Name: Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj niezawodne testy biochemiczne in vitro z etykietami biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy. Ta metoda zapewnia długotrwałą powtarzalność wyników bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy P. Jeremy'emu Wangowi (University of Pennsylvania) za pomocne edycje i dyskusje. Dziękujemy również Sigrid Eckardt za redakcję językową. K. Z. był wspierany przez National Key R&D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) oraz National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81471502, 31871503) oraz Program Innowacyjny i Przedsiębiorczy Prowincji Jiangsu. J. N. był wspierany przez Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. był wspierany przez granty National Natural Science Foundation of China (31771588) oraz 1000 Youth Talent Plan.

1. Preparat białkowy
<ol>
	<li>Konstrukcje wyrażeń MEIOB i MOV10
	<ol>
		<li>Generuj konstrukty ekspresji cDNA kodujące mysie MEIOB-A, C i E (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) i MOV10.
		<ol>
			<li>Ustaw reakcje reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla każdego fragmentu. Wymieszać 1 μl mysiego cDNA (z jądra myszy C57BL/6), 1 μl dNTP, 2 μl 10 μM startera do przodu, 2 μL 10 μM startera wstecznego, 1 μL polimerazy DNA, 25 μL buforu 2x PCR i 18 μL podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O) w końcowej objętości 50 μL. 
			UWAGA: Startery do amplifikacji fragmentów genów Meiob i Mov10 są wymienione w Tabeli 1.</li>
			<li>Reakcje PCR należy przeprowadzić przy użyciu następujących programów: 95 °C przez 5 min, 35 cykli ogrzewania w temperaturze 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 64 °C przez 15 s, wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 20 s (2 minuty dla wydłużenia MOV10) i końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 7 min. 
			UWAGA: Użyj pary starterów MEIOB-E (F1) i MEIOB-E-mut (R1) oraz MEIOB-E-mut (F2) i MEIOB-E (R2), aby amplifikować dwa segmenty zawierające zmutowaną sekwencję w nakładającej się sekwencji odpowiednio na końcach 3' i 5', aby wygenerować zmutowaną matrycę PCR.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeanalizuj amplifikowane DNA PCR za pomocą elektroforezy żelowej, szybko odetnij pasmo o wymaganym rozmiarze z żelu pod lampą UV i umieść w probówce wirówkowej. 
		UWAGA: Oczekiwane rozmiary produktów widoczne na żelu agarozowym dla MEIOB-A to 536 pz, MEIOB-C to 296 pz, MEIOB-E to 312 pz i 229 pz, a MOV10 to 3015 pz.</li>
		<li>Oczyść DNA PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
		<ol>
			<li>Dodać równą objętość rozpuszczalnego buforu do probówki wirówkowej z kroku 1.1.2 i stopić żel w łaźni wodnej o temperaturze 50-55 °C przez 5-10 minut, upewniając się, że kawałki żelu całkowicie się stopią. Odwirować na krótko, aby zebrać wszelkie kropelki ze ścianki probówki. 
			UWAGA: Stężenie masowe/objętościowe żelu i buforu do rozpuszczania wynosi 1 mg/μL.</li>
			<li>Umieścić kolumnę adsorpcyjną w probówce zbiorczej, przenieść roztwór zawierający rozpuszczony fragment żelu do kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty.</li>
			<li>Wyrzucić filtrat znajdujący się na dnie probówek zbiorczych. Dodać 600 μl buforu do przemywania do kolumny, odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę i wyrzucić filtrat.</li>
			<li>Powtórz krok 1.1.3.3 jeden raz.</li>
			<li>Umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty, aby usunąć cały pozostały bufor do płukania.</li>
			<li>Umieścić kolumnę adsorpcyjną w wysterylizowanej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodać 50 μl ddH2O do środka kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Zmierzyć stężenie DNA w eluacie za pomocą spektrofotometru.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Trawienie restrykcyjne plazmidów
		<ol>
			<li>Traw wektor pGEX-4T-1 za pomocą BamHI i NotI. W tym celu należy zmieszać 4 μg wektora pGEX-4T-1, 5 μl 10x buforu do trawienia, 1 μl BamHI i 1 μL NotI i ddH2O do uzyskania końcowej objętości reakcji 50 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
			<li>Trawić wektor pRK5 z BamHI i XhoI przez zmieszanie 4 μg wektora pRK5, 5 μl 10-krotnego buforu mineralizującego, 1 μL BamHI i 1 μL XhoI i ddH2O do końcowej objętości reakcji 50 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeanalizuj DNA wektora za pomocą elektroforezy żelowej, szybko odetnij pożądany rozmiar pasma z żelu za pomocą skalpela pod lampą UV i umieść go w probówce wirówkowej.</li>
		<li>Oczyścić DNA wektora za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu jak w ppkt 1.1.3 zgodnie z instrukcją producenta. 
		UWAGA: Długość zlinearyzowanych plazmidów: pGEX-4T-1, 4,4 kb; pRK5, 4.7 kb.</li>
		<li>Ustawić standardową reakcję ligacji rekombinowanej, łącząc 0,03 pmol zlinearyzowanego wektora, 0,06 pmol fragmentu cDNA, 2 μl ligazy i 4 μl 5x buforu ligazy i ddH2O w końcowej objętości reakcji 10 μL. 
		UWAGA: Sklonuj MEIOB-A, C i E do wektora pGEX-4T-1 i MOV10 do wektora pRK5.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie natychmiast schłodzić reakcję przez 5 minut na lodzie. Przekształć rekombinowane plazmidy MEIOB w bakterie BL21 i rekombinowane plazmidy MOV10 w bakterie DH5α. 
		UWAGA: Sprawdź wszystkie rekombinowane konstrukty za pomocą sekwencjonowania Sangera.</li>
		<li>Przygotować zapasy glicerolu w kulturach bakteryjnych zawierających zweryfikowane rekombinowane plazmidy, dodając równą objętość 50% glicerolu do płynnych kultur i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: W każdym kolejnym eksperymencie wyrzuć bakterie z wywaru glicerolu na świeżą płytkę agarową i użyj pojedynczej kolonii do ekspansji, jak opisano w kroku 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakty białkowe MEIOB z bakterii
	<ol>
		<li>Wybierz jedną kolonię każdego szczepu BL21 transfekowaną pustym lub rekombinowanym plazmidem pGEX-4T-1 zweryfikowanym przez sekwencjonowanie i zaszczepij w 3 ml LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.</li>
		<li>Zaszczepić 300 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny z 3 ml nocnej hodowli (od kroku 1.2.1). Hodować kultury przez wytrząsanie w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aż OD600 osiągnie 0,5-1,0.</li>
		<li>Indukować ekspresję białka przez dodanie beta-D-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG) do końcowego stężenia 0,2 mM. Inkubować kultury przez dodatkowe 3 godziny, wytrząsając przy 180 obr./min i w temperaturze 18 °C.</li>
		<li>Odwirować kulturę bakteryjną w temperaturze 3 500 x g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad w 20 ml lodowatego buforu soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco. Sonikuj zawiesinę bakteryjną na lodzie przez 25 cykli w krótkich seriach po 10 sekund (moc wyjściowa 20%), a następnie 2-3 s odpoczywając na lodzie.</li>
		<li>Odwirować lizat w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przenieść cały supernatant do świeżej probówki.</li>
		<li>Koraliki do prania wstępnego.
		<ol>
			<li>Dodaj 300 μl kulek glutationu i sefarozy do świeżej probówki o pojemności 15 ml i umyj kulki 10 ml lodowatego buforu PBS.</li>
			<li>Wirować w temperaturze 750 x g i temperaturze 4 °C przez 1 minutę, aby granulki zostały zebrane i wylać roztwór myjący.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać lizat do umytych kulek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Wirować przy 750 x g i 4 °C przez 1 minutę w celu osadzenia kulek. Opłucz kulki w 10 ml lodowatego PBS 8x.</li>
		<li>Eluować kulki za pomocą 1 ml buforu elucyjnego (10 mM glutation w 50 mM Tris-HCl o pH 8,0) 6x, inkubując w temperaturze 4 °C przez 10 minut przed każdym etapem elucji. Wirować w temperaturze 750 x g i 4 °C przez 1 minutę w celu osadzenia kulek. Zbierz i połącz 6 frakcji.</li>
		<li>Uwolnione białka przenieść do filtra odśrodkowego i zagęścić przez odwirowanie przy 7 500 x g, aby uzyskać końcową objętość 100-200 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakty białkowe MOV10 z komórek HEK293T
	<ol>
		<li>Przejściowo ulega ekspresji białek MOV10 w hodowanych komórkach HEK293T.
		<ol>
			<li>Przygotować plazmid MOV10-pRK5 o stężeniu >500 ng/μL.</li>
			<li>Nasiona HEK293T komórki w 15 cm szalkach. Gdy gęstość komórek osiągnie ~ 70%-90%, zastąp pożywkę do hodowli komórkowej świeżą zmodyfikowaną pożywką Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
			<li>W przypadku jednej transfekcji rozcieńczyć 60 μg plazmidowego DNA MOV10-pRK5 w 3 ml zredukowanej pożywki surowicy, a następnie dodać 120 μl odczynnika wzmacniającego transfekcję i dobrze wymieszać.</li>
			<li>W oddzielnej probówce rozcieńczyć 90 μl odczynnika do transfekcji 3 ml zredukowanej pożywki surowicy (bez penicyliny-streptomycyny) i dobrze wymieszać.</li>
			<li>Dodać rozcieńczone DNA do każdej probówki z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
			<li>Dodaj mieszaninę transfekcji do hodowli komórkowej i hoduj komórki przez ~36-48 godzin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po 36-48 godzinach zebrać komórki z każdej płytki do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć każdą osadkę 10 ml lodowatego PBS i zebrać komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy komórek zawierającego kompletny koktajl inhibitorów proteazy wolny od kwasu ehylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować przez 30 minut na lodzie. Odwirować lizat przy 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Dodaj 100 μl kulek magnetycznych anty-FLAG na miskę komórek w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Przemyj kulki magnetyczne 2x buforem K150 (50 mM HEPES przy pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
		<ol>
			<li>Ponownie zawiesić kulki magnetyczne w 1 ml lodowatego buforu K150.</li>
			<li>Inkubować kulki magnetyczne przez 2 minuty w temperaturze 4 °C z delikatnym obracaniem i granulować kulki magnetyczne za pomocą magnesu. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać kulki magnetyczne do supernatantu lizatu komórkowego z etapu 1.3.3 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Przemyć kulki magnetyczne związane z białkiem 3x buforem K150, następnie 2x K150 zawierającym 250 mM NaCl, a następnie 3x buforem K150 jak 1.3.5.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki w 300 μl buforu elucyjnego FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl przy pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu), dodać peptyd FLAG do końcowego stężenia 0,5 μg/μL i inkubować z kulkami na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, a następnie granulować kulki magnetyczne za pomocą magnesu.</li>
		<li>Zebrać supernatant zawierający eluowane białka MOV10, oznaczyć stężenie i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie kwasu nukleinowego
<ol>
	<li>Kupuj oligonukleotydy DNA i RNA z etykietami biotyny lub bez nich z odpowiedniego źródła. Rozcieńczyć każdy oligo w wolnym od RNaz ddH2O do 20 μM i utrzymywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: Oligonuligationy substratów DNA/RNA użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 2.</li>
	<li>Przygotować następującą mieszaninę do reakcji wyżarzania dwuniciowego RNA (dsRNA) do oznaczania aktywności helikazy MOV10: zmieszać 60 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-etanosulfonowego (HEPES) o pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 i ddH2O wolnym od RNaz w końcowej objętości reakcyjnej 20 μL.</li>
	<li>Oligonukleotydy wyżarzanego RNA tworzą dupleks RNA przez ogrzewanie mieszaniny górnej nici znakowanej biotyną (2 μM, stężenie końcowe) i 1,5-krotności jej nieznakowanej komplementarnej dolnej nici w buforze do wyżarzania (krok 2.2) w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie powoli schładzanie do temperatury pokojowej (RT).</li>
</ol>
3. Testy biochemiczne in vitro
<ol>
	<li>EMSA i reakcje enzymatyczne
	<ol>
		<li>W teście MEIOB EMSA zmieszaj 50 mM Tris HCl przy pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM ditiotreitolu (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mM (lub inne istotne stężenia, jak pokazano w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3) białko MEIOB oraz 10 nM oligonukleotydów znakowanych biotyną i ddH2O w końcowej objętości reakcyjnej 20 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut i dodać 5x bufor zatrzymujący (125 mM EDTA, 50% glicerolu) w celu zatrzymania reakcji.  </li>
		<li>Ustaw reakcje aktywności nukleazy MEIOB zgodnie z opisem w kroku 3.1.1, ale bez dodawania 10 mM EDTA.</li>
		<li>Do oznaczania aktywności helikazy MOV10 zmieszać 50 mM Tris-HCl przy pH 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL inhibitora RNazy, 10 nM substratu RNA znakowanego biotyną, 2 mM trifosforanu adenozyny (ATP), pułapki 100 nM RNA oraz 20 ng białka MOV10 i ddH2O w końcowej objętości reakcji 20 μL. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min, 30 min i 60 min. Dodaj 5-krotny bufor zatrzymujący, aby zatrzymać reakcję. 
		UWAGA: Pułapka RNA, nieznakowany biotyną oligo z sekwencją, komplementarnością do znakowanego oligo, co zapobiega ponownemu wyżarzaniu odwiniętego dsRNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żele poliakrylamidowe
	<ol>
		<li>Umyj płytki żelowe (16 cm x 16 cm) i grzebienie 1,5 mm. Zmontuj jednostki do elektroforezy żelowej.</li>
		<li>Aby przygotować 10% natywny żel poliakrylamidowy, wymieszaj 14 ml ddH2O, 1,25 ml 10x kwas tris-borowy EDTA (TBE), 8,3 ml 30% akrylamidu, 1,25 ml 50% glicerolu, 187,5 μl 10% świeżo przygotowanego nadsiarczanu amonu (APS) i 12,5 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).</li>
		<li>Aby przygotować 20% natywny żel poliakrylamidowy, wymieszaj 5,5 ml ddH2O, 1,25 ml 10x TBE, 1,25 ml 50% glicerolu, 16,7 ml 30% akrylamidu, 187,5 μl 10% APS i 12,5 μl TEMED.</li>
		<li>Roztwór akrylamidu należy natychmiast wlać do żelu i włożyć grzebień. Pozostaw mieszaninę do polimeryzacji przez około 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bieganie w żelu
	<ol>
		<li>Wyjmij grzebień, napełnij zbiorniki buforem do elektroforezy (0,5x TBE).</li>
		<li>Przepłukać studzienki próbki buforem 0,5x TBE, a następnie wstępnie uruchomić żel pod napięciem 100 V na lodzie przez 30 minut. Zastąp działający bufor nowym buforem 0,5x TBE.</li>
		<li>Załaduj 20-25 μl próbek do każdej studzienki.</li>
		<li>Do testów EMSA należy użyć 10% natywnego żelu akryloamidowego i 20% natywnego żelu akryloamidowego do testów enzymatycznych. Przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 100 V w łaźni lodowej, aż niebieski marker bromofenolu przeniesie się do dolnej ćwiartki żelu. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdemontuj płytki żelowe, przytnij żel, usuwając studzienki załadunkowe i nieużywane pasy. Umieść żel w 0,5 buforze TBE.</li>
	<li>Przyciąć bibułę filtracyjną i nylonową membranę do rozmiaru żelu. Wstępnie zwilż czystą bibułę filtracyjną i nylonową membranę.</li>
	<li>Złóż stos do przeniesienia.
	<ol>
		<li>Umieść wstępnie zwilżoną membranę na wstępnie zwilżonej bibule filtracyjnej.</li>
		<li>Umieść żel na membranie.</li>
		<li>Przykryj żel kolejną warstwą wstępnie zwilżonej bibuły filtracyjnej.</li>
		<li>Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, zwijając czystą pipetę od środka do krawędzi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść próbki z żelu na membranę w półsuchym aparacie elektroforetycznym o natężeniu 90 mA przez 20 minut.</li>
	<li>Przerwij przenoszenie, a następnie wysusz membranę na nowej bibule filtracyjnej przez 1 minutę.</li>
	<li>Sieciowanie próbek poprzez naświetlanie membrany napięciem 120 mJ/cm2 przez 45-60 s w sieciowniku wykorzystującym światło UV wyposażonym w żarówki o długości fali 254 nm (funkcja automatycznego sieciowania). Suszyć membranę na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Detekcja chemiluminescencji
	<ol>
		<li>Protokół 1: Użyj standardowej objętości komercyjnego zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych.
		<ol>
			<li>Dodać 20 ml buforu blokującego do membrany i inkubować przez 15-30 minut, delikatnie wstrząsając rotatorem przy 20-25 obr./min.</li>
			<li>Przygotować sprzężony/blokujący roztwór buforowy, dodając 66,7 μl stabilizowanego koniugatu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej do 20 ml buforu blokującego.</li>
			<li>Delikatnie usuń bufor blokujący i zastąp go buforem sprzężonym/blokującym. Inkubować przez 15 minut na rotatorze przy 20-25 obr./min.</li>
			<li>Umyj membranę 4x wstrząsając z prędkością 40-45 obr./min przez 5 min każde.</li>
			<li>Dodać 30 ml buforu równoważącego substrat do membrany. Inkubować membranę przez 5 minut, wytrząsając z prędkością 20-25 obr./min.</li>
			<li>Przygotować roztwór roboczy substratu, dodając 6 ml roztworu luminolu/wzmacniacza do 6 ml stabilnego roztworu nadtlenku. Unikaj światła. </li>
			<li>Pokryć całą powierzchnię membrany roztworem roboczym substratu i inkubować przez 5 minut.</li>
			<li>Skanuj membranę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego przez 1-3 s.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Protokół 2: Użyj 2x rozcieńczonego komercyjnego zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych i postępuj zgodnie z krokami 3.10.1.1-3.10.1.8.</li>
		<li>Protokół 3: Użyj samodzielnie przygotowanych odczynników6.
		<ol>
			<li>Przygotować bufor blokujący: zmieszać 0,1 M Tris-HCl o pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2 i 3% albuminę surowicy bydlęcej frakcji V. Bufor AP 7,5: zmieszać 0,1 M Tris-HCl przy pH 7,5, 0,1 M NaCl i 2 mM MgCl2. Bufor AP 9,5: zmieszać 0,1 M Tris-HCl przy pH 9,5, 0,1 M NaCl i 50 mM MgCl2. Bufor TE: zmieszać 10 mM Tris-HCl przy pH 8,0, 1 mM EDTA przy pH 8,0.</li>
			<li>Namoczyć membranę w buforze blokującym w temperaturze 30 °C na 1 godzinę.</li>
			<li>Dodać 8,5 μl fosfatazy alkalicznej streptawidyny do 10 ml buforu AP 7,5. Delikatnie wstrząsać membraną w tym roztworze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie przemyć membranę 2x w 15 ml buforu AP 7,5 przez 10 min.</li>
			<li>Przemyć membranę jeszcze raz w 20 ml buforu AP 9,5 przez 10 minut. Dodać 20 ml buforu TE, aby zatrzymać reakcję.</li>
			<li>Dodać 7,5 ml roztworu wywoływczego na membranę i skanować membranę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego przez 1-3 s.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox30+initiates+transcription+of+haploid+genes+during+late+meiosis+and+spermiogenesis+in+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes.</a> Development. 145 (13), (2018).</li>
<li>Watanabe, T., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+gene+expression+by+Piwi+proteins+and+piRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs.</a> Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).</li>
<li>Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+high-throughput+screening+method+to+identify+compounds+targeting+protein-nucleic+acids+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), 52(2015).</li>
<li>Hwang, H., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+induced+fluorescence+enhancement+%28PIFE%29+for+probing+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions.</a> Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+DNA-protein+interactions+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).</li>
<li>Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+quantitative+EMSA+and+its+application+in+the+study+of+RNA--protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).</li>
<li>Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+binding+affinity+of+poly%28ADP-ribose%29+to+specific+binding+proteins+as+a+function+of+chain+length%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length.</a> Nucleic Acids Research. 35 (21), 143(2007).</li>
<li>Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Protocol+for+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Infrared+Fluorescent+Dye-labeled+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Yan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+Nuclear+Receptor+Nur77+Inhibits+Cardiac+Hypertrophic+Response+to+Beta-Adrenergic+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+the+study+of+RNA-protein+interactions%3A+the+IRE%2FIRP+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Nishida, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+roles+of+mitochondrial+Papi+and+Zucchini+in+Bombyx+germline+piRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis.</a> Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).</li>
<li>Anders, C., Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+enzymology+of+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro enzymology of Cas9.</a> Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).</li>
<li>Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+plant+in+vitro+assay+system+for+pre-mRNA+cleavage+during+3%27-end+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation.</a> Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li>
<li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+Is+a+5%27+to+3%27+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), (2014).</li>
<li>Talwar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAD-box+protein+DDX43+%28HAGE%29+is+a+dual+RNA-DNA+helicase+and+has+a+K-homology+domain+required+for+full+nucleic+acid+unwinding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).</li>
<li>Nagy, N. M., Konya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+fast+and+slow+consecutive+processes+by+heterogeneous+isotope+exchange+using+P-32+radiotracer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radioanalytical+And+Nuclear+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer.</a> Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).</li>
<li>Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Probes+for+ALKBH2+Allow+the+Measurement+of+DNA+Alkylation+Repair+and+Drug+Resistance+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses.</a> Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+biorecognition%3A+the+%28strept%29avidin-biotin+system+as+a+model+for+protein-protein+and+protein-ligand+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction.</a> Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).</li>
<li>Trippier, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+strategies+for+the+biotinylation+of+bioactive+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules.</a> ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).</li>
<li>Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biotin-labeled+nucleic+acids+for+protein+purification+and+agarose-based+chemiluminescent+electromobility+shift+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Pulldown+of+Biotinylated+RNA+for+Detection+of+Protein-RNA+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes.</a> Bio-Protocol. 6 (24), (2016).</li>
<li>Bednarek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNAs+biotinylated+within+the+5%27+cap+and+protected+against+decapping%3A+new+tools+to+capture+RNA+-+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+Of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes.</a> Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).</li>
<li>Souquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIOB+Targets+Single-Strand+DNA+and+Is+Necessary+for+Meiotic+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination.</a> Plos Genetics. 9 (9), (2013).</li>
<li>Luo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIOB+exhibits+single-stranded+DNA-binding+and+exonuclease+activities+and+is+essential+for+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination.</a> Nature Communications. 4, 2788(2013).</li>
<li>Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+proteins+MEIOB+and+SPATA22+cooperatively+associate+with+the+single-stranded+DNA-binding+replication+protein+A+complex+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks.</a> Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Badanie interakcji białko-kwas nukleinowy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnych procesów biologicznych. Na przykład MEIOB jest białkiem specyficznym dla jąder, niezbędnym do mejozy i płodności u ssaków 25,26,27. MEIOB zawiera domenę OB, która wiąże się z jednoniciowym DNA i wykazuje aktywność egzonukleazy od 3' do 5'26, co bezpośrednio wiąże się z jej f...

Interakcje białko-kwas nukleinowy są zaangażowane w wiele istotnych procesów komórkowych, takich jak naprawa DNA, replikacja, transkrypcja, przetwarzanie RNA i translacja. Interakcje białek ze specyficznymi sekwencjami DNA w obrębie chromatyny są wymagane do ścisłej kontroli ekspresji genów na poziomie transkrypcji1. Precyzyjna regulacja potranskrypcyjna licznych kodujących i niekodujących RNA wymaga rozległych i skomplikowanych interakcji między dowolnym białkiem a RNA2. Te warstwy mechanizmu regulacji ekspresji genów obejmują kaskadę dynamicznych zdarzeń międzycząsteczkowych, które są koordynowane przez interakcje czynników transkrypcyjnych/epigenetycznych lub białek wiążących RNA z ich celami kwasów nukleinowych, a także interakcje białko-białko. Aby zbadać, czy białka in vivo są bezpośrednio lub pośrednio związane z kwasami nukleinowymi oraz w jaki sposób takie powiązania zachodzą i osiągają kulminację, przeprowadza się testy biochemiczne in vitro w celu zbadania powinowactwa wiązania lub aktywności enzymatycznej białek będących przedmiotem zainteresowania na zaprojektowanych substratach DNA i/lub RNA.
Opracowano wiele technik wykrywania i charakteryzowania kompleksów kwas-białko nukleinowe, w tym test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), określany również jako test opóźnienia żelu lub test przesunięcia pasma3,4,5. EMSA to wszechstronna i czuła metoda biochemiczna, która jest szeroko stosowana do badania bezpośredniego wiązania białek z kwasami nukleinowymi. EMSA opiera się na żelowym przesunięciu elektroforetycznym w pasmach, które są rutynowo wizualizowane za pomocą chemiluminescencji w celu wykrycia etykiet biotyny6,7, fluorescencja etykiet fluoroforowych8,9, lub autoradiografia radioaktywnych etykiet 32P10,11. Innymi celami badań biochemicznych są identyfikacja i charakterystyka aktywności białek w zakresie przetwarzania kwasów nukleinowych, takich jak reakcje oparte na nukleazach w celu oceny produktów rozpadu z substratów kwasów nukleinowych12,13,14 oraz testy odwijania struktury DNA/RNA w celu oceny aktywności helikazy15,16,17.
W takich testach aktywności enzymatycznej, kwasy nukleinowe znakowane radioizotopem lub fluoroforem są często używane jako substraty ze względu na ich wysoką czułość. Analiza zdjęć rentgenowskich reakcji enzymatycznych z udziałem radioznaczników znakowanych 32znakami P okazała się czuła i odtwarzalna18. Jednak w coraz większej liczbie laboratoriów na świecie stosowanie izotopów promieniotwórczych jest ograniczone lub nawet zabronione ze względu na zagrożenia dla zdrowia związane z potencjalnym narażeniem. Oprócz obaw o bezpieczeństwo biologiczne, inne wady to wymagany niezbędny sprzęt do prowadzenia pracy z izotopami promieniotwórczymi, wymagana licencja na radioaktywność, krótki okres półtrwania wynoszący 32P (około 14 dni) oraz stopniowe pogarszanie się jakości sondy z powodu radiolizy. W związku z tym opracowano alternatywne metody nieizotopowe (tj. znakowanie sondy fluoroforami umożliwia detekcję za pomocą obrazowania fluorescencyjnego19). Jednak w przypadku korzystania z sond znakowanych fluorescencyjnie potrzebny jest system obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Biotyna, powszechnie stosowana etykieta, łatwo wiąże się z makrocząsteczkami biologicznymi, takimi jak białka i kwasy nukleinowe. System biotyna-streptawidyna działa wydajnie i poprawia czułość wykrywania bez zwiększania niespecyficznego tła20,21. Oprócz EMSA, biotyna jest szeroko stosowana m.in. do oczyszczania białek i ściągania RNA22,23,24.
Ten protokół z powodzeniem wykorzystuje znakowane biotyną kwasy nukleinowe jako substraty do testów biochemicznych in vitro, które obejmują EMSA, oprócz reakcji enzymatycznych, w których biotyna nie była powszechnie stosowana. Domena MEIOB OB jest skonstruowana, a dwie mutanty (skrócenie i mutacja punktowa) są wyrażone jako białka fuzyjne GST25,26,27, a także rekombinowane białko fuzyjne FLAG myszy MOV1016. Niniejszy raport podkreśla skuteczność tego połączonego protokołu w oczyszczaniu białek i testach znakowanych biotyną do różnych celów eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescencyjny system obrazowania</td><td>Tanon, Chiny</td><td>5200</td><td></td></tr><tr><td>Digital sonifer</td><td>Branson, USA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 watów; 50/60 HZ</td></tr><tr><td>Półsucha bibuła elektroforetyczna</td><td>Hoefer, USA</td><td>TE77XP</td><td></td></tr><tr><td>Rewolwer rurowy&nbsp;</td><td>Kryształ, USA</td><td>3406051</td><td></td></tr> Filtr sieciujący <tr><td>światłem UV</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4&nbsp;</td><td>Milipore, Stany Zjednoczone</td><td>UFC801096</td><td>4 ml/10 K</td></tr><tr><td>Membrana nylonowa</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>TG263940A</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane z powłoką TC</td><td>Corning, USA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane z powłoką TC</td><td>Corning, USA</td><td>430597</td><td>150 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki do mikroprobówek</td><td>AXYGEN, USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki</td><td>Corning, USA</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Odczynniki&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>SunShine Bio, Chiny</td><td>8h288h28</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Anti-FLAG M2</td><td>Sigma, USA</td><td>M8823</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Thermo Scientific, Stany Zjednoczone</td><td>591136</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznej BCIP/NBT</td><td>Beyotime, Chiny</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>CelLyticTM M Liza komórek Odczynnik&nbsp;</td><td>Sigma, Stany Zjednoczone</td><td>107M4071V</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania jednoetapowego ClonExpress II&nbsp;</td><td>Vazyme, Chiny</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>T1269950</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, Stany Zjednoczone</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>Bufor DPBS</td><td>Gibco, USA</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>AM9260G</td><td>0,5 m</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche, Stany Zjednoczone</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid Kit&nbsp;</td><td>Vazyme, Chiny</td><td>&nbsp; DC202</td><td></td></tr><tr><td>FastPure Gel Mini zestaw do ekstrakcji DNA</td><td>Vazyme, Chiny</td><td>DC301-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, USA</td><td></td> peptyd 10437028 <td></td></tr><tr><td>FLAG</td><td>Sigma, USA</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma, USA</td><td>SHBK3676</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw zbiorczy GST</td><td>GE Healthcare, USA</td><td>27-4570-01</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma, Stany Zjednoczone</td><td>SLBZ2837</td><td>1 M&nbsp;</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>KoAc</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td>127-08-02</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofektaminy 3000</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9530G</td><td>1 M</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td>5 M&nbsp;</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, Stany Zjednoczone</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM podłoże</td><td>Gibco, Stany</td><td>Zjednoczone 31985062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, Stany Zjednoczone</td><td>10010023</td> Inhibitor <td>RNazy pH 7,4</td></tr><tr><td></td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna fosfataza alkaliczna</td><td>Promega, USA</td><td>V5591</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris-HCI&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td>1 M, PH 7,4</td></tr><tr><td>Bufor Tris-HCI&nbsp;</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>15568025</td><td>1 M, PH 8.0</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td>A600560</td><td></td></tr></tbody></table>

testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Interakcje białko-kwas nukleinowy odgrywają ważną rolę w procesach biologicznych, takich jak transkrypcja, rekombinacja i metabolizm RNA. Eksperymentalne metody badania interakcji białko-kwas nukleinowy wymagają użycia znaczników fluorescencyjnych, izotopów promieniotwórczych lub innych znaczników do wykrywania i analizowania określonych cząsteczek docelowych. Biotyna, nieradioaktywny znacznik kwasu nukleinowego, jest powszechnie stosowana w testach przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), ale nie jest regularnie stosowana do monitorowania aktywności białek podczas procesów kwasów nukleinowych. Protokół ten ilustruje użyteczność znakowania biotyną podczas reakcji enzymatycznych in vitro, wykazując, że etykieta ta dobrze współpracuje z szeregiem różnych testów biochemicznych. W szczególności, zgodnie z wcześniejszymi odkryciami przy użyciu radioizotopowych substratów 32znakowanych P, potwierdzono za pomocą EMSA znakowanego biotyną, że MEIOB (białko specyficznie zaangażowane w rekombinację mejotyczną) jest białkiem wiążącym DNA, że MOV10 (helikaza RNA) rozwiązuje znakowane biotyną struktury dupleksowe RNA i że MEIOB rozszczepia jednoniciowe DNA znakowane biotyną. Badanie to pokazuje, że biotyna jest zdolna do podstawiania 32P w różnych testach biochemicznych związanych z kwasami nukleinowymi in vitro.

Struktura białkowa MEIOB oraz konstrukty ekspresyjne wykorzystane w niniejszym badaniu zostały przedstawione na Rysunku 1A. Fałdy OB w MEIOB to kompaktowe struktury przypominające beczki, które potrafią rozpoznawać i oddziaływać z jednoniciowymi kwasami nukleinowymi. Jedna z domen OB (aa 136-307, konstrukt A) wiąże jednoniciowe DNA (ssDNA); skrócone białko (truncacje aa 136-178, konstrukt C) oraz forma z mutacją punktową (mutacja R235A, konstrukt E) MEIOB nie wykazują aktywn...

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Protokół ten oferuje znakowaną biotyną platformę do badania interakcji białko-kwas nukleinowy, która okazuje się solidna, niezawodna, wydajna i niedroga. Ta sama partia znakowanych biotyną kwasów nukleinowych może być używana przez długi okres czasu, zachowując powtarzalność eksperymentów. Wreszcie, wszystkie opisane tutaj testy znakowane biotyną można wykonać w ciągu jednego dnia i nie wymagają specjalnego sprzętu.Procedurę zademonstruje Lina Yu, doktorantka z naszego laboratorium. Przygotuj konstrukty MEIOB i MOV10 i przekształć je w odpowiednie bakterie. Aby wyekstrahować MEIOB, należy granulować komórki przez wirowanie i ponownie zawiesić je w 20 mililitrach lodowatego buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco lub DPBS.Sonikować zawiesinę bakteryjną na lodzie. Następnie odwirować lizat w temperaturze 12 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki. Umyj wstępnie kulki glutationu-sefarozy i inkubuj je z lizatem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny.Odwiruj mieszaninę w temperaturze 750 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę, aby granulować kulki. Opłucz kulki 10 mililitrami lodowatego PBS osiem razy. Następnie dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego, inkubuj kulki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut i eluuj kulki przez odwirowanie.Powtórz elucję sześć razy i połącz ze sobą sześć frakcji. Przenieść eluowane białka do filtra odśrodkowego i zagęścić przez odwirowanie w ilości 7 500 g do końcowej objętości od 100 do 200 mikrolitrów. Aby wyekstrahować MOV10, należy sprymować białko w HEK293T komórkach i zagnieździć komórki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach buforu do lizy komórek z kompletnym koktajlem inhibitorów proteazy wolnych od EDTA i inkubować przez 30 minut na lodzie. Następnie odwirować lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj koraliki magnetyczne anty-FLAG, przemywając je dwukrotnie buforem K150.Po umyciu ponownie zawieś kulki w jednym mililitrze lodowatego buforu K150 i inkubuj je przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnymi obrotami. Zbierz koraliki na magnesie i usuń supernatant. Dodaj kulki do lizatu komórkowego i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny.Przemyć kulki buforem K150 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i ponownie zawiesić kulki w 300 mikrolitrach buforu elucyjnego FLAG. Umieść koraliki na magnesie, zbierz supernatant z białkami MOV10 i określ stężenie białka. Przygotuj oligonukleotydy RNA, rozcieńczając każdy oligonukleotyd do 20 mikromolów i wyżarzając je w celu utworzenia dupleksów RNA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.W teście przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej MEIOB (EMSA) należy wymieszać odczynniki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Dodaj wodę, aby uzyskać końcową objętość reakcji 20 mikrolitrów. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie dodać 5x bufor zatrzymujący.W przypadku testu aktywności helikazy MOV10 wymieszaj odczynniki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodaj wodę, aby uzyskać końcową objętość reakcji 20 mikrolitrów. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, 30 minut i 60 minut, a następnie dodaj 5x bufor zatrzymujący, aby zatrzymać reakcję. Następnie przygotuj 20% natywny żel poliakryloamidowy i załaduj od 20 do 25 mikrolitrów każdej próbki do każdej studzienki.Uruchom żel pod napięciem 100 woltów w łaźni lodowej, aż niebieski marker bromofenolowy przeniesie się do dolnej ćwiartki żelu. Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny. Ważne jest, aby obchodzić się z nim przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.Zdemontuj płytki żelowe i przytnij żel, usuwając studnie załadunkowe i nieużywane pasy. Umieść żel w 0,5 buforze TBE. Przytnij bibułę filtracyjną i membranę nylonową do rozmiaru żelu, wstępnie zwilż papier i membranę, a następnie zmontuj stos do przeniesienia.Przenieść próbki z żelu na membranę w półsuchym aparacie elektroforetycznym o natężeniu 90 miliamperów przez 20 minut. Następnie należy usieciować próbki, napromieniając membranę z prędkością 120 milidżuli na centymetr kwadratowy przez 45 do 60 sekund. W celu detekcji chemiluminescencyjnej zacznij od dodania 20 mililitrów buforu blokującego do membrany i inkubacji przez 15 do 30 minut, delikatnie wstrząsając.Ostrożnie wyjmij bufor blokujący i zastąp go buforem sprzężonym/blokującym. Ponownie inkubować membranę przez 15 minut. Umyj membranę cztery razy, wstrząsając przez pięć minut na pranie.Następnie dodaj 30 mililitrów buforu równowagi substratu do membrany i inkubuj ją przez pięć minut, wstrząsając z prędkością od 20 do 25 obr./min. Przykryj całą powierzchnię membrany roztworem roboczym substratu i inkubuj przez pięć minut. Po inkubacji skanuj membranę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego przez jedną do trzech sekund.Oczyszczanie białek A, C i E MEIOB można zweryfikować za pomocą barwienia Coomassie na niebiesko i analizy western blot. Czerwone strzałki wskazują pozycje oczyszczonych białek MEIOB. Interakcje MEIOB i jednoniciowego DNA można wizualizować za pomocą EMSA.Obserwuje się wiązanie i rozszczepienie w zależności od stężenia. Zgodnie z oczekiwaniami, tylko MEIOB-A typu dzikiego oddziałuje z DNA, podczas gdy zmutowane MEIOB-E i MEIOB-C nie. Można również zaobserwować interakcje MEIOB i jednoniciowego RNA.MEIOB typu dzikiego wykazuje zależną od stężenia aktywność wiązania i egzonukleazy na jednoniciowym RNA. Jednak porównanie ilościowe pokazuje, że MEIOB wiąże DNA z większą wydajnością niż RNA. Oczyszczanie MOV10 zweryfikowano za pomocą barwienia Coomassie na niebiesko, a aktywność helikazy białka mierzono na dupleksie RNA z pięcioma nawisami pierwszymi.Wraz ze wzrostem czasu reakcji MOV10 stopniowo rozwija dwuniciowy RNA. Aby obniżyć koszt testu, detekcję chemiluminescencyjną można przeprowadzić za pomocą dwukrotnego rozcieńczenia odczynników z zestawu do wykrywania lub odczynników własnej produkcji. W opisanym tutaj protokole z powodzeniem wykorzystano znakowane biotyną kwasy nukleinowe jako substraty do testów biochemicznych in vitro, takich jak EMSA, oraz do reakcji enzymatycznych, w których biotyna nie była powszechnie stosowana.

in-vitro-biochemical-assays-using-biotin-labels-to-study-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje biotynylowane peptydy penetrujące komórki do wykrywania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. Peptydy penetrujące komórki ułatwiają sprzężonemu peptydowi wnikanie do komórki i specyficzne wiązanie się z oddziałującymi z nią białkami. Biotyna, po związaniu się z awidyną, umożliwia oczyszczenie kompleksu białek oddziałujących z lizatu komórkowego.

Biotynylowana sonda peptydowa penetrująca komórki do wykrywania interakcji białko-białko

W tym filmie demonstrujemy procedurę określania aktywności helikazy docelowego białka w celu rozwinięcia znakowanego biotyną substratu dsRNA. Aktywność enzymu zidentyfikowano poprzez analizę przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, a następnie test chemiluminescencyjny przy użyciu chemiluminescencyjnej streptawidyny sprzężonej z enzymem.

Pomiar aktywności helikazy białka docelowego za pomocą dupleksów RNA znakowanych biotyną

Opracowaliśmy ilościowy test wiążący DNA, oparty na ELISA, do pomiaru interakcji czynników transkrypcyjnych z DNA.  Wysoką swoistość białka RUNX2 osiągnięto dzięki oligonukleotydowi rozpoznającemu DNA i swoistemu przeciwciału monoklonalnemu. Detekcja kolorymetryczna z reakcją substratową przeciwciał sprzężoną z enzymem była monitorowana w czasie rzeczywistym.

Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

To jest protokół do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko oparty na systemie pull-down biotyna-awidyna z nowością łączenia sekwencji penetrujących komórki. Główną zaletą jest to, że sekwencja docelowa jest inkubowana z żywymi komórkami, a nie z lizatami komórkowymi, a zatem interakcje będą zachodzić w kontekście komórkowym.

Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj niezawodne testy biochemiczne in vitro z etykietami biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy. Ta metoda zapewnia długotrwałą powtarzalność wyników bez specjalistycznego sprzętu.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Przeglądaj więcej filmów