Name: Najważniejsze informacje ze zbioru metod JoVE: Interakcje białko-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Poznaj kluczowe metody badania interakcji białko-białko z kolekcji JoVE. Dowiedz się, jak analizować powiązania między białkami w badaniach biologicznych i molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za granty NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) oraz Alberta Prion Research Institute/Alberta Innovates Bio Solutions (201600018) przyznane M.O.

<ol><li>Jin, L., Wang, W., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interaction+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interaction by small molecules.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 435-456 (2014).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. 38 (1), 79-111 (2019).</li>
<li>Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cyclin-dependent+Kinase+1+Specific+Phosphorylation+Sites+by+an+In+Vitro+Kinase+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+Assay+Using+Endogenous+Nuclear+Proteins+from+Cells+Cultured+Under+Hypoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration-free+Vitro+of+Protein+Homo-oligomerization+Using+Commercial+Instrumentation+and+Free%2C+Open+Source+Brightness+Analysis+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calibration-free Vitro of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58157(2018).</li>
<li>Luzarowski, M., Wojciechowska, I., Skirycz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2+in+1%3A+One-step+Affinity+Purification+for+the+Parallel+Analysis+of+Protein-Protein+and+Protein-Metabolite+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57720(2018).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Heterodimerization+of+Protein+Isoforms+Using+an+Situ+Ligation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an Situ Ligation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57755(2018).</li>
<li>Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Interactions+of+Globular+and+Filamentous+Proteins+by+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+%28NMR%29+and+Microscale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST).</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58537(2018).</li>
<li>Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Macromolecules+in+Solution+using+Small+Angle+X-Ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58538(2018).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Lundberg, E., Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics%3A+a+powerful+discovery+tool+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Interakcje białko-białko (IPP) mają fundamentalne znaczenie dla generowania efektów biologicznych. Wiele z nich jest ściśle związanych z chorobą i coraz częściej uznaje się, że stanowią one ważne cele dla działania leków1. Dostępnych jest wiele technik badania tych oddziaływań białkowych, z których niektóre są omówione w tym zbiorze lub w innych artykułach JoVE. Każda technika ma swoje zalety i ograniczenia2; jednak nie ma jednej idealnej techniki dla wszystkich IPP ze względu na ogromną różnorodność tych interakcji, które zachodzą w różnych przedziałach subkomórkowych, o szerokim zakresie powinowactwa (pikomolarny do milimolowego) i mogą mieć charakter tylko przejściowy.
Testy kinaz in vitro są pośrednim podejściem do badania IPP, które można wykorzystać do analizy, w jaki sposób kinazy pełnią swoją funkcjonalną rolę przenoszenia grupy fosforanowej z ATP do substratu. Cui i wsp.3 wykorzystują tę technikę, w połączeniu z trawieniem tryptycznym i spektrometrią mas, do identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny na fragmencie ludzkiego białka centromerowego F (CENP-F). Do funkcjonalnej weryfikacji nowych miejsc fosforylacji autorzy stosują test wiązania, łączący CENP-F zawierający mutację fosfomimetyczną i α karioferyny, receptor transportu jądrowego, zapewniając w ten sposób walidację krzyżową.
Koimmunoprecypitacja jest szeroko stosowaną metodą badania IPP, w której przeciwciało jest wykorzystywane do wychwytywania określonego celu wraz z innymi cząsteczkami białka, które są z nim związane. Zheng i współpracownicy4 stosują tę technikę do badania czynników indukowanych hipoksją (HIF), które działają jako heterodimery złożone z podjednostki α regulowanej tlenem i konstytutywnie wyrażonej podjednostki β, znanej również jako ARNT3. Interesującą informacją na temat ich protokołu jest to, że komórki są indukowane i zbierane w warunkach niedotlenienia, a endogenne białka z frakcji jądrowych są następnie koimmunoprecypitowane. Jak zauważają autorzy, jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie jest ona w stanie określić, czy IPP są bezpośrednie, czy pośrednie.
Nolan i wsp.5 przedstawiają protokół pomiaru liczby cząsteczek i ich jasności w obrazach z mikroskopii fluorescencyjnej "Liczba i jasność" (N&B), który można zastosować do wykrywania homooligomeryzacji białek. Technika ta może być stosowana zarówno in vitro, jak i in vivo i została zastosowana do dokładnego ilościowego określenia stanu oligomerycznego FKBP12F36V znakowanych mVenus przed i po dodaniu leku dimeryzującego. Autorzy omawiają zalety tej techniki w porównaniu z pokrewnymi technologiami i podkreślają znaczenie korekcji bielenia i długotrwałych wahań intensywności. Mikroskopy konfokalne wyposażone w detektory cyfrowe ułatwiają oznaczanie ilościowe, ale N&B jest również możliwe w przypadku detektorów analogowych.
Oczyszczanie powinowactwa kompleksów wielobiałkowych, wraz z identyfikacją ich składników, jest szeroko stosowaną techniką zrozumienia funkcji takich skompleksowanych białek. W protokole Luzarowskiego i wsp.6 technika ta idzie o krok dalej poprzez jednoczesne scharakteryzowanie zarówno IPP, jak i interakcji białko-metabolit (PMI) w transgenicznych komórkach roślinnych Arabidopsis. Tagged Kinazy difosforanowe nukleozydowe są oczyszczane pod względem powinowactwa za pomocą procedury znacznika oczyszczania tandemowego (TAP), a wychwycone białka i małe cząsteczki są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Wyjątkowość tego protokołu polega na możliwości identyfikacji zarówno ligandów hydrofobowych, jak i hydrofilowych; Jest to protokół ekstrakcji "trzy w jednym", który umożliwia badanie zarówno IPP, jak i PMI oraz stosuje oczyszczanie powinowactwa do sadzenia komórek.
Test ligacji zbliżeniowej ma tę zaletę, że służy do wykrywania interakcji między endogennymi białkami w komórkach i tkankach. Karchugina i Chernoff7 wykorzystują tę technikę do wykazania obecności heterodimerów kinaz MST1 i MST2 w ludzkich komórkach Schwanna (HSC) i ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK-293). Ich artykuł zawiera kilka cennych wskazówek, jak skutecznie wykonać tę technikę. Wymagane są odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe wyhodowane u różnych gatunków przeciwko każdemu białku oddziałującemu, a ponieważ swoistość i czułość przeciwciał są kluczowe, stężenia przeciwciał powinny być precyzyjnie dostrojone. Autorzy stwierdzili, że szkiełka ze szklaną komorą są wygodne do analizy wielu linii komórkowych i kombinacji przeciwciał, ale zauważyli, że konieczne jest usunięcie całej silikonowej wkładki między studzienkami, aby uniknąć różnic w odległości konfokalnej podczas mikroskopii. Ponadto do walidacji wyników stosuje się różne kontrole dodatnie i ujemne.
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest czułym testem, który można wykorzystać do zapewnienia rozdzielczości na poziomie atomowym i informacji ilościowych na temat interakcji białek i interakcji białko-ligand. Winkelaar i współpracownicywykorzystują tę technikę do badania interakcji dwóch białek (wimentyny i envoplakiny) znajdujących się w desmosomach, strukturach komórkowych zaangażowanych w adhezję komórka-komórka, które zwykle znajdują się w tkankach doświadczających intensywnego obciążenia mechanicznego. Autorzy wykorzystują 15-znakowanąN domenę wimentyny i uzyskują widmo 2D za pomocą heterojądrowej pojedynczej korelacji kwantowej (HSQC). W obecności domeny z envoplakiny obserwuje się rozległe poszerzenie linii i zanik pików, co jest zgodne z interakcją białkową. Autorzy dalej badają podstawy oddziaływania, wykorzystując mutagenezę i termoforezę w mikroskali (MST) w celu uzyskania informacji ilościowych.
Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS) to technika, którą można wykorzystać do dostarczenia informacji o wielkości i konformacjach makrocząsteczki w roztworze oraz wygenerowania molekularnej otoczki dużych, wielodomenowych lub kompleksów białkowych w niskiej rozdzielczości. W protokole Mrozowicha i wsp.9 technika ta służy do generowania niskorozdzielczej struktury nidogenu-1 i lamininy γ-1 w kompleksie. Technika ta może być interesująca dla naukowców badających IPP w dużych białkach z wieloma domenami globularnymi, które są zbyt duże dla spektroskopii NMR i są trudne do krystalizacji dla krystalografii rentgenowskiej.
Szacuje się, że w interaktomii międzyludzkimzachodzi około 650 000 interakcji – wystarczająco dużo, aby naukowcy zajmujący się tą dziedziną mieli zajęcie jeszcze przez jakiś czas. Niedawnym osiągnięciem, które stało się możliwe dzięki postępom w mikroskopii, spektrometrii mas i uczeniu maszynowym, jest proteomika przestrzenna, która może dostarczyć w przyszłości cennych informacji w tejdziedzinie11. Ten zbiór metod PPI pomoże naukowcom stawić czoła temu ważnemu wyzwaniu, unikając jednocześnie potencjalnych pułapek.

najważniejsze informacje ze zbioru metod jove: interakcje białko-białko

JoVE Methods Collection Highlights: Protein-Protein Interactions

Najważniejsze informacje ze zbioru metod JoVE: Interakcje białko-białko

jove-methods-collection-highlights-protein-protein-interactions

Without Section

Poznaj kluczowe metody badania interakcji białko-białko z kolekcji JoVE. Dowiedz się, jak analizować powiązania między białkami w badaniach biologicznych i molekularnych.

Najważniejsze informacje ze zbioru metod JoVE: Interakcje białko-białko

Przeglądaj więcej filmów