Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania
5 listopada 2019
W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.
Nasz protokół pozwala na uchwycenie genetycznego pokrewieństwa między zmianami pierwotnymi a przerzutowymi poprzez identyfikację zmian molekularnych zaangażowanych w postęp choroby. Nasza metoda daje możliwość zbadania pokrewieństwa genetycznego w próbce klinicznej z wysoką czułością i swoistością. Wynika to z integracji analizy molekularnej i histopatologicznej.
Ocena niejednorodności wewnątrznowotworowej w dziedzinie badań nad rakiem ma ogromne znaczenie w projektowaniu skutecznych strategii przeciwnowotworowych, a nasza metoda ma szerokie zastosowanie w wielu typach guzów litych. Po przygotowaniu i ilościowym określeniu interesujących bibliotek, rozcieńczyć każdą bibliotekę do stężenia 100 pikomolarów w wodzie wolnej od nukleaz i połączyć 10 mikrolitrów każdej rozcieńczonej biblioteki na pojedynczy przebieg w jednej probówce. Następnie wymieszaj biblioteki w puli przez pipetowanie.
Aby zainicjować sekwencjonowanie, najpierw otwórz przeglądarkę Torrent na komputerze podłączonym do systemu sekwencjonowania. Zaplanuj nowy przebieg, korzystając z ogólnego szablonu dla wybranej aplikacji, a następnie w zakładce zestawy wybierz system Ion Proton lub system Ion Gene Studio S5. Wybierz odpowiedni układ z menu rozwijanego typu układu i wybierz Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit z listy rozwijanej zestawu bibliotek.
Wybierz przycisk Ion Chef dla zestawu szablonów i wybierz odpowiedni zestaw szefa kuchni z listy rozwijanej zestawu szablonów. Wybierz odpowiedni zestaw do sekwencjonowania z menu rozwijanego zestawu do sekwencjonowania i wybierz Ion Express z listy rozwijanej zestawu kodów kreskowych. Na karcie wtyczki wybierz wtyczkę do analizy pokrycia.
Na karcie planu wybierz GRCH37HG19 genom z listy rozwijanej biblioteki referencyjnej. Z listy rozwijanej regionów docelowych wybierz odpowiedni panel, który ma zostać sekwencjonowany. Następnie ustaw liczbę kodów kreskowych do sekwencjonowania i ustaw nazwę kodu kreskowego oraz nazwę próbki dla każdej biblioteki.
W przypadku rozcieńczenia bibliotek zbiorczych, rozcieńczyć bibliotekę podstawową wodą wolną od nukleaz do stężenia 25 pikomolarów dla chipa jonowo-protonowego i odpipetować 50 mikrolitrów każdej rozcieńczonej biblioteki na dno odpowiedniej probówki z próbką biblioteki. Załadować probówki z próbkami zawierające połączone rozcieńczone biblioteki do systemu przygotowania biblioteki i rozpocząć amplifikację klonalną. W przypadku sekwencjonowania nowej generacji postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby zainicjować instrument.
Po zakończeniu amplifikacji klonalnej otwórz drzwiczki instrumentu Ion Chef, a następnie otwórz pokrywę wirówki do ładowania chipów i wyjmij dwa chipy z systemu przygotowania biblioteki. Umieść wióry w oddzielnych pojemnikach do przechowywania wiórów i załaduj jeden z chipsów do komory na wióry w urządzeniu. Następnie zamknij pokrywę komory na wióry i rozpocznij sekwencjonowanie.
W przypadku analizy mutacji otwórz wtyczkę analizy pokrycia i użyj danych wyjściowych analizy pokrycia, aby zweryfikować głębokość pokrycia i jednorodność. Użyj wtyczki Torrent Variant Caller, aby wykonać wywołanie wariantu, wybierając odpowiednio linię zarodkową lub somatyczny przepływ pracy. Następnie pobierz przefiltrowane pliki formatu wywołania wariantów i użyj oprogramowania do przewidywania efektu wariantu w bazie danych NCBI RefSeq, aby dodać adnotacje do wariantów.
Aby oszacować różnice w liczbie kopii, użyj wtyczki do przesyłania jonów, aby załadować dane sekwencjonowania do oprogramowania do reportera jonów i skorzystaj z kompleksowego przepływu pracy normalnej pary guza w panelu raka do analizy danych. Ręcznie filtruj mutacje i warianty liczby kopii na podstawie wyników przypisanych przez oprogramowanie i weryfikuj je wizualnie za pomocą przeglądarki Integrative Genomics Viewer. Następnie wizualnie sprawdź wyrównanie pod kątem nietypowych odczytów, które mogą generować sztuczne wywołania, i sprawdź znormalizowane pokrycie dla wszystkich amplikonów w danym genie w porównaniu ze znormalizowanym pokryciem linii podstawowej, aby zweryfikować różnice w liczbie kopii.
Dla każdego przypadku należy zindeksować wywołania mutacji z sekwencjonowania normalnej tkanki lub krwi lub guza pierwotnego lub przerzutów. Oznacz jako linię zarodkową i odrzuć wywołania, które są również widoczne w danych sekwencjonowania DNA linii zarodkowej. Oznacz jako klonalne lub założycielskie mutacje, które są wspólne dla wszystkich zmian chorobowych danego pacjenta.
Następnie oznacz jako subklonalne lub progresoryjne mutacje, które zostały wykryte w niektórych, ale nie wszystkich zmianach u danego pacjenta. W tym reprezentatywnym eksperymencie sekwencjonowanie wielochorobowe pięciu przypadków litego raka pseudobrodawkowatego, ukierunkowane na sekwencje kodujące 409 genów związanych z rakiem, zidentyfikowało łącznie 27 mutacji somatycznych w ośmiu genach. Mutacje zdefiniowano jako założycielskie lub klonalne, gdy są wspólne dla wszystkich zmian u danego pacjenta i progresora lub subklonalne, gdy są wykrywane w niektórych, ale nie we wszystkich zmianach u danego pacjenta.
Konsekwentnie, barwienie immunohistochemiczne beta-kateniny i KMD6A było jednorodne wśród różnych zmian chorobowych w przypadkach z mutacjami odpowiednich genów. Umiarkowane barwienie KMD6A w zmutowanych próbkach sugeruje, że zmiana genetyczna prawdopodobnie zmieni funkcję, a nie ekspresję białka. Utrata funkcji KMD6A w guzach trzustki wiąże się z regulacją w górę markera niedotlenienia GLUT-1.
W związku z tym GLUT-1 uległ nadmiernej ekspresji w przypadkach z mutacjami KMD6A. Immunohistochemia BAP1 i TP53 potwierdziła, że mutacje w tych genach były subklonalne. W tym wirtualnym kariotypie reprezentatywnego przypadku pokazującego lokalizację, bliskość i status liczby kopii zmienionych genów, analiza zmienności liczby kopii przy użyciu danych sekwencjonowania ujawniła zmiany we wszystkich analizowanych próbkach.
W przeciwieństwie do mutacji punktowych, większość zmian zmienności liczby kopii była subklonalna. Walidacja i indeksacja mutacji i zmienności liczby kopii oraz porównanie normalnego DNA guza są ważne dla uniknięcia generowania fałszywych wywołań, które mogłyby unieważnić wyniki. Procedura ta może być również zastosowana do badań sekwencjonowania całego genomu, mających na celu zbadanie całego genomu w celu identyfikacji mutacji między zmianami różnych typów guzów litych.
W dziedzinie badań nad rakiem techniki te są kluczowymi narzędziami do zrozumienia biologii chorób o ważnych implikacjach klinicznych, mających na celu projektowanie spersonalizowanych i skutecznych terapii celowanych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę identyfikacji klonalnych i subklonalnych zmian w różnych próbkach pochodzących od danego pacjenta. Podejście to umożliwia wychwytywanie genetycznego pokrewieństwa między pierwotnymi a przerzutami, dostarczając informacji na temat postępu choroby.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Onkologia
- Genetyka
- Biologia molekularna
Tło
- Rozumienie heterogeniczności wewnątrz guza jest kluczowe dla skutecznego leczenia raka.
- Identyfikacja zmian molekularnych może wpłynąć na strategie przeciwnowotworowe.
- Metoda integruje analizę molekularną i histopatologiczną.
- Jest zastosowalna do różnych typów guzów stałych.
Cel badania
- Zbadanie genetycznego pokrewieństwa w próbkach klinicznych.
- Ocenienie zmian molekularnych zaangażowanych w progresję raka.
- Poprawa czułości i swoistości analizy genetycznej.
Stosowane metody
- Przygotowanie i ilościowe określenie bibliotek o interesującym charakterze.
- Rozcieńczanie bibliotek do stężenia 100 pikomolarnego.
- Łączenie rozcieńczonych bibliotek do analizy.
- Pipetowanie w celu wymieszania bibliotek połączonych.
Główne wyniki
- Metoda umożliwia wysoką czułość w wykrywaniu zmian genetycznych.
- Dostarcza informacji na temat klonalnej ewolucji guzów.
- Wyniki są zastosowalne do szerokiego zakresu guzów stałych.
- Ułatwia lepsze zrozumienie heterogeniczności guza.
Wnioski
- Podejście jest skuteczne w badaniu genetycznego pokrewieństwa w raku.
- Może wpłynąć na rozwój terapii ukierunkowanej.
- Szerokie zastosowanie zwiększa jego przydatność w badaniach nad rakiem.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Comparative lesions analysis using targeted sequencing directly addresses the challenge of intra-tumoral heterogeneity, a key barrier to effective targeted therapy development. By distinguishing clonal from subclonal alterations across primary and metastatic lesions, this approach enhances predictive confidence in target validation and informs risk-adjusted portfolio decisions. Integrating molecular, histopathological, and immunophenotypic data supports robust mechanistic de-risking at critical discovery and translational inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise mapping of clonal and subclonal mutations to clarify therapeutic hypotheses.
- Supports functional target validation by integrating genetic and immunophenotypic evidence.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing the evolutionary landscape of tumor lesions.
- Improves predictive confidence for advancing targets with consistent clonal alterations.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lesion-derived samples for downstream molecular and functional assays.
- Standardizes sequencing and variant calling workflows for reproducible quantitative outputs.
- Enables robust detection of somatic alterations for reliable compound evaluation in disease-relevant systems.
- Supports scalability and platform reuse across multiple tumor types and studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic findings with immunophenotypic biomarkers for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by distinguishing driver from passenger mutations in preclinical models.
- Provides a framework for integrating multi-lesion data into personalized therapy design strategies.
- Supports disease-relevant system selection based on clonal architecture and biomarker expression.
Pipeline & Workflow Integration
This targeted sequencing approach integrates from early discovery through translational research, supporting lead identification and preclinical validation when genetic heterogeneity is a key risk factor.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by mapping mutation clonality across lesions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative variant and copy-number outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides high-sensitivity detection and annotation of somatic alterations for cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects genetic and immunophenotypic data to biomarker alignment and preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, broadly applicable workflow for multi-lesion analysis across solid tumor portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible sequencing and analysis workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management by clarifying clonal architecture.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets based on robust genetic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular pathology, next-generation sequencing, and bioinformatics analysis.
- Demands access to high-coverage sequencing platforms and validated analytical software.
- Necessitates rigorous sample processing and neoplastic cell enrichment for artifact minimization.
- Benefits from cross-team standardization of variant calling and immunophenotypic assessment protocols.
- May be limited by the targeted gene panel scope and sample quality constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Library Pooling and Sequencing Run
2:28
Sample Library Dilution and Loading
3:00
Next Generation Sequencing
3:43
Mutation and Copy-Number Variation (CNV) Analysis
5:00
Somatic Mutation Indexing
5:36
Results: Representative Comparative Lesion Analyses
7:16
Conclusion
