Name: Oczyszczanie płytek krwi z krwi myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Naucz się oczyszczania płytek krwi z krwi myszy przy użyciu gradientu johexolu i wirowania. Ta metoda umożliwia analizę cytometrią przepływową i mikroskopią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze Cincinnati Children's Research Foundation oraz grant University of Cincinnati Pilot Translational dla M.N. Chcielibyśmy podziękować Cincinnati Children's Hospital Research Flow Cytometry Core za ich usługi.

Pobieranie krwi myszy powinno odbywać się za zgodą odpowiedniej instytucjonalnej komisji ds. opieki i użytkowania zwierząt.
UWAGA: Protokół oczyszczania płytek krwi jest opisany na schemacie przepływu w Rysunek 1.
1. Zbieranie krwi
<ol>
	<li>Dodaj 25 μl 3,2% cytrynianu sodu (pH 7,2) jako antykoagulantu i 0,4 mM Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) w probówce polipropylenowej.</li>
	<li>Pobrać około 200 μl krwi od myszy C57BL/6 za pomocą krwawienia zaoczodołowego. 
	UWAGA: Krew można pobrać z każdego rodzaju szczepu myszy, niezależnie od wieku i płci.
	<ol>
		<li>Użyj 2 ml izofluranu w dowolnym rodzaju komory, aby znieczulić mysz. 
		nuta: Głębokość znieczulenia jest sprawdzana przez oznaki zwiększonego oddychania i zmniejszonego ruchu. Mysz nie powinna reagować na ruch komory anestezjologicznej ani na dotykanie. Jeśli mysz reaguje na ruch lub obsługę, wymaga więcej czasu na utrzymanie w komorze anestezjologicznej.</li>
		<li>1.2.2 Otwórz prawą lub lewą powiekę myszy i włóż rurkę kapilarną o średnicy 7,5 cm (0,12 cm) do splotu naczyniowego oka.</li>
		<li>Przekręć rurkę kapilarną o pół obrotu, wywierając nacisk na rurkę kapilarną, aby rozbić naczynia i zainicjować przepływ krwi. Trzymać zwierzę do góry nogami nad fiolką do pobrania, która ma być napełniona kapilarno.</li>
		<li>Po pobraniu odpowiedniej objętości krwi wyjmij rurkę kapilarną i zamknij oko, wywierając lekki nacisk przez 30 s na powiekę gazą. Po zatrzymaniu krwawienia umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj, czy nie ma krwawienia.</li>
		<li>Sprawdź oczy pod kątem urazu 1-2 dni po krwawieniu zaoczodołowym. Usunąć z badania wszystkie myszy wykazujące oznaki znacznego urazu oka w wyniku zabiegu i poddać się eutanazji. 
		nuta: Mysz nie powinna być poddawana żadnemu leczeniu, które może zahamować płytki krwi przez co najmniej dwa tygodnie przed pobraniem krwi. Próbka krwi musi być wykorzystana do oczyszczenia płytek krwi w ciągu jednej godziny od wykrwawienia myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie płytek krwi
UWAGA: Oczyszczanie płytek krwi powinno odbywać się w temperaturze pokojowej, aby zapobiec ich degradacji. Upewnij się, że temperatura odczynników i narzędzi wynosi od 18 do 22 °C. Aby zapobiec degradacji płytek krwi, podczas zabiegu należy unikać szybkiego pipetowania i energicznego potrząsania.
<ol>
	<li>Dodaj 600 μl pożywki gradientowej joheksolu (12% proszku joheksolu w 0,85% chlorku sodu, 5 mM trycyny, pH 7,2)11 do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Powoli dodać 200 μl próbki krwi wzdłuż boku probówki na wierzchu gradientowego podłoża z końcówką pipety o szerokim otworze, tak aby krew i pożywka joheksolu nie mieszały się (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Odwirować probówkę zawierającą próbkę o masie 400 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C w obracającym się wirniku kubełkowym z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem.</li>
	<li>Zebrać większość warstwy bogatopłytkowej i niewielką część warstwy ubogiej w płytki krwi (łącznie 300 do 400 μl) za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze, nie naruszając warstw RBC i WBC (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2B). Przenieść próbkę płytek krwi do nowej probówki. 
	nuta: Jeśli liczba płytek krwi we krwi jest mniejsza lub używana jest mniejsza objętość krwi, warstwa bogatopłytkowa i warstwa uboga w płytki krwi mogą być postrzegane jako pojedyncza warstwa.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS do próbki płytek krwi, wymieszać przez odwrócenie i odwirować przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C w obracającym się wirniku kubełkowym. Całkowicie odrzucić roztwór i dodać 200 μl PBS w celu ponownego zawieszenia płytek krwi za pomocą łagodnego pipetowania. 
	nuta: Ten etap jest opcjonalny, ponieważ usuwa pożywkę gradientową i białka osocza oraz zwiększa wrażliwość płytek krwi na agonistów, takich jak trombina. Ponieważ różne wirówki mają różne programy, powolne przyspieszanie/zwalnianie można określić, czytając instrukcję obsługi wirówki.</li>
	<li>Przenieść 30 μl tej próbki do nowej probówki w celu policzenia płytek krwi. Pozostałe płytki krwi można wykorzystać do testów biochemicznych i fizjologicznych, takich jak aktywacja płytek krwi, agregacja, uwalnianie granulek itp.</li>
	<li>W celu ekstrakcji RNA lub białka odwirować próbkę płytek krwi o masie 800 x g przez 10 minut w celu osadzenia płytek krwi. Całkowicie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Dodaj żądaną objętość RNA lub buforu do lizy białek, aby zlizować płytki krwi.</li>
</ol>
3. Liczenie płytek krwi
<ol>
	<li>Policz pełne krwinki bez rozcieńczania i oczyszczone płytki krwi (rozcieńczone 2 do 5-krotnie PBS) za pomocą automatycznego analizatora komórek. Do liczenia należy użyć próbek o objętości od 30 do 50 μl.</li>
	<li>Obliczyć całkowitą liczbę płytek krwi, mnożąc ją przez objętość próbki.</li>
	<li>Obliczyć procentowy udział w uzysku/odzysku oczyszczonych płytek krwi.</li>
	<li>Policz erytrocyty i krwinki białe w oczyszczonej próbce płytek krwi (rozcieńczonej 50 do 100 razy PBS) za pomocą hemocytometru i mikroskopu.</li>
</ol>
4. Aktywacja płytek krwi
<ol>
	<li>W probówce dodać od 1 do 2 milionów oczyszczonych płytek krwi w objętości do 100 μl buforu barwiącego (PBS z 2% płodową surowicą bydlęcą, FBS).</li>
	<li>W przypadku wielokrotnej liczby próbek należy wykonać główną mieszaninę przeciwciał z 1 μl (0,5 mg/ml) następujących składników: PE-Cy7 szczurzy anty-mysi TER 119, PE szczur anty-mysi CD45, FITC szczur anty-mysi CD41 i APC szczur anty-mysz/ludzki CD62P (selektyna P) w celu wykrycia odpowiednio RBC, WBC, płytek krwi i aktywowanych płytek krwi. Dodaj mieszankę wzorcową do probówek w celu zabarwienia komórek. Nie należy dodawać trombiny.</li>
	<li>W innej probówce dodaj od 1 do 2 milionów oczyszczonych płytek krwi w objętości do 100 μl buforu barwiącego i 0,4 mM peptydu GPRP. Dodaj trombinę, aby aktywować płytki krwi i wybarwić komórki zgodnie z krokiem 4.2. 
	nuta: GPRP należy dodać do próbki przed dodaniem trombiny, aby zapobiec tworzeniu się agregatów lub skrzepów poprzez aktywację płytek krwi. Stężenie trombiny powinno być zoptymalizowane, aby uzyskać dobrą aktywację płytek krwi. Po aktywacji płytek krwi liczba zdarzeń zmniejsza się podczas pobierania próbek za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Jako kontrolę pozytywną dodać 1 μl krwi pełnej do 100 μl buforu barwiącego w probówce i 0,4 mM peptydu GPRP. Dodaj trombinę, aby aktywować płytki krwi. Jako kontrolę ujemną dodać 1 μl krwi pełnej do 100 μl buforu barwiącego. Nie dodawać trombiny do próbki kontroli ujemnej. Wybarwić komórki zgodnie z krokiem 4.2.</li>
	<li>W celu kontroli izotypu cytometrii przepływowej oznacz 5 probówek niebarwionym, PE-Cy7, PE, FITC i APC. Dodać 100 μl buforu barwiącego, 1 μl krwi i 1 μl odpowiedniego przeciwciała do znakowanych probówek, aby wybarwić komórki.</li>
	<li>Inkubować próbki do barwienia przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć próbki, dodając 1 ml buforu barwiącego do każdej probówki. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzuć bufor barwiący, nie usuwając osadu.</li>
	<li>Dodać 300 μl buforu barwiącego do każdej probówki, delikatnie wymieszać i przenieść do probówki FACS. Zabarwione próbki należy przechowywać w ciemności do czasu analizy za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>
5. Analizy płytek krwi za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Utwórz nowy eksperyment i wygeneruj wykresy punktowe rozproszenia logarytmicznego do przodu i po stronie logarytmu oraz przypisz bramki dla populacji Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (płytki krwi) i CD62P APC (aktywowane płytki krwi) zgodnie ze strategią bramkowania wybraną dla eksperymentu w oprogramowaniu FACS DIVA.
	<ol>
		<li>Otwórz hierarchię populacji, wybierając opcję Pokaż hierarchię populacji na karcie Populacje. Edytuj hierarchię populacji, sprawdzając strategię bramkowania i poprawnie zmieniając nazwy bram</li>.
		<li>Otwórz widok statystyk, wybierając pozycję Utwórz widok statystyk. Edytuj widok statystyk zgodnie z preferencjami użytkownika, klikając prawym przyciskiem myszy widok statystyk i wybierając opcję Edytuj widok statystyk.</li>
		<li>Wybierz kolor dla każdej bramy, który poprawi wizualny aspekt układu, klikając dwukrotnie pole odpowiadające populacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oknie Cytometr kliknij na zakładkę Parametry i dostosuj napięcia dla parametrów, aby zobrazować interesującą nas populację na powierzchniach.</li>
	<li>Dostosuj napięcia dla każdego z parametrów, aby można było odróżnić populację ujemną od populacji dodatniej. Przed zarejestrowaniem próbek do kontroli kompensacyjnej należy sprawdzić, czy jednolicie barwione kontrole dodatnie są w skali (upewnić się, że dodatnie piki są widoczne i nie są zbyt daleko w prawo). 
	nuta: Jeśli dodatnie piki są poza skalą, napięcia należy dostosować, aby zobaczyć dodatnie populacje.</li>
	<li>Zapisz jednokolorowe barwione komórki do kontroli kompensacji (niebarwione, PE-Cy7, PE, FITC i APC).</li>
	<li>Jeśli bramki kontroli dodatniej nie są prawidłowo ustawione, wyreguluj je, zmieniając napięcia.</li>
	<li>Przejdź do sekcji Eksperyment > konfiguracji wynagrodzenia > Oblicz wynagrodzenie. Wybierz opcję Zastosuj tylko w wyświetlonym oknie.</li>
	<li>Przełącz się na arkusz globalny, klikając przycisk przełączania w lewym górnym rogu okna arkusza.</li>
	<li>Załaduj próbkę kontroli pozytywnej i uzyskaj wystarczającą liczbę komórek, aby wyregulować kompensację i bramki.</li>
	<li>Ponownie załadować próbkę i sprawdzić, czy każdy wykres przedstawia oczekiwaną populację komórek na podstawie przeciwciała barwionego fluorochromem. Pozyskaj i zarejestruj 100 000 zdarzeń dla próbek krwi pełnej i 10 000 zdarzeń dla oczyszczonych płytek krwi. Ładuj próbki jedna po drugiej, aż akwizycja zostanie zakończona.</li>
	<li>Analizuj dane cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania z odpowiednimi wykresami i bramkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)</li>
</ol>

<ol><li>de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+platelet-based+control+of+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into platelet-based control of coagulation.</a> Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).</li>
<li>Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+developmental+dance+of+the+megakaryocyte%3A+a+review+of+the+cellular+and+molecular+processes+mediating+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).</li>
<li>Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%3A+signaling+cells+in+the+immune+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Platelets: signaling cells in the immune continuum.</a> Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).</li>
<li>Nami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+platelets+and+PBMC%3A+New+evidence+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing.</a> Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).</li>
<li>Mancuso, M. E., Santagostino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%3A+much+more+than+bricks+in+a+breached+wall%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Platelets: much more than bricks in a breached wall.</a> British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).</li>
<li>Hampton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%27+Role+in+Adaptive+Immunity+May+Contribute+to+Sepsis+and+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock.</a> Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).</li>
<li>Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+blood+platelets+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of blood platelets in tumor angiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).</li>
<li>Menter, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+%26%2334%3Bfirst+responders%26%2334%3B+in+wound+response%2C+cancer%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Platelet &#34;first responders&#34; in wound response, cancer, and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+platelet-specific+mRNA+by+real-time+PCR+after+laser-assisted+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).</li>
<li>Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-pure+platelet+isolation+from+canine+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood.</a> BioMed Central Veterinary Research. 9, 144(2013).</li>
<li>Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+rapid%2C+one-step+method+for+the+isolation+of+platelets+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood.</a> Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).</li>
<li>Noisakran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bone+marrow+cells+by+dengue+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematolology%22%5BJournal%5D)">Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo.</a> Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).</li>
<li>Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nycodenz%3A+a+new+nonionic+iodinated+gradient+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium.</a> Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).</li>
<li>Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+major+subcellular+organelles+from+mouse+liver+using+Nycodenz+gradients+without+the+use+of+an+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge.</a> Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).</li>
<li>Milligan, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lethal+model+of+disseminated+dengue+virus+type+1+infection+in+AG129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+rescue+of+a+Bernard-Soulier+mouse+model+to+study+platelet+glycoprotein+Ibbeta+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).</li>
<li>Bergmeier, W., Boulaftali, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+method+to+study+platelet+function+in+mouse+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease.</a> Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).</li>
<li>Bakchoul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+use+of+the+non-obese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficiency+mouse+model+in+autoimmune+and+drug-induced+thrombocytopenia%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).</li>
<li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection%2C+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. , 1-10 (2018).</li>
<li>Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+murine+platelet+structure%2C+function%2C+assays%2C+and+genetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).</li>
<li>Birschmann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+functional+highly+purified+human+platelets+for+the+identification+of+new+proteins+of+the+IPP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway.</a> Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zwykle płytki krwi są izolowane przez wirowanie z niską prędkością, co daje osocze bogatopłytkowe, które zawiera znaczną liczbę komórek krwi, szczątków komórkowych i białek osocza, które mogą zakłócać testy biochemiczne i fizjologiczne oraz wymagają dalszego oczyszczania21. Dlatego ważne jest, aby zastosować szybką i prostą metodę, która może dać czyste płytki krwi bez większych zanieczyszczeń. Przedstawiony tutaj protokół opisuje oczyszczanie płytek krwi z krwi myszy za pomocą pożywki gradientowe...

Płytki krwi to składnik krwi, który pełni funkcję inicjatora krzepnięcia krwi w odpowiedzi na uszkodzenie naczynia krwionośnego. Gromadzą się w miejscu urazu, aby zatkać ścianę naczynia1. Płytki krwi to bezjądrzaste fragmenty cytoplazmy pochodzące z megakariocytów szpiku kostnego pod wpływem trombopoetyny i wchodzące do krążenia2. Uważa się, że są one metabolicznie aktywne i zdolne do wyczuwania środowiska zewnątrzkomórkowego poprzez aktywację wewnątrzkomórkowych kaskad sygnałowych, które powodują rozprzestrzenianie się płytek krwi, agregację i tworzenie czopów hemostatycznych1,3. Oprócz hemostazy/zakrzepicy i gojenia się ran4, płytki krwi odgrywają ważną rolę w reakcjach zapalnych gospodarza, angiogenezie i przerzutach3,5,6,7,8.
Płytki krwi są oczyszczane z krwi w celu zbadania ich właściwości biochemicznych i fizjologicznych, które powinny być wolne od innych składników krwi. Ponieważ czerwone krwinki (RBC) i białe krwinki (WBC) zawierają znacznie więcej RNA i białek niż płytki krwi9,10, obecność nawet niewielkiej liczby tych komórek może zakłócać analizy transkryptomiczne i proteomiczne RNA i białek pochodzących z płytek krwi. Odkryliśmy, że oczyszczone płytki krwi aktywowane przeciwciałami trombinowymi, takimi jak anty-GPIIb/IIIa (JON/A) i anty-P-selektyna, skuteczniej niż płytki krwi pełnej.
Ponieważ płytki krwi są delikatne, ważne jest, aby traktować próbki tak łagodnie, jak to tylko możliwe. Jeśli płytki krwi są aktywowane, uwalniają zawartość granulek i ostatecznie ulegają degradacji. Dlatego, aby zachować nienaruszone właściwości funkcjonalne płytek krwi, ważne jest utrzymanie stanu spoczynku płytek krwi podczas izolacji. Kilka protokołów opisało izolację płytek krwi od ludzi, psów, szczurów i naczelnych za pomocą różnych metod1,10,11,12. Niektóre metody wymagają wielu etapów, takich jak pobieranie osocza bogatopłytkowego przez wirowanie, filtracja przez kolumnę separacyjną, negatywna selekcja płytek krwi z przeciwciałami specyficznymi dla RBC i WBC sprzężonymi z kulkami magnetycznymi i tak dalej, które są czasochłonne i mogą degradować płytki krwi i ich zawartość.
Ford i jego koledzy opisali oczyszczanie płytek krwi z ludzkiej krwi za pomocą iohexol medium11. W tej metodzie wykorzystuje się podobną objętość próbki krwi i pożywki podczas oczyszczania. Ponieważ ludzie wytwarzają większą objętość krwi, oczyszczenie płytek krwi jest stosunkowo łatwe.
Iohexol to uniwersalne podłoże obojętne o gradiencie gęstości, które jest swobodnie rozpuszczalne w wodzie i używane do frakcjonowania kwasów nukleinowych, białek, polisacharydów i nukleoprotein13,14. Ma niską osmolalność i jest nietoksyczny, dzięki czemu jest idealnym podłożem do oczyszczania nienaruszonych żywych komórek11. Jest to medium niezawierające cząstek stałych; Dlatego rozkład komórek w gradiencie można określić za pomocą hemocytometru, cytometru przepływowego lub spektrofotometru. Nie zakłóca większości reakcji enzymatycznych lub chemicznych komórek lub fragmentów komórkowych po rozcieńczeniu.
Mysz służy jako ważny model zwierzęcy dla wielu chorób ludzkich15,16,17,18. Istnieje kilka opublikowanych artykułów, które opisują oczyszczanie płytek krwi u myszy19,20. Jednak mysz daje stosunkowo mniejszą objętość krwi, co utrudnia oczyszczanie płytek krwi. Jeżeli stosuje się tę samą małą objętość pożywki gradientowej i próbek krwi, warstwa płytek krwi nie może być wyraźnie oddzielona od warstwy RBC-WBC po odwirowaniu. W tym artykule opisaliśmy szybką i prostą metodę oczyszczania płytek krwi myszy z trzykrotnie większą pożywką o gradientowym poziomie ioheksolu w stosunku do objętości próbki krwi i wirowaniem z niską prędkością. Aktywowaliśmy również oczyszczone płytki krwi trombiną i zbadaliśmy ich jakość za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii.

<table><tbody><tr><td>APC szczur anty-mysz/człowiek CD62P (P-selektyna)</td><td>Thermoscientific</td><td>17-0626-82</td><td>Marker aktywacji płytek</td></tr><tr><td>krwi Rurka Eppendorfa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-166</td><td>Probówka do centyfugi</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td>Analiza płytek krwi i krwi pełnej</td></tr><tr>Rurka<td>FACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Rurki przepływowe cytomterium</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Składnik buforu barwiącego</td></tr><tr><td>FITC szczur anty-mysi CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td>Marker płytek krwi</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td>Analiza płytek krwi i krwi pełnej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo</td><td>FlowJo, Inc.</td><td>Pozycja pozakatalogowa</td><td>Analiza płytek krwi i krwi pełnej</td></tr><tr><td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td><td>EMD Millipore</td><td>03-34-0001</td><td>Zapobiegaj tworzeniu się skrzepów płytek krwi</td></tr><tr><td>Hematokryt Rurka kapilarna</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>Rurka kapilarna do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Hemavet</td><td>Drew Scientific</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td>Analizator komórek krwi</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>Komora do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Służy do znieczulania myszy</td></tr><tr><td>Mikroskop (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td>Monitorowanie i zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Nycodenz (Histodenz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td>Gradient medium</td></tr><tr><td>PE szczur anty-mysz CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561087</td><td>marker WBC</td></tr><tr><td>PE-Cy7 szczur anty-mysz TER 119</td><td>BD Biosciences</td><td>557853</td><td>marker RBC</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 200 i mikro; L, szerokootworowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-1A</td><td>Przenoszenie próbek krwi i płytek</td></tr><tr><td>krwi Końcówki do pipet 1000 &micro; L, szerokootworowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-2C</td><td>Przenoszenie próbek krwi i płytek krwi</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>Bufor do przemywania i rozcieńczania</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-688-26</td><td>Antykoagulant</td></tr><tr><td>Bufor do barwienia</td><td>In-house</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td>Bufor do płukania i rozcieńczania</td></tr><tr><td>Woda Steile</td><td>In-house</td><td>Pozycja pozakatalogowa</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Wirówka z wirnikiem kubełkowym wahadłowym</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Badania enzymatyczne Laboratoty</td><td>HT 1002a</td><td>Agonista aktywacji płytek</td></tr><tr><td>krwi Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td>Bufor do podłoża Nycodenz</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie płytek krwi z krwi myszy

Purification of Platelets from Mouse Blood

Płytki krwi są oczyszczane z pełnej krwi w celu zbadania ich właściwości funkcjonalnych, które powinny być wolne od czerwonych krwinek (RBC), białych krwinek (WBC) i białek osocza. Opisujemy tutaj oczyszczanie płytek krwi z krwi myszy przy użyciu trzykrotnie większej pożywki o gradiacji ioheksolu w stosunku do objętości próbki krwi i odwirowanie w wahadłowym wirniku kubełkowym przy 400 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C. Odzysk/wydajność oczyszczonych płytek krwi wynosiła 18,2-38,5%, a oczyszczone płytki krwi znajdowały się w stanie spoczynku, który nie zawierał znaczącej liczby krwinek czerwonych i krwinek białych. Oczyszczone płytki krwi poddane trombiny wykazały do 93% aktywacji, co wskazuje na ich żywotność. Potwierdziliśmy, że oczyszczone płytki krwi są wystarczająco czyste za pomocą cytometrii przepływowej i oceny mikroskopowej. Te płytki krwi mogą być używane do ekspresji genów, aktywacji, uwalniania granulek, agregacji i testów adhezji. Metoda ta może być stosowana również do oczyszczania płytek krwi z krwi innych gatunków.

Podsumowanie procesu oczyszczania płytek krwi przedstawiono na schemacie blokowym (Rysunek 1). Kroki obejmują pobranie krwi z myszy metodą upustu z splotu zatwarnia w obecności przeciwkrzepliwego środka, nałożenie próbki krwi na podłoże gradientowe z ioheksolą oraz wirowanie w rotorze z koszyczkami wahadłowymi przy 40 x g przez 20 min w temperaturze 20 °C. Jakość oczyszczonych płytek krwi oceniono za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej po barwieniu przeciwciałami w celu wyk...

Tutaj krew myszy została pobrana w obecności antykoagulantu. Płytki krwi oczyszczono za pomocą pożywki gradientowej joheksolu przy użyciu wirowania z niską prędkością. Płytki krwi aktywowano trombiną w celu zbadania, czy są one zdolne do życia. Jakość oczyszczonych płytek krwi analizowano za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Oczyszczanie płytek krwi z krwi myszy

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

Płytki krwi powinny być wolne od komórek krwi i białek podczas badania ich właściwości biochemicznych i fizjologicznych. Dlatego opracowaliśmy protokół oczyszczania płytek krwi z krwi myszy. Technika ta może oczyszczać płytki krwi za pomocą wirowania o średniej i niskiej prędkości gradientu joheksolu, co skutkuje wyraźnym oddzieleniem płytek krwi od innych składników krwi.Aby oczyścić płytki krwi, użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby powoli nałożyć 200 mikrolitrów świeżo pobranej krwi pełnej po boku 1,5-mililitrowej probówki na 600 mikrolitrów gradientowej pożywki joheksolowej bez mieszania. Po odwirowaniu w wirniku z odchylanym wiadrem w celu wyizolowania płytek krwi, należy użyć nowej końcówki do pipet o szerokim otworze, aby zebrać większość warstwy bogatopłytkowej i niewielką część warstwy ubogiej w płytki krwi bez zasysania warstwy krwinek białych lub krwinek czerwonych. Dodaj próbkę płytek krwi do nowej probówki i dodaj jeden mililitr PBS do płytek krwi.Wymieszaj płytki krwi przez odwrócenie przed wykonaniem kolejnego wirowania. Następnie ponownie zawiesić granulat w 200 mikrolitrach PBS z łagodnym pipetowaniem. W celu aktywacji płytek krwi należy przenieść jedną do dwóch razy od 10 do sześciu płytek krwi do nowej probówki zawierającej 100 mikrolitrów buforu barwiącego.Dodaj jeden do dwóch razy 10 do sześciu płytek krwi do innej probówki zawierającej 100 mikrolitrów buforu barwiącego uzupełnionego 0,4-milimolowym peptydem GPRP. Dodaj trombinę do probówki z peptydem GPRP, aby aktywować płytki krwi, a następnie dodaj interesujący koktajl przeciwciał do obu probówek. Jako kontrolę pozytywną dodaj jeden mikrolitr krwi pełnej do 100 mikrolitrów buforu barwiącego w probówce zawierającej 0,4-milimolowy peptyd GPRP i dodaj trombinę, aby aktywować te płytki krwi.Jako kontrolę ujemną dodaj jeden mikrolitr krwi pełnej do 100 mikrolitrów buforu barwiącego. Następnie wybarwić obie probówki kontrolne koktajlem przeciwciał. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej w ciemności umyj próbki jednym mililitrem świeżego buforu barwiącego na probówkę.Ponownie zawiesić granulki w 300 mikrolitrach świeżego buforu do barwienia. Następnie przenieś próbki komórek do indywidualnych probówek do analizy cytometrii przepływowej chronionych przed światłem. Aby przeanalizować płytki krwi za pomocą cytometrii przepływowej, utwórz nowy eksperyment i wygeneruj logarytmiczne wykresy punktowe rozproszenia do przodu w porównaniu z logarytmicznymi wykresami punktowymi po stronie.Po dostosowaniu napięć w razie potrzeby zapisz jednobarwne ogniwa barwione do kontroli kompensacji. Teraz uruchom próbkę kontroli pozytywnej, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek, aby dostosować kompensację i bramki. Następnie pozyskaj i zarejestruj 100 000 zdarzeń dla każdej próbki krwi pełnej i przeanalizuj dane cytometrii przepływowej przy użyciu odpowiednich wykresów i bramek.Jeśli krew jest powoli dodawana do pożywki, pożywka gradientowa joheksolu i próbka krwi utworzą dwie oddzielne warstwy w probówce. Po odwirowaniu górna warstwa w kolorze słomki zawiera osocze, ale nie zawiera nienaruszonych komórek krwi. Druga, biaława, bogata w płytki krwi warstwa zawiera większość płytek krwi.Trzecia, przezroczysta warstwa to warstwa uboga w płytki krwi i znajduje się bezpośrednio nad krwinkami czerwonymi i osadkami krwinek białych. Krew pełna wykazuje odrębne populacje czerwonych krwinek, białych krwinek i płytek krwi na logarytmicznym wykresie kropkowym rozproszenia do przodu w stosunku do boku. Oczyszczone płytki krwi wykazują jednak odrębną populację ze znikomą liczbą czerwonych lub białych krwinek.Próbki krwi pełnej zawierają populacje krwinek czerwonych Ter119-dodatnich i CD45-dodatnich białych krwinek, które są prawie nieobecne w oczyszczonych próbkach płytek krwi. Nieleczone oczyszczone płytki krwi nie wykazują prawie żadnych markerów aktywacji potwierdzających ich stan spoczynku, podczas gdy oczyszczone płytki krwi leczone trombiną zazwyczaj wykazują ekspresję 71% selektyny P. Ocena mikroskopowa niepoddanych działaniu substancji oczyszczonych próbek płytek krwi nie wykazuje agregacji płytek krwi.Jednak po aktywacji trombiną płytki krwi wykazują silną agregację, co dodatkowo potwierdza ich żywotność po oczyszczeniu, jak wykazano. Ostrożnie ułóż próbkę krwi na pożywce z joheksolem, a podczas pobierania płytek krwi należy pamiętać o ostrożnym aspiracji, aby nie zebrać warstw czerwonych krwinek i białych krwinek w celu skutecznego oczyszczenia płytek krwi. Ta metoda może być również stosowana do oczyszczania płytek krwi z innych gatunków.Oczyszczone płytki krwi mogą być wykorzystywane do badań ekspresji genów, aktywacji, agregacji, uwalniania granulek i adhezji.

purification-of-platelets-from-mouse-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

W tym filmie opisujemy protokół oczyszczania płytek krwi z pełnej krwi mysiej i ich późniejszej aktywacji za pomocą trombiny agonisty płytek krwi. Podczas analizy za pomocą cytometrii przepływowej, oczyszczone spoczynkowe płytki krwi są charakteryzowane na podstawie ekspresji ich markera powierzchniowego komórki CD41, podczas gdy oczyszczone aktywowane płytki krwi wykazują współekspresję zarówno markerów powierzchniowych CD41, jak i CD62P.

Oczyszczanie i aktywacja płytek krwi z mysiej krwi pełnej

W tym filmie pokazujemy izolację cytotoksycznych neutrofili o wysokiej gęstości i neutrofili o niskiej gęstości z krwi myszy z nowotworem przez nieciągłe wirowanie w gradinie sacharozy.

Izolacja cytotoksycznych neutrofili z krwi myszy zawierającej nowotwór

Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.

Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

Wysoce czystą populację megakariocytów można uzyskać z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej. Opisano tutaj metodę izolacji komórek CD34+ i różnicowania megakariocytów.

Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Prezentowany tutaj jest protokół dołączania peptydu CD47 (pepCD47) do metalowych stentów za pomocą chemii polibisfosfonianów. Funkcjonalizacja stentów metalowych za pomocą pepCD47 zapobiega przyłączaniu się i aktywacji komórek zapalnych, poprawiając w ten sposób ich biokompatybilność.

Łagodzenie przyczepiania się komórek krwiopochodnych do metalowych implantów poprzez immobilizację peptydów pochodzących z CD47

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje wszystkie etapy związane z uzyskaniem hematopoetycznych progenitorów CD34+ pochodzących z leukofiltrów oraz ich różnicowaniem in vitro i dojrzewaniem do megakariocytów zawierających propłytki, które są w stanie uwalniać płytki krwi w pożywce hodowlanej. Ta procedura jest przydatna do dogłębnej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących megakariopoezę.

Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Metabolizm płytek krwi jest interesujący, szczególnie w odniesieniu do roli nadmiernej i hipoaktywności płytek krwi w krwawieniach i zaburzeniach zakrzepowych. Izolowanie płytek krwi z osocza jest konieczne w przypadku niektórych testów metabolicznych; Przedstawiono metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi.

Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego

Naucz się oczyszczania płytek krwi z krwi myszy przy użyciu gradientu johexolu i wirowania. Ta metoda umożliwia analizę cytometrią przepływową i mikroskopią.

Oczyszczanie płytek krwi z krwi myszy

Przeglądaj więcej filmów