Name: Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę analizy heterogeniczności wewnątrznowotworowej poprzez sekwencjonowanie wielolezyjne i immunohistochemię. Protokół umożliwia identyfikację mutacji klonalnych i subklonalnych w guzach litych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez Italian Cancer Genome Project (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Grant nr 12182 dla AS i 18178 dla VC), Grant Wspólnoty Europejskiej 7PR (Cam-PAC nr 602783 dla AS). Agencje finansujące nie odgrywały żadnej roli w gromadzeniu, analizie i interpretacji danych ani w pisaniu manuskryptu.

<ol><li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li>
<li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution%3A+Past%2C+Present%2C+and+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li>
<li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li>
<li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li>
<li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+oncogenesis%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li>
<li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li>
<li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979(2014).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li>
<li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692(2013).</li>
<li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li>
<li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasza metoda umożliwia identyfikację zmian molekularnych zaangażowanych w progresję guzów litych poprzez integrację danych pionowych (tj. morfologii, sekwencjonowania DNA i immunohistochemii) z różnych zmian chorobowych danego pacjenta. Wykazaliśmy zdolność naszej metody do wykrywania zdarzeń klonalnych i subklonalnych w mutacyjnym cichym typie guza (tj. SPN, licie pseudobrodawkowatym nowotworu trzustki) poprzez badanie sekwencji kodujących 409 genów istotnych dla raka8. Zaletą zastosowanego tutaj...

Pojawienie się sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zrewolucjonizowało sposób diagnozowania i leczenia nowotworów1. NGS w połączeniu z sekwencjonowaniem wieloregionalnym ujawniły wysoki stopień heterogeniczności wewnątrznowotworowej (ITH) w guzach litych2, co częściowo wyjaśnia niepowodzenie terapii celowanej z powodu obecności subklonów o różnej wrażliwości na lek2. Ważnym wyzwaniem związanym z badaniami sekwencjonowania całego genomu jest konieczność rozróżnienia między mutacjami pasażerskimi (tj. neutralnymi) i napędzającymi w poszczególnych nowotworach3. Kilka badań rzeczywiście wykazało, że w niektórych nowotworach mutacje pasażerów stanowią większość ITH, podczas gdy zmiany w czynniku napędzającym mają tendencję do zachowania się wśród zmian tego samego osobnika4. Ważne jest również, aby zauważyć, że duże obciążenie mutacjami (obserwowane w przypadku raka płuc i czerniaka) niekoniecznie oznacza duże obciążenie mutacjami subklonalnymi2. Dlatego wysoki stopień ITH można znaleźć w nowotworach o niskim obciążeniu mutacyjnym.
Przerzuty są odpowiedzialne za ponad 90% zgonów związanych z rakiem na całym świecie5; W związku z tym uchwycenie heterogeniczności mutacji genów kierujących zmianami pierwotnymi i przerzutowymi ma kluczowe znaczenie dla projektowania skutecznych terapii chorób w zaawansowanym stadium. Sekwencjonowanie kliniczne jest zwykle wykonywane na kwasach nukleinowych z utrwalonych tkanek, co utrudnia eksplorację całego genomu ze względu na niską jakość DNA. Z drugiej strony, celem sekwencjonowania klinicznego jest zidentyfikowanie mutacji, które można zdziałać, i/lub mutacji, które mogą przewidywać reakcję/brak odpowiedzi na dany schemat terapeutyczny. W chwili obecnej sekwencjonowanie może być ograniczone do mniejszej części genomu w celu szybkiego wydobycia istotnych klinicznie informacji. Przejście od niskoprzepustowego profilowania DNA (np. sekwencjonowania Sangera) do NGS umożliwiło analizę setek genów istotnych dla raka na dużej głębokości pokrycia, co pozwala na wykrywanie zdarzeń subklonalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę porównawczej analizy zmian chorobowych, która pozwala na identyfikację populacji klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od tego samego osobnika. Opisana tutaj metoda łączy w sobie trzy dobrze ugruntowane podejścia (analiza histologiczna, sekwencjonowanie wielozmianowe o dużym zasięgu i analizy immunofenotypowe) w celu przewidywania funkcjonalnych konsekwencji zidentyfikowanych zmian. Podejście to jest schematycznie opisane na rycinie 1 i zostało zastosowane do badania 5 przerzutowych przypadków litych nowotworów pseudobrodawkowatych (SPN) trzustki. Chociaż opisujemy przetwarzanie i analizę próbek tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, tę samą procedurę można zastosować do materiału genetycznego ze świeżo zamrożonej tkanki.

<table><tbody><tr><td>2100 Przyrząd do bioanalizowania</td><td>Technologie Agilent</td><td>G2939BA</td><td>&nbsp; Zautomatyzowane narzędzie do elektroforezy</td></tr><tr><td>Zestaw Agencourt AMPure XP</td><td>Fisher Naukowy</td><td>NC9959336</td><td>Technologia perełek do oczyszczania produktów PCR; Odczynnik oczyszczający na bazie kulek</td></tr><tr><td>Zestaw Agilent DNA o wysokiej czułości</td><td>Technologie Agilent</td><td>5067-4627</td><td>Kwantyfikacja biblioteki</td></tr><tr><td>Anty-BAP1</td><td>Biotechnologia Santa Cruz</td><td>SC-28383 powiedział:</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Anty-GLUT1</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9052</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Anty-KDM6A</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>#33510</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Anty-p53</td><td>Nowokastra</td><td>NCL-L-p53-DO7</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Anty-&beta; Katenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał C7207</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Rozwiązanie blokujące</td><td>domowej roboty</td><td>-</td><td>5 % albumina surowicy bydlęcej (BSA) w TBST</td></tr><tr><td>Roztwór do inaktywacji endogennych peroksydaz</td><td>domowej roboty</td><td>-</td><td>3% H2O2 w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) 1x</td></tr><tr><td>Leica CV ultra</td><td>Księga Leica</td><td>70937891</td><td>Entellan mountin media</td></tr><tr><td>Odzyskiwanie epitopów Rozwiązanie 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>Zobacz materiał AR9961</td><td>Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 6,0 na bazie cytrynianu</td></tr><tr><td>Odzyskiwanie epitopów Rozwiązanie 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>Zobacz materiał AR9640</td><td>Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 9,0 na bazie EDTA</td></tr><tr><td>Eppendorf 0,2 ml probówki do PCR, przezroczyste</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>951010006</td><td>Rury</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf DNA LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>22431021</td><td>Rury</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>DIAPATA</td><td>Certyfikat A0123</td><td>Odczynnik do deparafinowania IHC</td></tr><tr><td>Pióro ImmEdge&nbsp; Hydrofobowe&nbsp; Bariera&nbsp; Pióro</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>H&shy; 4000</td><td>Długopis hydrofobowy</td></tr><tr><td>ImmPACT DAB&nbsp; Peroksydazy</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>SK&nieśmiały; 4105</td><td>Podłoże HRP</td></tr><tr><td>ImmPRESS Anty&nieśmiały; Królik&nbsp; Ig&nbsp; Odczynnik&nbsp; Peroksydazy</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>MP & nieśmiały; 7401&nieśmiały; 50</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>ImmPRESS Anty&nieśmiały; Mysz&nbsp; Ig&nbsp; Odczynnik&nbsp; Peroksydazy</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>MP & nieśmiały; 7402&nieśmiały; 50</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Przeglądarka genomiki integracyjnej (IGV)</td><td>Szeroki Instytut</td><td>-</td><td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Kompleksowy panel onkologiczny</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4477685</td><td>Multipleksowany wybór celu genu związanego z rakiem 409. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td></tr><tr><td>Zestaw biblioteki Ion AmpliSeq 2.0</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4480441</td><td>Przygotowanie bibliotek amplikonowych z wykorzystaniem paneli Ion AmpliSeq</td></tr><tr><td>Instrument Jonowego Szefa Kuchni</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4484177</td><td>Zautomatyzowane przygotowanie biblioteki, przygotowanie szablonów i ładowanie chipów</td></tr><tr><td>Zestaw chipów Ion PI v3 lub chip Ion 540</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>A26771 lub A27766</td><td>Chipy z kodami kreskowymi do sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q Chef Kit lub Ion 540 Kit-Chef</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>A27198 lub A30011</td><td>Przygotowanie szablonu</td></tr><tr><td>Zestaw do sekwencjonowania jonów PI Hi-Q 200 lub zestaw do sekwencjonowania jonów S5</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>A26433 lub A30011</td><td>Sekwencjonowanie</td></tr><tr><td>System jonów protonowych lub jonowych GeneStudio S5</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4476610 lub A38196</td><td>System sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Ion Reporter - AmpliSeq Kompleksowy panel onkologiczny Guz - normalna para</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4487118</td><td>Przepływ pracy</td></tr><tr><td>Ion Reporter Software - wtyczka do przesyłania</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4487118</td><td>Narzędzie do analizy danych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Ion Torrent Suite - wtyczka Coverege Analysis</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4483643</td><td>Wtyczka opisująca poziom wyprodukowanego pokrycia sekwencyjnego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Ion Torrent Suite - wtyczka Variant Caller</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4483643</td><td>Wtyczka zdolna do identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), insercji i delecji w próbce w całym odniesieniu</td></tr><tr><td>Adaptery kodów kreskowych Ion Xpress 1-96 Zestaw</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>4474517</td><td>Unikalne adaptery do kodów kreskowych</td></tr><tr><td>Spektrofotometry NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał ND-2000</td><td>Wykrywanie czystości DNA</td></tr><tr><td>Baza danych sekwencji referencyjnej NCBI (RefSeq)</td><td>NCBI (Krajowa Sieć Informacji</td><td>-</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td></tr><tr><td>Platynowy PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Fisher Naukowy</td><td>12532-016 lub 12532-024</td><td>SuperMix do amplifikacji PCR; mieszanka PCR o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>Mini zestaw QIAamp DNA Blood</td><td>Quiagen</td><td>51106 0r 51104</td><td>Zestaw do ekstrakcji krwi DNA</td></tr><tr><td>Tkanka QIAamp DNA FFPE</td><td>Quiagen</td><td>56404</td><td>Zestaw do ekstrakcji tkanek DNA FFPE</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 2.0</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>Numer katalogowy Q32866 powiedział:</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA BR</td><td>Thermofisher Naukowy</td><td>Numer katalogowy Q32850 powiedział:</td><td>Zestaw do oznaczania ilościowego DNA na fluorometrze Qubit 2.0</td></tr><tr><td>TBST (Do ustalenia)</td><td>domowej roboty</td><td>-</td><td>sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) i 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus & Folia Tissue-Tek</td><td>Sakura Europa</td><td>6172</td><td>Zautomatyzowany przyrząd do barwienia szkiełek tkankowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Variant Effect Predictor (VEP)</td><td>EMBI-EBI (Przedsiębiorstwo Kapitałowe i Inwestycyjne)</td><td>-</td><td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Narzędzia/VEP</td></tr><tr><td>Xilene, mieszanina izomerów</td><td>Carlo Erba</td><td>492306</td><td>Odczynnik do deparafinowania IHC</td></tr></tbody></table>

analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Ocena heterogeniczności wewnątrznowotworowej (ITH) ma ogromne znaczenie dla przewidywania niepowodzenia terapii celowanych i projektowania odpowiednio skutecznych strategii przeciwnowotworowych. Chociaż często pojawiają się obawy ze względu na różnice w przetwarzaniu próbek i głębokości pokrycia, sekwencjonowanie nowej generacji guzów litych ujawniło bardzo zróżnicowany stopień ITH w różnych typach nowotworów. Uchwycenie pokrewieństwa genetycznego między zmianami pierwotnymi i przerzutowymi poprzez identyfikację populacji klonalnych i subklonalnych ma kluczowe znaczenie dla projektowania terapii chorób w zaawansowanym stadium. W tym miejscu przedstawiamy metodę porównawczej analizy zmian chorobowych, która pozwala na identyfikację populacji klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek pochodzących od tego samego pacjenta. Opisane tutaj podejście eksperymentalne integruje trzy dobrze ugruntowane podejścia: analizę histologiczną, sekwencjonowanie wielu zmian o wysokim zasięgu i analizy immunofenotypowe. W celu zminimalizowania wpływu na wykrywanie zdarzeń subklonalnych przez niewłaściwe przetwarzanie próbki, poddaliśmy tkanki starannemu badaniu patologicznemu i wzbogaceniu komórek nowotworowych. Kontrolowane jakościowo DNA ze zmian nowotworowych i zdrowych tkanek poddano następnie sekwencjonowaniu o wysokim pokryciu, ukierunkowanym na regiony kodujące 409 istotnych genów nowotworowych. Patrząc tylko na ograniczoną przestrzeń genomiczną, nasze podejście umożliwia ocenę stopnia heterogeniczności wśród zmian somatycznych (mutacje pojedynczego nukleotydu i zmiany liczby kopii) w różnych zmianach u danego pacjenta. Dzięki analizie porównawczej danych sekwencjonowania byliśmy w stanie odróżnić zmiany klonalne i subklonalne. Większość ITH jest często przypisywana mutacjom u pasażerów; W związku z tym wykorzystaliśmy również immunohistochemię do przewidywania funkcjonalnych konsekwencji mutacji. Chociaż protokół ten został zastosowany do określonego typu nowotworu, przewidujemy, że opisana tutaj metodologia ma szerokie zastosowanie do innych typów guzów litych.

Przebieg badania przedstawiono na rysunku 1. Sekwencjonowanie wielu zmian chorobowych (n = 13) 5 przypadków SPN ukierunkowanych na sekwencje kodujące 409 genów związanych z rakiem zidentyfikowało łącznie 27 mutacji somatycznych w 8 genach (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1 i FGFR3). Mutacje zdefiniowano jako założycielskie/klonalne, gdy są wspólne dla wszystkich zmian u danego pacjenta, oraz progresyjne/subklo...

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Nasz protokół pozwala na uchwycenie genetycznego pokrewieństwa między zmianami pierwotnymi a przerzutowymi poprzez identyfikację zmian molekularnych zaangażowanych w postęp choroby. Nasza metoda daje możliwość zbadania pokrewieństwa genetycznego w próbce klinicznej z wysoką czułością i swoistością. Wynika to z integracji analizy molekularnej i histopatologicznej.Ocena niejednorodności wewnątrznowotworowej w dziedzinie badań nad rakiem ma ogromne znaczenie w projektowaniu skutecznych strategii przeciwnowotworowych, a nasza metoda ma szerokie zastosowanie w wielu typach guzów litych. Po przygotowaniu i ilościowym określeniu interesujących bibliotek, rozcieńczyć każdą bibliotekę do stężenia 100 pikomolarów w wodzie wolnej od nukleaz i połączyć 10 mikrolitrów każdej rozcieńczonej biblioteki na pojedynczy przebieg w jednej probówce. Następnie wymieszaj biblioteki w puli przez pipetowanie.Aby zainicjować sekwencjonowanie, najpierw otwórz przeglądarkę Torrent na komputerze podłączonym do systemu sekwencjonowania. Zaplanuj nowy przebieg, korzystając z ogólnego szablonu dla wybranej aplikacji, a następnie w zakładce zestawy wybierz system Ion Proton lub system Ion Gene Studio S5. Wybierz od

comparative-lesions-analysis-through-a-targeted-sequencing-approach

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Strategia genetyki molekularnej w celu znalezienia mutacji de novo powodujących powszechne zaburzenia, takie jak autyzm i schizofrenia.

Strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Tutaj opisujemy połączone sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i protokół budowy biblioteki nowej generacji o niskim wkładzie przeznaczony do generowania wysokiej jakości danych o całym eksomie z komórek Hodgkina Reeda-Sternberga (HRS) klasycznego chłoniaka Hodgkina (CHL).

Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Ten artykuł przedstawia protokół dla kontekstowego i podpowiedzianego testu warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo do oceny uczenia się strachu i pamięci u myszy.

Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo u myszy

Poznaj metodę analizy heterogeniczności wewnątrznowotworowej poprzez sekwencjonowanie wielolezyjne i immunohistochemię. Protokół umożliwia identyfikację mutacji klonalnych i subklonalnych w guzach litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Przeglądaj więcej filmów