodników CRISPR umożliwiają naukowcom badanie całego genomu dowolnego organizmu w jednym eksperymencie w bezstronny, systematyczny sposób.

Obecnie badania przesiewowe CRISPR są wykorzystywane do identyfikacji niezbędnych genów w setkach nowotworów u ludzi oraz do mapowania interakcji genetycznych. Badania przesiewowe mogą również kompleksowo profilować leki, aby ujawnić mechanizmy działania leków. Opisane tutaj biblioteki CRISPR są ukierunkowane na komórki ludzkie.

Dostępne są jednak biblioteki przewodników ukierunkowane na inne gatunki, takie jak myszy, które można badać w podobny sposób. Przeprowadzanie badań przesiewowych całego genomu w komórkach ludzkich może być w praktyce zniechęcające, ponieważ wiąże się z obsługą dziesiątek milionów komórek i wymaga analizy dużych zestawów danych. Przed uruchomieniem badania przesiewowego upewnij się, że linie komórkowe są dokładnie scharakteryzowane.

Obejmuje to znajomość czystości linii komórkowej, czasu podwojenia, skuteczności transdukcji lentiwirusa i wrażliwości na środki selekcji antybiotyków. Demonstracja wizualna dostarczy obrazu tego, jak praktycznie obsługiwać miliony komórek wymaganych na ekranie i śledzić tysiące perturbacji w systematyczny sposób. Procedurę zademonstrują Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh i Ryan Climie, technicy z mojego laboratorium.

Zacznij od przekształcenia gotowego plazmidu sgRNA CRISPR w komórki elektrokompetentne i hodowania ich zgodnie ze wskazówkami z manuskryptu. Gdy będziesz gotowy do zbioru kolonii, dodaj siedem mililitrów LB z karbenicyliną do każdej płytki i zeskrob kolonie za pomocą rozsiewacza komórek. Użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść zeskrobane komórki do sterylnej jednolitrowej kolby stożkowej i przepłukać płytkę pięcioma mililitrami LB z karbenicyliną.

Ponownie przenieść roztwór płuczący do kolby. Odwiruj komórki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie określ wagę mokrego granulatu. Oczyść DNA plazmidu za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu w skali Maxi lub Mega.

Przygotuj komórki do transfekcji, wysiewając 293 limfocyty T i inkubując je przez noc. Następnego dnia przygotuj mieszaninę trzech plazmidów transfekcyjnych na 15-centymetrowe płytki. Oblicz ilość plazmidu potrzebną do jednej transfekcji i przygotuj mieszankę plazmidów dla liczby płytek plus jednej, która ma być transfekowana.

Następnie przygotuj odczynnik do transfekcji na bazie lipidów dla każdej transfekcji i pożywki surowicy o zmniejszonej zawartości podwielokrotności do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówkowych dla liczby płytek do transfekcji. Dodać odczynnik do transfekcji, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji dodać DNA do odczynnika do transfekcji w stosunku trzy do jednego odczynnika do transfekcji na mikrogramy kompleksu DNA.

Delikatnie wymieszaj roztwór i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut. Dodać mieszaninę transfekcji do komórek pakujących i inkubować je zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. W dniu pobrania wirusa należy sprawdzić komórki pod kątem nieprawidłowej i zrośniętej morfologii jako wskaźnika dobrej produkcji wirusa, a następnie zebrać lentiwirusa, zbierając supernatant i przenosząc go do sterylnej probówki wirówkowej.

Zacznij od wybrania zasięgu biblioteki RNA przewodnika CRISPR, który ma być utrzymywany na całym ekranie. Na podstawie pokrycia biblioteki określ liczbę komórek wymaganych do jej utrzymania na przewodnik RNA oraz liczbę komórek wymaganych do infekcji przy MOI 0,3. Następnie określ liczbę płytek wymaganych do zapoczątkowania infekcji, a następnie zbierz i wysiew komórki na każdej płytce.

Dodać bromek heksadimetryny do wszystkich płytek i dodać wymaganą objętość wirusa do dwóch płytek do badania przesiewowego i kontroli. Nie dodawaj wirusa, aby go kontrolować. Zastąp ten wolumin nośnikiem.

Dokładnie wymieszaj płytki, przechylając je i umieść w inkubatorze, upewniając się, że są wypoziomowane. Zbierz zainfekowane komórki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i zbierz trzy repliki granulek komórkowych z połączonych komórek w celu ekstrakcji genomowego DNA. Odwirować komórki 500 razy g przez pięć minut i przemyć je PBS.

Oznacz probówki i liofilizuj granulki komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Podziel pulę zainfekowanych komórek na trzy grupy replikacji, upewniając się, że w każdej replikacji zachowane jest pokrycie biblioteki. Zasiej komórki w gęstości, która normalnie byłaby używana podczas ich rozszerzania.

Należy użyć tej samej liczby komórek dla każdej kontrpróby i tej samej łącznej liczby komórek między powtórzeniami. Kontynuuj przechodzenie przez komórki i zbierz trzy powtórzenia osadów komórkowych z każdej repliki połączonych zakażonych komórek, aby uzyskać do 15 do 20 podwojeń komórek. Przy każdym przejściu zbierz komórki ze wszystkich płytek w każdej replikacji.

Oznacz każdą kulkę oznaczeniem czasu i powtórzenia. Ustaw PCR1 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu z łączną liczbą 100 mikrogramów genomowego DNA przy 3,5 mikrograma genomowego DNA na 50-mikrolitrową reakcję i ustaw identyczne 50-mikrolitrowe reakcje, aby osiągnąć pożądane pokrycie. Ustaw jedną reakcję w probówce PCR zgodnie ze wskazówkami z manuskryptu.

Użyj pięciu mikrolitrów zbiorczego produktu PCR1 jako szablonu i użyj unikalnych kombinacji starterów indeksowych dla każdej pojedynczej próbki, aby umożliwić łączenie próbek z biblioteki sekwencjonowania. Po zakończeniu PCR uruchom produkt z probówki PCR na 2% żelu agarozowym przy niskim napięciu przez jedną do 1 1/2 godziny. Wizualizuj produkt na transiluminatorze światła niebieskiego i wytnij pasmo 200 par zasad.

Oczyść DNA i zmierz jego ilość i jakość zarówno za pomocą spektrofotometru, jak i fluorometru. Idealna biblioteka przewodnika RNA powinna zawierać każdy pojedynczy przewodnik RNA reprezentowany w podobnych ilościach. Sekwencjonowanie nowej generacji może być wykorzystane do potwierdzenia, że biblioteka ma ścisły rozkład przewodników RNA.

Analiza precyzyjno-kompletna może być wykorzystana do oceny wydajności ekranu. Wysokowydajne badanie przesiewowe powinno odzyskać dużą liczbę niezbędnych genów przy czynniku podstawowym większym niż sześć i wskaźniku fałszywych odkryć mniejszym niż 5%Krzywa precyzja-zapamiętanie powinna mieć ostry łokieć i linię prostą do punktu końcowego. Czynnik Bayesa stanowi miarę pewności, że nokaut genu powoduje defekt dopasowania.

Wysokie wyniki wskazują na zwiększoną pewność siebie, podczas gdy niskie wyniki sugerują, że nokaut genu zapewnia korzyści w zakresie wzrostu. Pule nokautujące całego genomu mogą być hodowane w obecności nadmiaru leku w celu poszukiwania genów oporności supresorowej. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe pozytywnej selekcji supresora bloku tymidyny, znormalizowane liczby odczytów dla wszystkich przewodnikowych RNA w T0 są wykreślane w stosunku do średniej znormalizowanej liczby odczytów dla próbek traktowanych tymidyną.

Kluczowym szczegółem dla pomyślnego przeprowadzenia badań przesiewowych CRISPR jest utrzymanie dobrej dystrybucji każdego przewodnika RNA, począwszy od transfekcji plazmidu do transdukcji komórek. Zminimalizuje to ryzyko wystąpienia efektów losowych, które mogą zniekształcić reprezentację RNA przewodnika i prowadzić do wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. Po zweryfikowaniu ekranu należy przeprowadzić eksperymenty, aby potwierdzić działania, ponieważ ekran główny identyfikuje tylko potencjalne działania.

W zależności od biologii trafień można zastosować różne metody. Edycja CRISPR, w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji, umożliwiła badania przesiewowe utraty funkcji w skali genomu w różnych systemach modeli ludzkich. Ze względu na prostotę CRISPR, tego typu ekrany są obecnie szeroko dostępne dla wszystkich badaczy, co pozwala większej liczbie naukowców na wykorzystanie funkcjonalnych metod genetycznych do badania procesów biologicznych i chorób.