Metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na MATLAB do analizy danych
1 września 2019
Skurcze macicy są ważne dla dobrego samopoczucia kobiet. Jednak patologicznie zwiększona kurczliwość może powodować bolesne miesiączkowanie, szczególnie u młodszych kobiet. W tym miejscu opisujemy prosty preparat ex vivo, pozwalający na szybką ocenę skuteczności leków zwiotczających mięśnie gładkie, które mogą być stosowane w leczeniu bolesnego miesiączkowania.
Nasz protokół jest istotny, ponieważ zapewnia pierwszą ilościową metodę ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości nienaruszonej macicy. To nowatorskie podejście stanowi łatwą i tańszą alternatywę dla testowania potencjału rozkurczającego naturalnie występujących środków leczniczych w związkach syntetycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie wewnątrzmaciczne interakcje komórkowe pozostają nienaruszone przez cały czas trwania eksperymentu.
Nadmierna kurczliwość macicy wiąże się z bolesnym miesiączkowaniem, w przypadku którego leki zwiotczające macicę mogą być przydatne w leczeniu. Ta metoda zapewnia łatwy sposób testowania nowych środków zwiotczających. Po potwierdzeniu etapu cyklu rujowego umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i rozłóż kończyny, aby odsłonić brzuszną część miednicy.
Zwilż brzuch 70% etanolem i użyj kleszczy, aby ostrożnie podnieść skórę nad łechtaczką. Wykonaj małe poprzeczne nacięcia na bocznych stronach dolnej części brzucha aż do kończyn górnych, aby odsłonić otrzewną. Ostrożnie przeciąć otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy bez uszkadzania rogów macicy, a następnie użyć kleszczy do usunięcia powięzi i tkanki tłuszczowej pokrywającej przewód pokarmowy.
Usuń dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte, jelito ślepe oraz okrężnicę wstępującą i poprzeczną. Zlokalizuj pęcherz moczowy, aby zlokalizować pochwę, która znajduje się bezpośrednio pod pęcherzem moczowym. Zlokalizuj spojenie łonowe u zbiegu kości łonowych, ogonowo do pęcherza moczowego i za pomocą nożyczek ostrożnie wykonaj nacięcie po bocznych stronach spojenia łonowego przez tkankę międzyłonową włóknisto-chrzęstną, aby uzyskać dostęp i zapewnić drogę do ekstrakcji pochwy.
Przeciąć krocze znajdujące się między odbytem a dolną częścią sromu i użyć kleszczy, aby podnieść pochwę, aby umożliwić powolne wycięcie odbytnicy. Zidentyfikuj dwa rogi macicy, które rozgałęziają się w widelec rostralnie do pochwy i zlokalizuj pokrętny jajowód i jajnik na końcu każdego rogu. Prawidłowa identyfikacja rogów macicy ma kluczowe znaczenie dla zabiegu, aby upewnić się, że tkanki nie są uszkodzone.
Użyj małych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć wszelkie więzadła, które łączą się i podtrzymują rogi, jajowody i jajniki w jamie brzusznej, a także usuń pochwę, macicę, jajowody i jajniki. Przenieś cały izolowany układ rozrodczy na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów PBS firmy Dulbecco. Użyj kleszczy i nożyczek chirurgicznych, aby usunąć tkankę łączną i tłuszczową otaczającą rogi macicy i pochwę, a także sierść w okolicy łonowej, która mogłaby pogorszyć jakość obrazu.
Usuń więzadło szerokie, aby umożliwić ruchliwość rogów macicy i przemyj tkankę dwa razy świeżym PBS Dulbecco na przemycie przed przeniesieniem izolowanego układu rozrodczego na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry natlenionego roztworu Krebsa. W celu zobrazowania spontanicznej ruchliwości umieść szalkę Petriego na czarnej powierzchni w temperaturze pokojowej i odczekaj od 15 do 30 minut, aby rozpoczęły się spontaniczne skurcze. Gdy można zaobserwować ruch, rejestruj spontaniczną ruchliwość macicy przez 10 minut z płaszczyzny osiowej za pomocą dowolnego rodzaju cyfrowego sprzętu wideo.
Następnie przenieść preparat na szalkę Petriego zawierającą natleniony bufor Krebsa uzupełniony badanym związkiem i rejestrować spontaniczną ruchliwość macicy przez dodatkowe 10 minut w ten sam sposób. Pod koniec okresu rejestracji przemyć cały układ rozrodczy w 10 mililitrach PBS Dulbecco na 100-milimetrowej szalce Petriego i przenieść próbkę na nową szalkę Petriego ze świeżo natlenionym buforem Krebsa w celu oceny odwracalności zabiegu. Rejestruj spontaniczną ruchliwość macicy przez około 10 minut w taki sam sposób, jak w przypadku dwóch ostatnich nagrań.
Następnie przenieść preparat na inną 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną natlenionym buforem Krebsa uzupełnionym nośnikiem badanego związku, aby upewnić się, że nie ma mechanicznie wywołanych zmian w spontanicznej ruchliwości macicy. Preparat do budowy układu rozrodczego wykazywał dużą ruchliwość w panelach A i C przy braku epinefryny. Ale ten fenotyp jest uśpiony w panelu B z obecnością jednej epinefryny mikro muller.
W tym miejscu przedstawiono przykładową analizę danych dotyczących podawania epinefryny i spontanicznej odzyskiwania ruchliwości, ilustrując, w jaki sposób wpływ hormonu na spontaniczną ruchliwość układu rozrodczego można określić ilościowo na podstawie zapisów tkanki pobranej przed, w trakcie i po leczeniu badanym związkiem. Ważne jest, aby unikać ściskania lub nadmiernego rozciągania rogów macicy, w przeciwnym razie nie zaobserwuje się spontanicznej kurczliwości. Nasza metoda może być również stosowana do badania związków, które mogą zwiększać kurczliwość macicy.
Procedura ta może być stosowana do ciężarnej macicy myszy we wcześniejszych stadiach ciąży. Eksperyment ten ma potencjał, aby zostać zmodernizowany do formatu płytki sześciodołkowej do przepływowych badań przesiewowych leków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy znaczenia skurczów macicy, szczególnie w kontekście dysmenorei u młodych kobiet. Przedstawia nową metodę ex vivo oceny ruchliwości macicy i skuteczności środków rozluźniających mięśni gładkie, co może stanowić opcję terapeutyczną dla dysmenorei.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Kurczliwość macicy
- Leczenie dysmenorei
- Techniki oceny ex vivo
Tło
- Zwiększona kurczliwość macicy jest związana z dysmenorreą.
- Istniejące metody oceny ruchliwości macicy są ograniczone pod względem ich skuteczności.
- Niniejsze badanie ma na celu poprawę technik oceny dla bardziej sprawdzonych testów rozluźniających.
Zastosowane metody
- Ilościowa ocena ex vivo ruchliwości macicy.
- System modelu mysiego z zachowanymi interakcjami macicy.
- Wykorzystanie sprzętu wideo do rejestracji ruchliwości.
Główne wyniki
- Ustanowiona została powtarzalna metoda oceny ruchliwości macicy.
- Zrealizowano ilościową ocenę spontanicznej ruchliwości w odpowiedzi na środki rozluźniające.
- Możliwość testowania zarówno środków rozluźniających, jak i zwiększających kurczliwość.
Wnioski
- Niniejsze badanie wprowadza praktyczną metodę oceny ruchliwości macicy i skuteczności środków rozluźniających.
- Wyniki mają wpływ na przyszłe badania nad leczeniem dysmenorei.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This ex vivo method enables quantitative assessment of spontaneous uterine motility in an intact mouse reproductive tract, providing a physiologically relevant model for evaluating uterine relaxants and contractility modulators. By preserving intrinsic intra-uterine cellular interactions, the approach supports mechanistic de-risking of compounds targeting dysmenorrhea and related uterine motility disorders. The method offers a scalable, reproducible platform for early-stage target validation and lead identification in women's health drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses on uterine smooth muscle function through quantification of spontaneous motility changes.
- Operational Value: Provides a reproducible ex vivo system to de-risk targets by preserving native tissue architecture and cellular crosstalk.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering quantitative, dose-responsive data on compound effects on uterine contractility.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized motility readouts via MATLAB-based motion tracking, enabling consistent compound screening.
- Scalability: Compatible with digital video capture and adaptable to higher-throughput formats such as six-well plates.
- Assay Robustness: Measures reversible inhibition of motility, as demonstrated with epinephrine, supporting assay validation and compound confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human endometrial wave-like activity, offering translational insight into dysmenorrhea pathophysiology.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery to preclinical evaluation by maintaining intact reproductive tract interactions throughout experimentation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying contractility modulation and reversibility of compound effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for uterine motility-modulating compounds.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic interrogation of uterine contractility pathways and target engagement in an intact tissue context.
- Screening: Delivers quantitative, motion-based readouts that enable reliable comparison of compound effects on spontaneous motility.
- Analytics: Employs motion tracking algorithms to generate measurable, reproducible outputs for dose-response and kinetic analysis.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by preserving physiological uterine tissue interactions relevant to human dysmenorrhea.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable motility assay platform applicable across compound classes and therapeutic areas involving smooth muscle function.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in uterine smooth muscle responses.
- Operational Value: Delivers a low-cost, standardized ex vivo assay with minimal equipment requirements (digital camera, MATLAB algorithm).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of uterine relaxant candidates before resource-intensive in vivo studies.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds based on quantified motility inhibition and reversibility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse reproductive tract dissection and tissue handling to maintain viability.
- Dependent on oxygenated Krebs buffer maintenance and temperature-controlled imaging environment for consistent motility.
- Necessitates standardization of video recording parameters (angle, duration, lighting) for reliable motion tracking analysis.
- Requires adaptation of MATLAB-based algorithm for varying uterine horn motility patterns across strains or conditions.
- Limited by spontaneous motility absence in 10-20% of samples, necessitating pre-screening for responsive tissues.
