Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Protokół ten oferuje znakowaną biotyną platformę do badania interakcji białko-kwas nukleinowy, która okazuje się solidna, niezawodna, wydajna i niedroga. Ta sama partia znakowanych biotyną kwasów nukleinowych może być używana przez długi okres czasu, zachowując powtarzalność eksperymentów. Wreszcie, wszystkie opisane tutaj testy znakowane biotyną można wykonać w ciągu jednego dnia i nie wymagają specjalnego sprzętu.

Procedurę zademonstruje Lina Yu, doktorantka z naszego laboratorium. Przygotuj konstrukty MEIOB i MOV10 i przekształć je w odpowiednie bakterie. Aby wyekstrahować MEIOB, należy granulować komórki przez wirowanie i ponownie zawiesić je w 20 mililitrach lodowatego buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco lub DPBS.

Sonikować zawiesinę bakteryjną na lodzie. Następnie odwirować lizat w temperaturze 12 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki. Umyj wstępnie kulki glutationu-sefarozy i inkubuj je z lizatem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Odwiruj mieszaninę w temperaturze 750 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę, aby granulować kulki. Opłucz kulki 10 mililitrami lodowatego PBS osiem razy. Następnie dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego, inkubuj kulki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut i eluuj kulki przez odwirowanie.

Powtórz elucję sześć razy i połącz ze sobą sześć frakcji. Przenieść eluowane białka do filtra odśrodkowego i zagęścić przez odwirowanie w ilości 7 500 g do końcowej objętości od 100 do 200 mikrolitrów. Aby wyekstrahować MOV10, należy sprymować białko w HEK293T komórkach i zagnieździć komórki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach buforu do lizy komórek z kompletnym koktajlem inhibitorów proteazy wolnych od EDTA i inkubować przez 30 minut na lodzie. Następnie odwirować lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj koraliki magnetyczne anty-FLAG, przemywając je dwukrotnie buforem K150.

Po umyciu ponownie zawieś kulki w jednym mililitrze lodowatego buforu K150 i inkubuj je przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnymi obrotami. Zbierz koraliki na magnesie i usuń supernatant. Dodaj kulki do lizatu komórkowego i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Przemyć kulki buforem K150 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i ponownie zawiesić kulki w 300 mikrolitrach buforu elucyjnego FLAG. Umieść koraliki na magnesie, zbierz supernatant z białkami MOV10 i określ stężenie białka. Przygotuj oligonukleotydy RNA, rozcieńczając każdy oligonukleotyd do 20 mikromolów i wyżarzając je w celu utworzenia dupleksów RNA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

W teście przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej MEIOB (EMSA) należy wymieszać odczynniki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Dodaj wodę, aby uzyskać końcową objętość reakcji 20 mikrolitrów. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie dodać 5x bufor zatrzymujący.

W przypadku testu aktywności helikazy MOV10 wymieszaj odczynniki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodaj wodę, aby uzyskać końcową objętość reakcji 20 mikrolitrów. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, 30 minut i 60 minut, a następnie dodaj 5x bufor zatrzymujący, aby zatrzymać reakcję. Następnie przygotuj 20% natywny żel poliakryloamidowy i załaduj od 20 do 25 mikrolitrów każdej próbki do każdej studzienki.

Uruchom żel pod napięciem 100 woltów w łaźni lodowej, aż niebieski marker bromofenolowy przeniesie się do dolnej ćwiartki żelu. Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny. Ważne jest, aby obchodzić się z nim przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.

Zdemontuj płytki żelowe i przytnij żel, usuwając studnie załadunkowe i nieużywane pasy. Umieść żel w 0,5 buforze TBE. Przytnij bibułę filtracyjną i membranę nylonową do rozmiaru żelu, wstępnie zwilż papier i membranę, a następnie zmontuj stos do przeniesienia.

Przenieść próbki z żelu na membranę w półsuchym aparacie elektroforetycznym o natężeniu 90 miliamperów przez 20 minut. Następnie należy usieciować próbki, napromieniając membranę z prędkością 120 milidżuli na centymetr kwadratowy przez 45 do 60 sekund. W celu detekcji chemiluminescencyjnej zacznij od dodania 20 mililitrów buforu blokującego do membrany i inkubacji przez 15 do 30 minut, delikatnie wstrząsając.

Ostrożnie wyjmij bufor blokujący i zastąp go buforem sprzężonym/blokującym. Ponownie inkubować membranę przez 15 minut. Umyj membranę cztery razy, wstrząsając przez pięć minut na pranie.

Następnie dodaj 30 mililitrów buforu równowagi substratu do membrany i inkubuj ją przez pięć minut, wstrząsając z prędkością od 20 do 25 obr./min. Przykryj całą powierzchnię membrany roztworem roboczym substratu i inkubuj przez pięć minut. Po inkubacji skanuj membranę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego przez jedną do trzech sekund.

Oczyszczanie białek A, C i E MEIOB można zweryfikować za pomocą barwienia Coomassie na niebiesko i analizy western blot. Czerwone strzałki wskazują pozycje oczyszczonych białek MEIOB. Interakcje MEIOB i jednoniciowego DNA można wizualizować za pomocą EMSA.

Obserwuje się wiązanie i rozszczepienie w zależności od stężenia. Zgodnie z oczekiwaniami, tylko MEIOB-A typu dzikiego oddziałuje z DNA, podczas gdy zmutowane MEIOB-E i MEIOB-C nie. Można również zaobserwować interakcje MEIOB i jednoniciowego RNA.

MEIOB typu dzikiego wykazuje zależną od stężenia aktywność wiązania i egzonukleazy na jednoniciowym RNA. Jednak porównanie ilościowe pokazuje, że MEIOB wiąże DNA z większą wydajnością niż RNA. Oczyszczanie MOV10 zweryfikowano za pomocą barwienia Coomassie na niebiesko, a aktywność helikazy białka mierzono na dupleksie RNA z pięcioma nawisami pierwszymi.

Wraz ze wzrostem czasu reakcji MOV10 stopniowo rozwija dwuniciowy RNA. Aby obniżyć koszt testu, detekcję chemiluminescencyjną można przeprowadzić za pomocą dwukrotnego rozcieńczenia odczynników z zestawu do wykrywania lub odczynników własnej produkcji. W opisanym tutaj protokole z powodzeniem wykorzystano znakowane biotyną kwasy nukleinowe jako substraty do testów biochemicznych in vitro, takich jak EMSA, oraz do reakcji enzymatycznych, w których biotyna nie była powszechnie stosowana.