Name: Transfer manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z guzem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę transferu manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z guzem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo. Protokół umożliwia badanie immunoterapii opartych na neutrofilach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nasza praca była wspierana przez granty z Deutsche Krebshilfe, numer grantu: 111647, oraz Niemiecka Rada ds. Badań Naukowych (DFG), numer grantu: JA 2461/2-1.

Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez organy regulacyjne: LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) i Regierungspräsidium Tübingen, Niemcy. Wszystkie manipulacje powinny być wykonywane w sterylnych warunkach (pod kapturem z przepływem laminarnym) przy użyciu sterylnych odczynników i narzędzi (strzykawki, nożyczki, kleszcze, jednorazowe skalpele, szalki Petriego).
UWAGA: Ogólny schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie linii komórkowej czerniaka B16F10
<ol>
	<li>Przygotować komórki mykoplazmoujemne wyhodowane do 90% zlewającej się monowarstwy (około 10 x 106 komórek/kolbę T75) w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco firmy Iscove (IMDMc: IMDM + 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) + 1% penicylina-streptomycyna).</li>
	<li>Usuń pożywkę i przepłucz komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Nałożyć 6 ml roztworu do oddzielania komórek zawierającego enzymy proteolityczne i kolagenolityczne (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Delikatnie uderzyć w kolbę, aby zmobilizować pozostałe przylegające komórki od dołu. Zebrać zawiesinę komórek do probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Dodać 14 ml PBS i odwirować (300 x g i 20 °C przez 7 min).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.</li>
	<li>Policz komórki i ponownie je zawiesić do stężenia 3 x 106/ml PBS (dla kroku 2) lub 6 x 106/ml PBS (dla kroku 6) do wstrzykiwań. Trzymaj komórki na lodzie maksymalnie przez 30 minut.</li>
</ol>
2. Allogeniczny model guza u myszy
<ol>
	<li>Użyj 10 samic myszy Ifnar1-/- w wieku 8-12 tygodni, które są trzymane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF). 
	UWAGA: Samice myszy są preferowane w podskórnym modelu wzrostu guza, ponieważ samce są bardziej agresywne, a tym samym podatne na naruszenia miejsca guza, co wpływa na wzrost guza.</li>
	<li>Ogol skórę myszy na boku golarką elektryczną i zdezynfekuj skórę chusteczką zwilżoną 70% etanolem.</li>
	<li>Przygotować komórki czerniaka B16F10 o stężeniu 3 x 106/ml PBS (patrz krok 1) zebrać w strzykawce o pojemności 1 ml i igle 0,4 x 19 mm. Wstrzyknąć podskórnie 100 μl zawiesiny.
	<ol>
		<li>Przed każdym wstrzyknięciem należy dobrze wymieszać komórki. Używaj igieł o średnicy nie mniejszej niż 0,4 mm, aby nie naruszać komórek nowotworowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść do 5 myszy w jednej klatce i kontroluj wielkość guza (długość, szerokość i głębokość) za pomocą suwmiarki przez 14 dni. 
	UWAGA: Zgodnie z przepisami dotyczącymi zwierząt, rozmiar guza nie powinien przekraczać 15 mm średnicy, myszy z większymi lub martwiczymi/otwartymi guzami powinny być wcześniej uśmiercane.</li>
	<li>W dniu 14 poświęć myszy w komorze CO2</li>.
	<li>Zdezynfekuj skórę 70% etanolem i usuń guzy nożyczkami i kleszczami na sterylnej szalce Petriego. Trzymaj guzy w probówce o pojemności 50 ml w kompletnym zmodyfikowanym podłożu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicylina-streptomycyna) na lodzie.</li>
</ol>
3. Izolacja TAN
<ol>
	<li>Umieść guzy na sterylnych 6-dołkowych płytkach, po 5 guzów na dołek. Pokrój guzy na 2-3 mm kawałki sterylnymi nożyczkami.
	<ol>
		<li>Trawić z 1 ml roztworu dispazy/kolagenazy D/DNazy I (0,2 mg/0,2 mg/100 mg w 1 ml DMEMc) na guz. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze i mieszać ze strzykawką 10 ml bez igły co 15 minut 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby usunąć niestrawione włókna, należy przesiać komórki przez filtry 100 μm w probówkach o pojemności 15 ml (jedna studzienka na filtr na probówkę). Dodać PBS do 15 ml, probówek odwirować o stężeniu 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Lizować erytrocyty za pomocą buforu do lizy (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 °C), dodając 1 ml do każdej probówki. Dobrze wymieszaj i połącz roztwór ze wszystkich probówek w jedną. Zatrzymać reakcję po 2 minutach za pomocą 11 ml lodowatego (4 °C) DMEMc.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad w 15 ml zimnego PBS. Odwirować w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml PBS. Dodać 3 μl przeciwciał przeciwko blokowi Fc (CD16/CD32, zapas 0,5 mg/ml) i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Dodaj przeciwciała: 10 μl Ly6G-PE (zapas 0,2 mg/ml) i 10 μl CD11b-APC (zapas 0,2 mg/ml). Dodać 20 μl barwnika żywotności 6-diamidyno-2-fenylindoldolu (DAPI, zapas 5 mg/ml) i inkubować na lodzie w ciemności przez 30 min. 
	UWAGA: Można zastosować inną kombinację barwników żywotności i fluorescencyjnych koniugatów przeciwciał.</li>
	<li>Dodać PBS do 15 ml, odwirować przy 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w DMEMc do stężenia około 10 x10 6/ml i trzymać na lodzie.</li>
	<li>Sortuj CD11b+ Ly6Ghi alive (DAPI-ujemne) neutrofile za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek (strategia bramkowania, patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Probówkę z zawiesiną komórek i probówkę z DMEMc dla posortowanych komórek należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Należy zastosować następujące optymalne ustawienia sortowania: dysza 70 μm, szybkość progowa maksymalna 22 000 zdarzeń/sekundę i natężenie przepływu 1-3.</li>
	<li>Sprawdź czystość posortowanych neutrofili za pomocą cytometru, aby uzyskać zalecaną czystość >95%.</li>
	<li>Odwirować posortowane neutrofile w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić posortowane komórki w DMEMc do stężenia 1 x 106/mL. 
	UWAGA: Oczekiwana liczba neutrofili w jednym 14-dniowym guzie B16F10 (średnica 10 mm) wynosi około 3 x 104 komórek.</li>
</ol>
4. Hamowanie NAMPT w TANs in vitro
<ol>
	<li>Przygotować zapas FK866 (inhibitor NAMPT) w dimetylosulfotlenku (DMSO) w końcowym stężeniu 100 mM.</li>
	<li>Wysiewaj posortowane neutrofile (krok 3.11) do 2 dołków 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U (1,5 x 105 neutrofili/dołek). Dodać FK866 do studzienki interwencyjnej (końcowe stężenie 100 nM) i taką samą ilość DMEMc z DMSO do studzienki kontrolnej. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić w 200 μl PBS w każdym dołku. Powtórz 2 razy.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić w komercyjnej pożywce do wzrostu komórek śródbłonka (uzupełnionej 4 μl/ml suplementu wzrostu komórek śródbłonka, 0,1 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, 1 ng/ml rekombinowanego ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 90 μg/ml heparyny i 1 μg/ml hydrokortyzonu) do końcowego stężenia 0,2 x 106 komórek/ml (w 0,75 ml) (dla etapu 5) lub w PBS do końcowego stężenia 0,6 x 106 komórek/ ml (w 0,25 ml) (dla kroku 6).</li>
</ol>
5. Ocena właściwości angiogennych tan za pomocą testu pierścienia aortalnego
<ol>
	<li>Wypreparuj aortę piersiową samca myszy C57BL/6J (WT). Oczyść i pokrój w krążki o szerokości 0,5 mm. Umieść wszystkie pierścienie w studzience na 24-dołkowej płytce z 1 ml uzupełnionej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze. 
	UWAGA: Preferowane jest użycie młodych (młodszych niż 8 tygodni) samców myszy do rozwarstwienia aorty, ponieważ dają one bardziej silną odpowiedź angiogenną15.</li>
	<li>Napełnij studzienki 96-dołkowej płytki z płaskim dnem 50 μl rozpuszczonej matrycy membrany podstawnej, pozwól żelowi zastygnąć przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić polimeryzację matrycy. Przygotuj co najmniej 3 studzienki na warunek.</li>
	<li>Osadź pierścienie w rozpuszczonej macierzy błony podstawnej, umieszczając pierścień aortalny na wierzchu warstwy stałej matrycy, 1 pierścień pośrodku każdej studzienki. Dodaj kolejne 50 μl rozpuszczonej matrycy błony podstawnej, aby pokryć każdy pierścień.
	<ol>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 Wilgotnym przez kolejne 30 minut, aby umożliwić polimeryzację drugiej warstwy matrycy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 150 μl / studzienkę uzupełnionej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i 2x104 Ifnar1-/- TANs (kontrolnych i traktowanych FK866) (krok 4.4).</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 14 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Zobrazuj za pomocą standardowego mikroskopu z kontrastem fazowym i oszacuj rozgałęzienia śródbłonka. Ilościowa ocena parametrów morfometrycznych i przestrzennych naczynia, w tym wskaźnika rozgałęzień, może być wykonywana automatycznie za pomocą programu do przetwarzania obrazów przeznaczonego do obrazów naukowych. 
	UWAGA: Reprezentatywne wyniki są przedstawione w Rysunek 3.</li>
</ol>
6. Adoptywny transfer leczonych neutrofili w allogenicznym modelu guza
<ol>
	<li>Przygotować komórki czerniaka B16F10 (krok 1.6) w PBS w stężeniu 6 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przygotuj 2 rodzaje neutrofili: neutrofile poddane działaniu FK866 i kontroluj nieleczone neutrofile (krok 4.4) w PBS w stężeniu 6 x 105 komórek/ml. Wymieszaj neutrofile z komórkami czerniaka B16F10 (końcowy stosunek neutrofili do komórek nowotworowych 1:10), aby uzyskać 2 rodzaje mieszanin komórek.</li>
	<li>Weź 10 samic myszy WT w wieku 8-12 tygodni, po 5 w każdej grupie. Ogol skórę na boku golarką elektryczną i zdezynfekuj 70% etanolem.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórkowej (krok 6.2) podskórnie za pomocą strzykawki insulinowej i igły o średnicy 0,4 mm obu grupom myszy. Umieść 1-5 myszy z tej samej grupy w jednej klatce.</li>
	<li>W 2 dniu przygotuj 2 rodzaje neutrofili: neutrofile traktowane FK866 i kontroluj nieleczone neutrofile (krok 4.4) w PBS w stężeniu 6 x 105 komórek/ml. Wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórkowej (krok 6.4) dożylnie do żyły ogonowej za pomocą strzykawki insulinowej i igły o średnicy 0,4 mm obu grupom myszy. Umieść myszy z powrotem w klatce.</li>
</ol>
7. Pomiar wzrostu guza, badanie histologiczne
<ol>
	<li>Monitoruj wzrost guza co drugi dzień. Oceń rozmiar guza za pomocą suwmiarki i oblicz objętość guza za pomocą wzoru V=4/3*π*(h*w2)/8 (h = wysokość, w = szerokość, głębokość = szerokość).</li>
	<li>Myszy ofiarować w dniu 14 w komorze CO2. Usuń guzy i zmierz masę guza.</li>
	<li>Zamrozić guzy w optymalnym roztworze do temperatury cięcia w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozmrozić próbki do temperatury -20 °C i przygotować skrawki o wielkości 5 μm za pomocą kriotomii. Pozostaw kriokaty do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze 20 °C. Zamocuj sekcje w zimnym acetonie w temperaturze -20 °C na 2 minuty i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Blok z przeciwciałami przeciwko blokowi Fc (CD16/CD32, zapas 0,5 mg/ml 1:500) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Barwienie króliczym przeciwciałem przeciw mysim laminom gamma (1:1500 w PBS, 200 μl) przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C. Przemyć trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Barwienie wtórnym kozim przeciwciałem anty-króliczym (zapas 0,5 mg / ml, 1:400 w PBS), anty-mysim αSMA (1:500 w PBS) i 2 μl DAPI (zapas 5 mg / ml, 1:100 w PBS) w końcowej objętości 200 μl roztworu przeciwciała. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C w ciemności. Umyj trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Suszyć szkiełka podstawowe przez 20 minut w temperaturze 20 °C w ciemności. Mocowanie za pomocą bezwodnego podłoża montażowego do mikroskopii i przykrycie szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj badanie mikroskopowe. Określ ilościowo unaczynienie, licząc całkowitą liczbę (opcjonalnie powierzchnię) naczyń Laminin+ i liczbę (powierzchnię) naczyń rozwiniętych SMA+. 
	UWAGA: Aby przeprowadzić analizę obrazu, wykonaj wszystkie zdjęcia w tych samych warunkach (światło, kontrast, powiększenie). W takim przypadku parametry przetwarzania są stałe, a przetwarzanie obrazu staje się całkowicie automatyczne. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5.</li>
</ol>

<ol><li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li>
<li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor%2C+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes%2C+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase%2C+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li>
<li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD%28%2B%29-sirtuin-1-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li>
<li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622(2018).</li>
<li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+%28NAMPT%29+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li>
<li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B+cell+colony-enhancing+factor%2Fvisfatin%2C+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li>
<li>Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li>
<li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li>
<li>Wu, C. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li>
<li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li>
<li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FK866%2C+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase%2C+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li>
<li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacokinetics%2C+toxicities%2C+and+biologic+effects+of+FK866%2C+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Investigational+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li>
<li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs%3A+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li>
<li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Syndromes+and+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li>
<li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo postępów w chirurgicznym i farmakologicznym leczeniu nowotworów, skuteczna terapia pozostaje wyzwaniem. Ponieważ wiadomo, że komórki odpornościowe odgrywają ważną rolę w regulacji wzrostu guza, należy opracować nowe metody hamowania rakotwórczości takich komórek. Tutaj pokazujemy nowatorskie podejście do hamowania wzrostu guza poprzez adoptywny transfer antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem. Selektywne ukierunkowanie proangiogennej sygnalizacji NAMPT w TANs, przy użyciu inhibitora FK866, zapobiega sk...

Interferony typu I (IFN) odgrywają ważną rolę w stymulowaniu odpowiedzi gospodarza na nowotwory, ponieważ brak sygnalizacji IFN typu I powoduje znacznie podwyższony wzrost guza1. Jednym z mechanizmów zaangażowanych w ten proces jest regulacja aktywności rakotwórczej neutrofili związanych z nowotworem, która jest kontrolowana przez receptor czynnika stymulującego tworzenie kolonii 3 (CSF3R) w dół sygnalizacji2. Wykazano, że czynnik stymulujący tworzenie kolonii 3 (CSF3) lub czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów aktywuje sygnalizację z udziałem fosforybozylotransferazy nikotynamidu (NAMPT)3,4. NAMPT jest enzymem ograniczającym szybkość syntezy dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, który zwiększa glikolizę i reguluje naprawę DNA, ekspresję genów i reakcję na stres, promując przeżycie i proliferację komórek rakowych5. NAMPT ulega nadekspresji w wielu typach nowotworów, w tym w raku jelita grubego, jajnika, piersi, żołądka, prostaty i glejakach6. NAMPT jest niezbędny nie tylko dla komórek nowotworowych, ale także dla wielu innych typów komórek, które są obecne w nowotworach, takich jak komórki szpikowe - napędza ich różnicowanie4, hamuje apoptozę i stymuluje ekspresję wielu cytokin lub enzymów rozkładających macierz w makrofagach7.
Neutrofile związane z nowotworem reprezentują ważne modulatory wzrostu guza. Funkcje TAN są silnie zależne od dostępności IFN typu I, ponieważ cytokiny te mają pierwszorzędną aktywność przeciwnowotworową neutrofili. Wręcz przeciwnie, brak IFN wspiera rakotwórczą aktywację tych komórek, zwłaszcza ich właściwości proangiogenne. W związku z tym, myszy z niedoborem IFN rozwijają znacznie większe i lepiej unaczynione guzy, które są silnie naciekane przez pronowotworowe/proangiogenne neutrofile1,2,8,9,10. Co ważne, takie proangiogenne TAN wykazują podwyższoną aktywność NAMPT, co sugeruje jego istotną rolę w pronowotworowej polaryzacji neutrofili.
Zubożenie neutrofili za pomocą przeciwciała Ly6G lub zahamowanie ich migracji (przeciwciało CXCR2) powoduje zmniejszenie angiogenezy, wzrostu i przerzutów nowotworu1,8. Niemniej jednak, wytworzone przeciwciała monoklonalne są immunogenne, a ich podawanie wiąże się z szeregiem zagrażających życiu skutków ubocznych11. Leczenie małymi cząsteczkami, takimi jak inhibitor NAMPT FK866, które modulują rakotwórczość neutrofili, może pomóc w uniknięciu takich powikłań. Niestety, farmakologiczne ogólnoustrojowe hamowanie NAMPT, obok jego terapeutycznego wpływu na wzrost guza, prowadzi do poważnych skutków ubocznych, w tym toksyczności żołądkowo-jelitowej i małopłytkowości. W związku z tym ogólnoustrojowe stosowanie inhibitorów NAMPT nie jest możliwe12,13,14.
Z tego powodu proponujemy tutaj protokół, w którym aktywność NAMPT jest blokowana bezpośrednio w izolowanych TANs. Takie przeciwnowotworowe neutrofile są następnie adoptywnie przenoszone do gospodarza zawierającego nowotwór. Protokół ten pomoże uniknąć ogólnoustrojowych toksycznych skutków ubocznych związków, a jego wpływ na komórki docelowe zostanie utrzymany.

<table><tbody><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>5ml / 10ml / 25ml sterylne końcówki do pipety automatycznej</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>6006180 / 607180 / 760180</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płaskodenne płytki do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>833,920</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płaskodenne płytki do hodowli komórkowych</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z dnem w kształcie litery U</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>65018</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy mikroskop odwrócony AMG EVOS fl</td><td>AMG, Bothel, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-mysz CD11b</td><td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone</td><td>553312</td><td>klon M1/70, sprzężony z APC, 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-mysi Ly6G</td><td>BioLegend, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>127608</td><td>klon 1A8, sprzężony z PE, 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS AriaII</td><td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>sortownik komórek</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Vogel Niemcy, Kevelaer, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casy licznik komórek</td><td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics 50&micro; m / 100 i mikro; m Filtry sterylne</td><td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Niemcy</td><td>04-004-2327 / 04-004-2328</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Niemcy</td><td>4706</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td><td>BioLegend, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>422801</td><td>Zapasy: 5 mg / ml</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>D4818-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>41966-029</td><td>DMEM kompletny: DMEM + 10% FBS + 1% penicylina-streptomycyna</td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosufoksyd)</td><td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Niemcy</td><td>WAK-DMSO-10</td><td>CryoSure-DMSO</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka</td><td>PromoCell, Heidelberg, Niemcy</td><td>c-22010</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Surowica bydlęca płodu)</td><td>Biochrom, Berlin, Niemcy</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (anty-mysz CD16/32)</td><td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone</td><td>553142</td><td>klon 2.4G2, Zapas: 0,5 mg / ml</td></tr><tr><td>FK 866 chlorowodorek</td><td>Axon Medchem, Groningen, Holandia</td><td>Axon 1546</td><td>Zapas: 100 mM</td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Królicza H& L</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>ab97075</td><td>Cy3-sprzężony, Zapas: 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Heracell 240i</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td>51026334</tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>12440-053</td><td>IMDM kompletny: IMDM + 10% FBS + 1% penicylina-streptomycyna</td></tr><tr><td>Golarka Isis GT420</td><td>B. Braun Asculap, Suhl, Niemcy</td><td>90200714</td><td></td></tr><tr><td>Membrana podstawna Matrigel Matrix</td><td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Holandia</td><td>7205011</td><td></td></tr><tr><td>Microtomowy kriostat Microm HM 505 N</td><td>Microm International GmbH, Walldorf, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna antyaktyna, & alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>F3777</td><td>FITC-sprzężony, brak informacji o koncentracji zapasów</td></tr><tr><td>Igły 0,4 mm x 16 mm</td><td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>Neomount</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>HX67590916</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Stany Zjednoczone</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta automatyczna Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te, Eberstadt, Niemcy</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antiblade Mountant z DAPI</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>królik anty mysz Laminin gamma 1 chain</td><td>Immundiagnostik, Bensheim, Niemcy</td><td>AP1001.1</td><td>Brak informacji o koncentracji zapasów</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>A1105-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny skalpel do utylizacji (nr 15)</td><td>MedWare, Neapol, Stany Zjednoczone</td><td>120920</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td>303172</tr><tr><td>Strzykawki 10 ml</td><td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>T75 sterylne kolby do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>833,911,302</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Torrance, Stany Zjednoczone</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Zeiss AxioObserver.Z1 z sekcją optyczną ApoTome</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transfer manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z guzem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Coraz większą uwagę poświęca się wkładowi neutrofili w regulację nowotworzenia. Komórki te są niejednorodne i w zależności od środowiska nowotworowego mogą mieć zdolność pro- lub przeciwnowotworową. Jedną z ważnych cytokin regulujących funkcje neutrofili w kontekście guza są interferony typu I. W obecności interferonów neutrofile zyskują właściwości przeciwnowotworowe, w tym cytotoksyczność czy stymulację układu odpornościowego. I odwrotnie, brak sygnalizacji interferonu powoduje wyraźną aktywność pronowotworową, charakteryzującą się silną stymulacją angiogenezy guza. Niedawno udało nam się wykazać, że właściwości proangiogenne neutrofili zależą od aktywacji szlaku sygnałowego fosforybozylotransferazy nikotynamidu (NAMPT) w tych komórkach. Hamowanie tego szlaku w neutrofilach związanych z nowotworem prowadzi do ich silnego fenotypu antyangiogennego. W tym miejscu demonstrujemy nasz nowo opracowany model pozwalający na ocenę in vivo potencjału rakotwórczego manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem (TAN). Krótko mówiąc, proangiogenne neutrofile związane z nowotworem można wyizolować od myszy z niedoborem interferonu i zrepolaryzować do fenotypu antyangiogennego poprzez blokowanie sygnalizacji NAMPT. Aktywność angiogenną tych komórek można następnie ocenić za pomocą testu pierścienia aortalnego. Antyangiogenne TAN mogą być przenoszone do biorców typu dzikiego z nowotworem, a wzrost guza należy monitorować przez 14 dni. W dniu 14 myszy są uśmiercane, guzy usuwane i cięte wraz z oceną ich unaczynienia. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół zapewnia nowatorskie narzędzie do oceny zdolności angiogennej in vivo komórek pierwotnych, takich jak neutrofile związane z nowotworem, bez konieczności stosowania sztucznych modeli linii komórkowych neutrofili. Vc

Stosując opisaną tutaj procedurę, neutrofile Ifnar1-/- wyizolowano z guzów i poddano działaniu inhibitora NAMPT FK866 przez 2 h. Jako kontrolę wykorzystano niepoddane działaniu inhibitora neutrofile Ifnar1-/-. Skuteczność zabiegu oceniono za pomocą testu pierścienia aorty (aortic ring assay), który odzwierciedla kluczowe etapy angiogenezy (degradacja macierzy, migracja, proliferacja, reorganizacja). Wykazano, że neutrofile traktowane FK866 mają znac...

Tutaj pokazujemy potencjał terapeutyczny antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem po ich przeniesieniu do myszy z nowotworem. Protokół ten może być wykorzystany do manipulowania aktywnością neutrofili ex vivo, a następnie do oceny ich funkcjonalności in vivo w rozwijających się nowotworach. Jest to odpowiedni model do badania potencjalnych immunoterapii opartych na neutrofilach.

Transfer manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z guzem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Nasz protokół zapewnia nowatorskie narzędzie do oceny potencjału angiogennego pierwotnych neutrofili związanych z nowotworem in vivo bez konieczności stosowania sztucznych modeli linii komórkowych neutrofili. Bezpośrednie hamowanie fosforybozylotransferazy nikotynamidu, w skrócie NAMPT, w neutrofilach związanych z nowotworem, a następnie ich adoptywne przeniesienie do zwierząt z nowotworem, pozwala na manipulowanie neutrofilami bez ogólnoustrojowych toksycznych skutków ubocznych. Zademonstrujemy potencjał terapeutyczny zmanipulowanych antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem po przeniesieniu do gospodarzy zawierających nowotwór w celu zbadania potencjalnych immunoterapii opartych na neutrofilach w różnych modelach nowotworowych.Aby stworzyć allogeniczny model myszy nowotworowej, ogol skórę 10 ośmio- do 12-tygodniowych samic myszy z nokautem podjednostki interferonu alfa i receptora beta 1 za pomocą golarki elektrycznej i zdezynfekuj skórę 70% etanolem, a następnie załaduj trzy razy 10 do sześciu komórek czerniaka B16F10 na mililitr PBS do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o wymiarach 0,4 na 19 milimetrów i wstrzyknij 100 mikrolitrów zawiesiny podskórnie na

transfer-manipulated-tumor-associated-neutrophils-into-tumor-bearing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje test do generowania antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem (TANs). Po pobraniu mysiego guza czerniaka zawierającego proangiogenne TAN, pojedyncze komórki są izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) i traktowane inhibitorem fosforybozylotransferazy nikotynamidu (NAMPT) w celu zmniejszenia zdolności do stymulowania angiogenezy.

Generowanie antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj metodę transferu manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z guzem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo. Protokół umożliwia badanie immunoterapii opartych na neutrofilach.

Transfer manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z guzem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo

Przeglądaj więcej filmów