Name: Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania białek o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans przy użyciu PCR i chromatografii IMAC. Technika ta umożliwia badaczom efektywne uzyskiwanie trudnych do ekspresji produktów genowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) (granty o numerach 16K15860 i 19K10471 dla T. M., 17K12032 dla M. I., i 18K09926 dla N. H.) oraz Fundację Nauki i Technologii SECOM (SECOM) (numer grantu 2018.09.10 nr 1).

UWAGA: Generacja S. mutans ∆gtfC, w której cały region kodujący genu gtfC jest zastąpiony przez spcr, musi zostać zakończona przed wykonaniem tych protokołów. Zapoznaj się z opublikowanym artykułem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat generation5.
1. Projekt podkładu
<ol>
	<li>Przygotuj podkłady pod budowę S. mutans His-gtfC. 
	nuta: Sekwencje starterów stosowane w tym protokole przedstawiono w Tabeli 1. Dwuetapowa metoda fusion PCR do generowania S. mutans His-gtfC jest schematycznie zilustrowana w <silna klasa="xfig">Rysunek 2.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery (gtfC-reverse i spcr-forward) do przyłączania sekwencji kodującej His-tag, interweniując między genem gtfC a spcr (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).
		<ol>
			<li>Dołącz łącznik GS i sekwencję kodowania His-tag do starterów gtfC-reverse i spc r-forward, w których 24 zasady w regionach 5' są względem siebie komplementarne. 
			UWAGA: Sekwencja aminokwasowa łącznika GS i znacznika Hisa (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His) jest przyłączona do C-końca GTF-SI poprzez translację genów.</li>
			<li>Zaprojektuj starter gtfC-forward do przodu, aby celować w gen gtfC w genomie S. mutans WT >1 kb za genem, a starter spc r-reverse do celowania w dalszy region flankujący spcr w S. mutans ∆gtfC. Ustaw temperaturę topnienia8 (Tm) starterów gtfC-forward i spc r-reverse tak, aby odpowiadały temperaturom topnienia odpowiednio starterów gtfC-reverse i spcr-forward.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zaprojektuj zagnieżdżone startery (zagnieżdżone do przodu i zagnieżdżone-odwrotne) dla drugiego PCR (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Zaprojektuj startery (gtfC-forward i colony-reverse) specyficzne dla genomowego DNA transformantu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C; startery są używane do PCR kolonii). 
		nuta: Amplikony znajdują się na granicy między gtfC i spcr. Podkład gtfC-forward może być stosowany jako podkład do przodu.</li>
		<li>Zaprojektuj startery (góra-przód i dół-tył) w celu ostatecznego potwierdzenia generacji S. mutans His-gtfC (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C; produkt PCR amplifikowany przez startery jest używany do sekwencjonowania DNA).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja genomowego DNA z S. mutans
UWAGA: Każdy szczep S. mutans powinien być hodowany w pożywce do infuzji serca mózgu (BHI) w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych. Zmutowane szczepy S. mutans ∆gtfC i S. mutans His-gtfC są hodowane w BHI uzupełnionym 100 μg/ml spektynomycyny.
<ol>
	<li>Smugi S. mutans WT i S. mutans ∆gtfC oddzielnie na każdej z płytek agarowych BHI. Inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbierz pojedyncze kolonie S. mutans WT lub S. mutans ∆gtfC za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i zaszczepij w 1,5 ml bulionu BHI. Inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Kolonie mogą być wykorzystane jako źródło matrycowego DNA do pierwszego PCR (krok 3.1).</li>
	<li>Przenieś 1 ml każdej kultury bakteryjnej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować kulturę przez 1 minutę przy 15 000 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 1 ml buforu Tris-EDTA (pH 8,0) w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego.</li>
	<li>Odwirowywać zawiesinę przez 1 minutę przy 15 000 x g. Usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu Tris-EDTA (pH 8,0).</li>
	<li>Podgrzewać zawiesinę za pomocą inkubatora blokowego przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut przy 15 000 x g.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (supernatant posłuży jako matryca DNA do pierwszego PCR).</li>
</ol>
3. Amplifikacja PCR
UWAGA: Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3 podsumowują odpowiednio startery, odczynniki i cykle amplifikacji PCR.
<ol>
	<li>Wykonaj pierwszy PCR, używając genomu S. mutans WT i S. mutans ∆gtfC jako matryc PCR. Amplifikuj regiony, w których znajduje się dolna część genu gtfC i te, w których występuje spcr, za pomocą starterów opisanych w kroku 1.1.1.2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Elektroforeza każdy produkt PCR na 1% żelu agarozowym. Wytnij pożądane fragmenty DNA o wielkości około 1000 pz i 2000 pz. Oczyść fragmenty z żeli za pomocą metody ekstrakcji żelem na bazie membrany krzemionkowej. 
	nuta: Podstawowe procedury dla PCR9, elektroforezy w żelu DNA10 i oczyszczania DNA11 są szczegółowo opisane w innym miejscu.</li>
	<li>Wykonaj drugi PCR, używając produktów pierwszego PCR (w przybliżeniu równomolowego) jako matryc PCR z zagnieżdżonymi starterami do przodu i zagnieżdżonym-odwrotnym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Elektroforeza jedna dziesiąta mieszaniny PCR na żelu agarozowym. Potwierdź wygenerowanie odpowiedniego amplikonu o wartości około 3 000 pz.</li>
	<li>Wytrącić pozostały produkt PCR. 
	UWAGA: Oczyszczanie produktu PCR nie jest konieczne, ponieważ niespecyficzne amplikony generowane przez drugi PCR nie zakłócają rekombinacji homologicznej.
	<ol>
		<li>Dodać wodę wolną od nukleaz do mieszaniny PCR i doprowadzić całkowitą objętość do 100 μl, a następnie 0,1 objętości (10 μl) 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości (250 μl) absolutnego alkoholu etylowego. Wymieszaj i przechowuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Odwirować próbkę przez 20 minut przy sile 15 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Dodaj 1 ml 70% etanolu, aby przepłukać osad DNA.</li>
		<li>Odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Wysuszyć na powietrzu i rozpuścić osad DNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Transformacja komórek
<ol>
	<li>Przygotuj kompetentną bakterię S. mutans WT do wprowadzenia drugiego produktu PCR, postępując zgodnie z krokami opisanymi w poprzedniej publikacji5. Przechowywać ogniwa w temperaturze -80 °C. 
	nuta: Na potrzeby tego eksperymentu kompetentne komórki WT S. mutans zostały już zakonserwowane w temperaturze -80 °C, aby wytworzyć S. mutans ∆gtfC.</li>
	<li>Zmieszać 5 μl skoncentrowanego drugiego produktu PCR z 50 μl podwielokrotności lodowato zimnych kompetentnych komórek zamrożonych wcześniej. Dodać mieszaninę do kuwet do elektroporacji. Podać pojedynczy impuls elektryczny (1,8 kV, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) do ogniw za pomocą aparatu do elektroporacji.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl bulionu BHI. Natychmiast rozprowadzić 10–100 μl zawiesiny na płytkach agarowych BHI zawierających spektynomycynę. Inkubować płytki przez 2–6 dni w temperaturze 37 °C, aż kolonie urosną na tyle, aby można je było zebrać.</li>
</ol>
5. Weryfikacja Rekombinacji i Przechowywania Genomu 
<ol>
	<li>Wykonaj colony PCR, używając starterów gtfC-forward i colony-reverse do badań przesiewowych pod kątem rekombinacji. Elektroforezę każdego produktu PCR kolonii na żelu agarozowym. Potwierdź fragment DNA o długości około 1500 pz.</li>
	<li>Wybierz jedną z pozytywnych kolonii za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i zahoduj komórki przez noc w 2 ml bulionu BHI zawierającego spektynomycynę.</li>
	<li>Wymieszać 0,8 ml kultury bakteryjnej z 0,8 ml sterylnego 50% glicerolu i wyrobić w temperaturze -80 °C lub -20 °C.</li>
	<li>Przenieść pozostały 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórz kroki 2.3–2.7, aby wyodrębnić genomowe DNA z komórek.</li>
	<li>Wykonaj PCR przy użyciu starterów góra-przód i dół-tył oraz genomowego DNA jako matrycy. Powtórz krok 3.2, aby oczyścić amplifikowany produkt DNA z żeli.</li>
	<li>Określić sekwencję DNA oczyszczonego amplikonu przez sekwencjonowanie DNA. 
	nuta: Upewnij się, że potwierdziłeś generowanie S. mutans His-gtfC przez sekwencjonowanie DNA.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie GTF-SI oznaczonego polihistydyną
<ol>
	<li>Smugi S. mutans His-gtfC na płytce agarowej BHI zawierającej spektynomycynę. Inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbierz pojedynczą kolonię za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i komórek subkultury w 3 ml bulionu BHI. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować dwie kolby stożkowe z 1 litrem bulionu BHI bez spektynomycyny. Zaszczepić 1 ml zawiesiny do hodowli na noc w 1 litrze bulionu BHI. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Koncentrat białkowy z supernatantu kultury przez wytrącanie siarczanu amonu. 
	UWAGA: Ekstrakt z ciał komórkowych, jeśli białko docelowe jest wewnątrzkomórkowe. Podstawowe procedury wytrącania siarczanu amonu są szczegółowo opisane w innym miejscu12.
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę kultur bakteryjnych przez 20 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Odzyskać supernatant z hodowli do szklanej zlewki o pojemności 3 l.</li>
		<li>Dodać 1,122 g siarczanu amonu do 2 l supernatantu (80% nasycenia), energicznie mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Pozostawić osad do uformowania się przez 4 godziny lub dłużej w temperaturze 4 °C, mieszając. 
		UWAGA: Tworzenie osadu można kontynuować przez noc.</li>
		<li>Odwirować roztwór wytrącony siarczanem amonu o stężeniu 15 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.</li>
		<li>Zebrać osad szpatułką i przenieść do szklanej zlewki o pojemności 200 ml. Zawiesić osady w 35 ml buforu wiążącego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazolu, pH 8,0).</li>
		<li>Zawiesinę należy dializować w stosunku do 2 500 ml buforu wiążącego za pomocą rurki do dializy z regenerowanej celulozy, w temperaturze 4 °C, mieszając. Po 2 godzinach należy wymienić roztwór do dializy i kontynuować dializę przez noc.</li>
		<li>Ponownie wymienić roztwór dializacyjny. Kontynuuj dializę przez dodatkowe 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować dializowaną zawiesinę o stężeniu 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant przez filtr membranowy za pomocą sprzętu do filtracji ssącej. Przenieść filtrat do kolby o średnicy75 cm2.</li>
	<li>Frakcjonować GTF-SI znakowany polihistydyną z przefiltrowanej zawiesiny metodą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali (IMAC).
	<ol>
		<li>Przenieść 2 ml zawiesiny żywicy IMAC z ładunkiem niklu (około 1 ml żywicy) do kolumny chromatograficznej, której wylot jest podłączony do rurki silikonowej. Usunąć roztwór do przechowywania za pomocą przepływu grawitacyjnego. 
		ostrożność: Nie pozwól, aby żywica wyschła w całym IMAC.</li>
		<li>Dodaj 3 ml wody destylowanej do kolumny, aby przepłukać żywicę. Dodać 5 ml buforu wiążącego, aby zrównoważyć żywicę.</li>
		<li>Odciąć przepływ za pomocą kurka szczypcowego Hoffmanna. Dodać 5 ml przefiltrowanej zawiesiny z kroku 6.5, aby uzyskać zawiesinę.</li>
		<li>Dodać całą gnojowicę do pozostałej przefiltrowanej zawiesiny. Delikatnie mieszać mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Załaduj mieszaninę z powrotem na kolumnę. Usunąć zawiesinę za pomocą przepływu grawitacyjnego. Przemyć żywicę IMAC 20 ml buforu wiążącego. 
		nuta: Dostosuj natężenie przepływu do około 2 ml/min za pomocą kurka zaciskowego Hoffmann przez cały kolejny IMAC.</li>
		<li>Eluować rekombinowany GTF-SI za pomocą 20 ml buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazolu, pH 8,0). 
		nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Eluat należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Żywica IMAC może być ponownie użyta. Zapoznaj się z instrukcją żywicy IMAC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąp bufor elucyjny buforem magazynującym (50 mM bufor fosforanowy, pH 6,5) i zagęścić rekombinowany roztwór GTF-SI do około 1 ml za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji. Przechowywać rekombinowany roztwór GTF-SI w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Potwierdź oczyszczenie GTF-SI znakowane polihistydyną za pomocą SDS-PAGE13 i western blotting14, stosując przeciwciało monoklonalne anty-polihistydyny sprzężone z peroksydazą chrzanową. Dodanie CHAPS (stężenie końcowe, 0,1%) do eluentu może być wymagane w celu uniknięcia niespecyficznej adsorpcji na jednostce, w zależności od białka docelowego.</li>
</ol>
7. Przywrócenie funkcjonalności za pomocą rekombinowanego GTF-SI
<ol>
	<li>Umieść każdy szczep S. mutanna płytce agarowej BHI indywidualnie. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanej wykałaczki zbierz pojedynczą kolonię, aby zaszczepić ją w 2 ml bulionu BHI. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Użyj 20 μl nocnej kultury S. mutans ∆gtfC, aby zaszczepić 2 ml bulionu BHI zawierającego 1% sacharozy bez antybiotyków w szklanej probówce. Dodać GTF-SI lub równoważną objętość nośnika do hodowli S. mutans ∆gtfC i wyhodować komórki z probówką umieszczoną w pozycji pochylonej przez noc. 
	nuta: Wysterylizuj roztwór GTF-SI sterylnym filtrem strzykawkowym i oznacz stężenie białka za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego 15 przed użyciem.</li>
	<li>Mieszać zawiesiny kultur za pomocą mieszalnika wirowego przez 10 s. Zdekantować zawiesiny. Umyj probówki odpowiednią ilością wody destylowanej.</li>
	<li>Zabarwić biofilmy na ściance probówki 1 ml 0,25% błękitu brylantowego Coomassie (CBB).</li>
	<li>Zdekantować roztwór barwiący po 1 minutach. Umyj probówki odpowiednią ilością wody destylowanej. Wysuszyć probówki na powietrzu.</li>
</ol>

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans%3A+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).</li>
<li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR%3A+The+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Projektowanie starterów jest najważniejszym krokiem w protokole. Sekwencje starterów gtfC-reverse i spc r-forward zostały automatycznie określone na podstawie sekwencji zarówno regionu końcowego 3′ gtfC, jak i regionu końcowego 5′ spcr. Każdy starter zawiera 24 komplementarne zasady, które kodują łącznik GS i sekwencję kodującą His-tag w swoich 5' regionach. Zakłócenia natywnych sekwencji regulatorowych zlokalizowanych w górnych regionach flankujących można unikną...

Analiza funkcji genu zazwyczaj obejmuje porównanie cech fenotypowych szczepów dzikich ze szczepami, w których interesujący nas gen został zaburzony. Po wyprodukowaniu szczepu z zaburzonym genem, egzogenne dodanie produktu genu umożliwia przywrócenie funkcjonalności.
Najczęstszą metodą uzyskiwania oczyszczonych produktów genowych wymaganych do późniejszych testów odtwórczych jest przeprowadzenie ekspresji heterologicznej w Escherichia coli1. Jednak ekspresja białek błonowych lub białek o dużej masie cząsteczkowej jest często trudna przy użyciu tego systemu1. W takich przypadkach białko docelowe jest zwykle izolowane z komórek, które natywnie syntetyzują białko w złożonej serii etapów, co może prowadzić do utraty produktu genu. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowano prostą procedurę oczyszczania produktu genowego za pomocą metody rozerwania genów2, metody splicingu DNA opartej na PCR3 (wyznaczona dwuetapowa fuzja PCR) oraz elektroporacji do transformacji genetycznej u Streptococcus mutans. Dodanie znacznika polihistydynowego (znacznika His) do C-końca produktu genu ułatwia jego oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali (IMAC).
Aby wyizolować szczep wykazujący ekspresję His-tag, całe genomowe DNA interesującego nas genu (w tym szczepie z zaburzonym genem ekspresji His-taga) jest zastępowane genem markerowym opornym na antybiotyki. Procedura generowania szczepu wykazującego ekspresję His-tag jest prawie identyczna z procedurą generowania szczepu z zaburzonym genem, jak opisano wcześniej4,5. W związku z tym metody rozrywania genów i izolacji produktów genowych powinny być przeprowadzane jako eksperymenty seryjne do celów analizy funkcjonalnej.
W niniejszej pracy, sekwencja kodująca polihistydynę jest dołączona do końca 3′ genu gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), kodując glukozylotransferazę-SI (GTF-SI) w S. mutans6. Następnie przeprowadzono badania ekspresji u gatunków paciorkowców. Osiągnięcie heterologicznej ekspresji gtfC przez E. coli jest trudne, prawdopodobnie ze względu na dużą masę cząsteczkową GTF-SI. Szczep ten nosi nazwę S. mutans His-gtfC. Schematyczna ilustracja przedstawiająca organizację kasety genu oporności na gtfC i spektynomycynę (spcr)7 loci u S. mutans typu dzikiego (S. mutans WT) i jego pochodnych jest pokazana w Rysunek 1. GTF-SI jest białkiem wydzielniczym, które przyczynia się do rozwoju próchnicotwórczego biofilmu zębowego6. W obecności sacharozy obserwuje się przylegający biofilm na gładkiej powierzchni szkła w szczepie WT S. mutans, ale nie w szczepie S. mutans zakłóconym przez gtfC (S. mutans ΔgtfC)2,5. Tworzenie biofilmu zostaje przywrócone w S. mutans ΔgtfC po egzogennym dodaniu rekombinowanego GTF-SI. Szczep, S. mutans His-gtfC, jest następnie wykorzystywany do produkcji rekombinowanego GTF-SI.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td><td>Do elektroforezy w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>System hodowli beztlenowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne Anti-His-Tag</td><td>MBL</td><td>D291-7</td> Zestaw do oznaczania białek BCA <td>sprzężonych z HRP</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Pomiar stężenia białka</td></tr><tr><td>Rosół do infuzji serca mózgu</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Pożywka do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Do barwienia biofilmu</td></tr><tr><td>Ultrafiltracyjne urządzenie odśrodkowe</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>Wymiana buforu i zagęszczenie białka</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>Do</td></tr><tr><td>zacisku membranowego do dializy</td> IMAC <td>Marka Fisher</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy</td><td>As One</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>Sekwencjonowanie DNA polimerazy DNA o wysokiej wierności</td></tr><tr><td></td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrat ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td>Do western blotting</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Przygotowanie buforu Tris-EDTA</td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>odstęp 0,2 cm</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór EtBr</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>Do elektroforezy żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Przecinak do taśm</td><td>żelowych Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Gel zestaw do ekstrakcji</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>Ekstrakcja DNA z żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>29083461</td><td>Dla SDS-PAGE i western blot</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>Bufor wiążący i preparat buforu elucyjnego</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Nippon Medical & Instrumenty chemiczne</td><td>EZ-022</td><td>Ustawienie temperatury: 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Nippon Medical & Instrumenty chemiczne</td><td>LH-100-RDS</td><td>Ustawienie temperatury: 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Filtr membranowy</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0,2 & mikro; m średnica</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>192-02815</td><td>Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>Wytrącanie siarczanu amonu Żywica</td></tr><tr><td>naładowana niklem</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>Dla IMAC</td></tr><tr><td>Startery PCR</td><td>Eurofins Genomics Zamówiony</td> na <td>zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>standard białkowy</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>Do SDS-PAGE i western blotting</td></tr><tr><td>Aparat do filtracji rozpuszczalnikowej</td><td>Jako jeden</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antybiotyki; stosować przy 100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0,22 i mikro; m średnica</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916; gtfC</td><td>Szczep magazynowy w laboratorium.</td><td></td><td>gtfC zastąpiony przez spcr</em</td></tr><tr><td>>Streptococus mutans UA159</td><td>Szczep podstawowy w laboratorium.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610, Szczep typu dzikiego</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Do rozwoju biofilmu</td></tr><tr><td>TAE (50 i razy; )</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>Do elektroforezy w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>314-90065</td><td>Preparat buforowy Tris-EDTA</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Wyjaśnienie funkcji genu zazwyczaj polega na porównaniu cech fenotypowych szczepów typu dzikiego i szczepów, w których interesujący nas gen został zakłócony. Utrata funkcji w wyniku zakłócenia genu jest następnie przywracana przez egzogenne dodanie produktu zakłóconego genu. Pomaga to określić funkcję genu. Opisana wcześniej metoda polega na wytworzeniu szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genu gtfC. W tym miejscu opisano niewymagającą metodę oczyszczania produktu genu gtfC z nowo wytworzonego szczepu S. mutans po rozerwaniu genu. Polega ona na dodaniu sekwencji kodującej polihistydynę na końcu 3′ genu będącego przedmiotem zainteresowania, co umożliwia proste oczyszczenie produktu genu za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metalu. Do modyfikacji genetycznej w tej metodzie nie są wymagane żadne reakcje enzymatyczne inne niż PCR. Odtworzenie produktu genu przez egzogenne dodanie po przerwaniu genu jest skuteczną metodą określania funkcji genów, które mogą być również dostosowane do różnych gatunków.

Rycina 3 przedstawia wielkość każdego amplikonu z pierwszej reakcji PCR (Rycina 3A) oraz drugiej reakcji PCR (Rycina 3B). Wielkość każdego amplikonu była zgodna z przewidywaną wielkością opisaną w Tabeli 1. Rycina 4A przedstawia kolonie S. mutans przekształcone produktem drugiej reakcji PCR i wysiane na płytki z agarem BHI zawierającym spektynom...

Opisana tutaj jest prosta metoda oczyszczania produktu genowego u Streptococcus mutans. Technika ta może być korzystna w oczyszczaniu białek, zwłaszcza białek błonowych i białek o dużej masie cząsteczkowej, i może być stosowana z różnymi innymi gatunkami bakterii.

Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak, w jaki sposób produkt genowy, który jest trudny do ekspresji w E. Coli, oczyszcza się. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nośnikiem nie jest żadna reakcja enzymatyczna inna niż PCR i można stosować typowe zastosowania do oczyszczania białek. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat oczyszczania białek u Streptococcus mutans, może być również stosowana w odniesieniu do innych gatunków mikrobioty.Procedurę zademonstruje dr Mamiko Yamashita, doktorantka z naszego laboratorium. Po zaprojektowaniu startera i ekstrakcji genomowego DNA ze streptococcus mutans, wykonaj pierwszy PCR, używając genomu streptococcus mutans typu dzikiego i genomu streptococcus mutans zakłóconego przez GFC jako matryce PCR. Amplifikować regiony, w których znajduje się dalsza część genu gtfC i te, w których występuje gen oporności na spektynomycynę, za pomocą przygotowanego startera gtfC-forward i reverse oraz startera spc r-forward i reverse.Następnie poddaj elektroforezę każdemu produktowi PCR na 1% żelu agarozowym. Użyj przecinarki do taśm żelowych, aby wyciąć pożądane fragmenty DNA o długości około 1 000 par zasad i 2 000 par zasad z żelu do probówek mikrowirówek. Dodaj 500 mikrolitrów buforu solubilizującego do każdej probówki i inkubuj je przez 10 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza, aby rozpuścić plastry żelu.Oczyść fragmenty za pomocą metody ekstrakcji żelem na bazie membrany krzemionkowej. Wykonaj drugi PCR, używając produktów pierwszego PCR jako matryc PCR z zagnieżdżonymi starterami do przodu i zagnieżdżonym-odwrotnym. W przypadku, gdy drugi produkt PCR nie może zostać potwierdzony przez elektroforezę, należy zaprojektować kolejną zagnieżdżoną parę starterów.elektroforeza pięć mikrolitrów mieszaniny PCR na żelu agarozowym. Potwierdzić wygenerowanie odpowiedniego amplikonu około 3 000 par zasad za pomocą obrazu barwienia w żelu bromku etydyny i postępować zgodnie z manuskryptem. Teraz wymieszaj pięć mikrolitrów skoncentrowanego drugiego produktu PCR z 50-mikrolitrową alokwotą lodowatych, kompetentnych komórek Streptococcus mutan typu dzikiego, zamrożonych wcześniej.Dodać mieszaninę do kuwety do elektroporacji i umieścić kuwetę w komorze kuwety aparatu do elektroporacji. Daj pojedynczy impuls elektryczny o napięciu 1,8 kilowolta, 600 omów i 10 mikrofaradach przez 2,5 milisekundy do komórek. Dodaj 500 mikrolitrów bulionu naparowego mózgowo-sercowego do kuwety.Natychmiast rozprowadzić od 10 do 100 mikrolitrów zawiesiny na płytkach ślimakowych do infuzji mózgowo-sercowej zawierających spektynomycynę. Inkubuj płytki przez dwa do sześciu dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż kolonie urosną na tyle, aby można je było zebrać. Po wytworzeniu sekwencji kodującej polihistydynę Streptococcus mutans i inokulacji nocnej bez spektynomycyny zgodnie z manuskryptem, odwirować zawiesinę kultury bakteryjnej przez 20 minut w temperaturze 10 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza.Przenieść supernatant kulturowy do trzylitrowej szklanej zlewki. Aby skoncentrować białka z supernatantu hodowli, umieść dwulitrowy supernatant na mieszadle magnetycznym i rozpocznij energiczne mieszanie. Dodać 1 122 gramy siarczanu amonu i pozostawić osad do uformowania się, energicznie mieszając w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny lub przez noc. Następny.odwirować roztwór wytrącony siarczanem amonu o temperaturze 15 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant. Za pomocą szpatułki zbierz osad i przenieś go do 200-mililitrowej szklanej zlewki.Ponownie zawiesić granulki w 35 mililitrach buforu wiążącego. Następnie przenieś każde około 25 mililitrów zawiesiny do rurki do dializy z regenerowanej celulozy. Umieścić rurkę dializacyjną w 2,5 litra mieszającego buforu wiążącego na mieszadle w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu dializacji zawiesiny.Po dwóch godzinach należy wymienić roztwór do dializy i kontynuować dializę przez noc. Następnie przenieś dializowaną zawiesinę z rurki do probówek wirówkowych i umieść probówki w wirówce pod ciśnieniem 20 000 g na 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą sprzętu do filtracji sekcyjnej przelać supernatant na filtr membranowy o średnicy 0,2 mikrometra w celu przefiltrowania.Przenieść filtrat do kolby o pojemności 75 mililitrów. Aby frakcjonować gtfSI znakowany polihistydyną z przefiltrowanej zawiesiny, należy najpierw przygotować unieruchomioną chromatografię powinowactwa do metali. Po wyrównaniu żywicy zgodnie z rękopisem zamknij kurek szczypcowy Hoffmana.Dodaj pięć mililitrów przefiltrowanej zawiesiny do kolumny, aby uzyskać zawiesinę. Następnie przenieś całą zawiesinę do pozostałej przefiltrowanej zawiesiny i delikatnie mieszaj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Załaduj mieszaninę z powrotem do kolumny.Otwórz kurek szczypiący Hoffmana, aby usunąć zawieszenie przez przepływ grawitacyjny. Przemyć żywicę IMAC 20 mililitrami buforu wiążącego, a następnie wymyć 20 mililitrów buforu elucyjnego, aby uzyskać rekombinowany gtfSI. Następnie załaduj eluat do odśrodkowej rurki ultrafiltracyjnej i odwiruj roztwór o stężeniu 2 000 razy g przez jedną do pięciu minut, aby stężyć roztwór.Opróżnij pojemnik filtratu i dodaj 15 mililitrów buforu do przechowywania do probówki. Ponownie odwirować próbkę i powtórzyć proces jeszcze dwa razy. Rekombinowany roztwór gtfSI jest ostatecznie zatężany do około jednego mililitra.Przenieś koncentrat do probówki mikrowirówkowej i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Kontynuuj z pozostałym protokołem przywracania funkcjonalności. W tym protokole elektroforeza w żelu agarozowym pokazuje, że wielkość każdego amplikonu z pierwszego PCR i drugiego PCR odpowiadała przewidywanej wielkości.Kolonie Streptococcus mutans przekształcono za pomocą drugiego produktu PCR i posiewano na płytkach ślimakowych do infuzji mózgowo-sercowej zawierających spektynomycynę. Produkty Colony PCR prowadzone na żelu agarozowym pokazują, że każdy amplikon miał przewidywany rozmiar. Białko oczyszczone za pomocą chromatografii powinowactwa do immobilizowanego metalu obserwowano jako pojedyncze prążko za pomocą SDS-PAGE.Western blot, wykonany przy użyciu przeciwciała anty-polihistydynowego, potwierdził, że obserwowane pasmo było oczekiwanym białkiem znakowanym polihistydyną o mocy 160 kilodaltonów. Zdolność do tworzenia biofilmu pochodzącego z sacharozy zaobserwowano tylko w przypadku Streptococcus mutans typu dzikiego i Streptococcus mutans His-gtfC, które tworzyły przylegający biofilm na ściance rurki w obecności 1% sacharozy. Nie zaobserwowano tego u Streptococcus mutans delta gtfC.Jednak dodanie 25 mikrogramów rekombinowanego gtfSI przywróciło zdolność do tworzenia przylegającego biofilmu w Streptococcus mutans delta gtfC. Ponieważ powodzenie tej metody zależy od drugiej amplifikacji PCR, drugi produkt PCR musi zostać potwierdzony przez elektroforezę. Już teraz białko typu histydyny otrzymane tą metodą również łączy się z kwasami funkcjonalnymi, takimi jak interakcje białko-białko.Po opracowaniu technika ta, w połączeniu z rozrywaniem genów, utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią do zbadania funkcji genów.

purification-of-a-high-molecular-mass-protein-in-streptococcus-mutans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

MamA jest unikalnym białkiem powiązanym z magnetosomami, o którym wykazano, że bierze udział w ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół oczyszczania mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) z M. magneticum AMB-1.

Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Źródło: Murata, T., et al. Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje krok po kroku procedurę oczyszczania białka znakowanego polihistydyną wydzielanego przez Streptococcus mutans.

Procedura oczyszczania białka znakowanego polihistydyną ze Streptococcus mutans

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Opisano metodę skutecznego oczyszczania białek fuzyjnych znakowanych podwójnie Strep-Strep-i ich specyficznych kompleksów na zmodyfikowanej żywicy streptawidyny (Strep-Tactin) kowalencyjnie usieciowanej z suberianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3). Zaletą metody jest duża szybkość, dobry odzysk białka docelowego i wysoka czystość, a także jest kompatybilna z późniejszą analizą za pomocą spektrometrii mas.

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

Polipeptydy podobne do elastyny to biopolimery reagujące na bodźce, o różnych zastosowaniach, od oczyszczania białek rekombinowanych po dostarczanie leków. Protokół ten opisuje oczyszczanie i charakterystykę polipeptydów podobnych do elastyny oraz ich fuzji peptydów lub białek z Escherichia coli przy użyciu ich zachowania przemiany fazowej w dolnej temperaturze roztworu krytycznego jako prostej alternatywy dla chromatografii.

Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania dla rekombinowanego, bezznacznikowego białka wiążącego wapń S100A12 i jego indukowanych jonami oligomerów do testów stymulacji ludzkich monocytów.

Oczyszczanie S100A12 człowieka i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Protokół ten opisuje szybką, powtarzalną metodę ekstrakcji i wytrącania opartą na rozpuszczalnikach organicznych do oczyszczania polipeptydu podobnego do elastyny (ELP) z Escherichia coli, oferując potencjalnie skalowalną alternatywę dla konwencjonalnych metod oczyszczania ELP.

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

Poznaj metodę oczyszczania białek o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans przy użyciu PCR i chromatografii IMAC. Technika ta umożliwia badaczom efektywne uzyskiwanie trudnych do ekspresji produktów genowych.

Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans

Przeglądaj więcej filmów