Name: Metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na MATLAB do analizy danych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj metodę ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości macicy myszy z zachowaniem wszystkich interakcji komórkowych. Technika umożliwia testowanie leków rozkurczowych w badaniach nad leczeniem dysmenorrei.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez wewnętrzne fundusze IU. Pomysłodawcą badania jest firma AGO. XC i AGO były zaangażowane w projektowanie opisywanych eksperymentów. FL i AGO przeanalizowały i zinterpretowały dane. KLL, JOB, FL przeprowadził wszystkie eksperymenty ex vivo. FL napisał skrypt MATLAB. Rękopis napisali KLL, JOB i AGO. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). W badaniu wykorzystano 2-5 miesięczne samice myszy F2-129S-C57BL/6 dojrzałe płciowo.
UWAGA: Zapewnij bezpieczeństwo, nosząc fartuch laboratoryjny, maskę i rękawice podczas pracy ze zwierzętami i materiałami biologicznymi.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj bufor Krebsa, który zawiera: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 0,56 mM MgCl2, 25 mMNaHCO3 i 5 mM glukozy, pH 7,4. Ciągły natleniać bufor Krebsa mieszaniną sprężonych gazów zawierających 5% CO2 i 95 %O2 przy jednoczesnym utrzymywaniu temperatury buforu na poziomie 37 °C przy użyciu obiegowej łaźni wodnej.</li>
	<li>Przygotuj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, która zawiera: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,89 mM NaCl i 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulić myszy za pomocą inhalacji izofluranu (3%) z oczyszczaniem gazów odlotowych. Zapewnij odpowiednie znieczulenie, oceniając odruchy odstawienia. Ściśnij tylny palec u nogi, aby upewnić się, że nie są wywoływane żadne ruchy, co wskazuje na utratę reakcji odruchowych. Po osiągnięciu głębokiego znieczulenia należy poddać zwierzę eutanazji przez dekapitację. 
	nuta: Izofluran może powodować rozszerzenie mięśni gładkich. W związku z tym preparat układu rozrodczego powinien być dokładnie umyty i inkubowany w buforze Krebsa przez co najmniej 15-30 minut przed rozpoczęciem eksperymentów ex vivo. Izofluran może powodować podrażnienie i dyskomfort w kontakcie ze skórą, dlatego należy postępować ostrożnie.</li>
	<li>Ułóż ciało na dużej łodzi wyłożonej ręcznikiem papierowym. 
	nuta: Ciężarne kobiety personelu laboratoryjnego nie powinny brać udziału w eksperymentach z izofluranem, ponieważ może on zmniejszać masę płodu, zmniejszać kostnienie szkieletu płodu i zwiększać ryzyko samoistnego poronienia8,9. Wdychanie CO2 może być stosowane jako substytut eutanazji myszy. </li>
</ol>
3. Określenie etapu cyklu rujowego
<ol>
	<li>Za pomocą małych kleszczyków unieś łechtaczkę, aby uzyskać dostęp do ujścia pochwy i powoli włóż do pochwy końcówkę mikropipety zawierającą 10 μl DPBS.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że końcówka mikropipety jest wprowadzona przez ujście pod kątem 10 - 30°, aby uniknąć przebicia ściany pochwy. Po włożeniu płyn powinien być nadal widoczny w końcówce. Jeśli płyn nie jest widoczny, oznacza to, że końcówka została włożona zbyt głęboko do pochwy, a obszar szyjki macicy pochwy mógł być perforowany.</li>
		<li>Delikatnie pociągnij w dół mięśnie ujścia pochwy końcówką mikropipety, aby umożliwić wydostanie się powietrza z pochwy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powoli przepłukać jamę pochwy, pipetując w górę i w dół 2-3 razy za pomocą 10 μl DPBS i umieścić pobraną zawiesinę komórek na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Użyj mikroskopu z kontrastem z odwróconymi fazami, aby określić etap cyklu rujowego poprzez analizę cytologiczną. Procedura jest wykonywana zgodnie z opisem w innym miejscu10,11. Upewnij się, że zawiesina komórek nie wyschnie przed wykonaniem analizy cytologicznej. W razie potrzeby zawiesinę można rozcieńczyć świeżym DPBS.</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie układu rozrodczego myszy
<ol>
	<li>Ułóż mysz w pozycji leżącej na plecach i rozłóż jej kończyny, aby odsłonić okolicę brzuszno-miedniczną.</li>
	<li>Spryskaj 70% etanolem, aby zwilżyć i zdezynfekować okolicę brzucha miednicy. </li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie unieś skórę znajdującą się nad łechtaczką. Wykonaj małe poprzeczne nacięcia na bocznych stronach dolnej części brzucha, aż do kończyn górnych, aby odsłonić otrzewną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Podczas tego procesu utworzy się zewnętrzna klapa. Ponieważ małe nacięcia są stale wykonywane, klapa będzie się powiększać.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B). Ważne jest, aby pamiętać, że rogi macicy często mogą znajdować się bezpośrednio pod otrzewną, dlatego nacięcia należy wykonywać ostrożnie i nie dotykać rogów, ponieważ może to wpłynąć na ruchliwość macicy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń powięź i tkankę tłuszczową pokrywającą przewód pokarmowy. Usuń następujące segmenty przewodu pokarmowego z jamy brzusznej: dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte, jelito ślepe, okrężnicę wstępującą i poprzeczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Aby zlokalizować narządy rozrodcze, najpierw zidentyfikuj pęcherz moczowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C, "4"), który może mieć opróżniony wygląd z powodu mikcji po eutanazji. Pochwa będzie znajdować się tuż pod pęcherzem moczowym.</li>
	<li>Zlokalizuj spojenie łonowe u zbiegu kości łonowych (doogonowo do pęcherza</li> moczowego).
	<li>Za pomocą nożyczek usuń spojenie łonowe, ostrożnie wykonując nacięcia po jego bocznych bokach przez tkankę włóknisto-chrzęstną międzyłonową, aby uzyskać dostęp i zapewnić drogę do ekstrakcji pochwy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Przeciąć krocze znajdujące się między odbytem a dolną częścią sromu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy podnieś pochwę i powoli wytnij odbytnicę.</li>
	<li>Zidentyfikuj dwa rogi macicy, które rozwidlają się w widelec, proporcjonalnie do pochwy. Zlokalizuj pofałdowany jajowód i jajnik na końcu każdego rogu, który może być ukryty pod pozostałymi segmentami przewodu pokarmowego. Użyj małych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć wszelkie więzadła, które łączą się i podtrzymują rogi, jajowody i jajniki w jamie brzusznej.</li>
	<li>Usuń układ rozrodczy, który obejmuje pochwę, macicę, jajowody i jajniki, z jamy brzusznej.</li>
	<li>Przenieś izolowany układ rozrodczy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1E) na 100 mm szalkę Petriego wypełnioną 10 ml DPBS. Nie uciskaj rogów macicy, aby uniknąć uszkodzenia mięśniówki macicy.</li>
	<li>Użyj kleszczy i nożyczek chirurgicznych, aby usunąć tkankę łączną i tłuszczową otaczającą rogi macicy i pochwę, a także sierść w okolicy łonowej, która mogłaby pogorszyć jakość obrazu. Usuń więzadło szerokie, aby umożliwić ruchliwość rogów macicy.</li>
	<li>Przemyć wyizolowany układ rozrodczy świeżym DPBS dwa razy i przenieść go na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną 3 ml natlenionego roztworu Krebsa.</li>
</ol>
5. Obrazowanie tkanek
<ol>
	<li>Umieścić szalkę Petriego zawierającą układ rozrodczy w natlenionym buforze Krebsa na czarnej powierzchni. Utrzymuj naczynie w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Możliwe jest użycie podkładki rozgrzewającej na podczerwień w celu utrzymania tkanki w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odczekaj 15-30 minut, aby zaczęły się spontaniczne skurcze. Rejestruj spontaniczną ruchliwość macicy przez 10 minut od płaszczyzny osiowej za pomocą dowolnego rodzaju cyfrowego sprzętu wideo.</li>
	<li>Przenieść preparat na szalkę Petriego zawierającą natleniony bufor Krebsa uzupełniony badanym związkiem. Rejestruj spontaniczną ruchliwość macicy przez około 10 minut od płaszczyzny osiowej za pomocą dowolnego rodzaju cyfrowego sprzętu wideo.</li>
	<li>Przemyć cały układ rozrodczy na 100 mm szalce Petriego z 10 ml DPBS, aby ocenić odwracalność leczenia.</li>
	<li>Przenieść preparat na szalkę Petriego ze świeżo natlenionym buforem Krebsa. Rejestruj spontaniczną ruchliwość macicy przez około 10 minut od płaszczyzny osiowej za pomocą dowolnego rodzaju cyfrowego sprzętu wideo.</li>
	<li>Przenieść preparat na inną szalkę Petriego o średnicy 35 mm, wypełnioną natlenionym buforem Krebsa, uzupełnionym nośnikiem badanego związku, aby upewnić się, że nie ma mechanicznie wywołanych zmian w spontanicznej ruchliwości macicy. Jest to ważna kontrola.</li>
	<li>Przenieś materiał wideo na dysk twardy komputera.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Twórz klipy za pomocą dowolnego oprogramowania do edycji wideo z oryginalnego materiału wideo zawierającego odcinki kontrolne, lecznicze i myjące.</li>
	<li>Użyj oprogramowania MATLAB i dostarczonego skryptu (patrz materiały uzupełniające online), aby określić ilościowo spontaniczną ruchliwość macicy. 
	nuta: Aby skrypt był w pełni funkcjonalny, musi być zainstalowany dodatek Computer Vision Toolbox dla programu MATLAB.
	<ol>
		<li>Otwórz skrypt MATLAB, przejdź do zakładki Edytor i kliknij Uruchom.</li>
		<li>Wybierz pierwszy plik wideo i kliknij przycisk Otwórz.</li>
		<li>Wprowadź etykietę pliku wideo w wyskakującym oknie dialogowym i kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Wprowadzić przedział czasowy (s) potrzebny do obliczenia szybkości ruchu klaksonu (Δ odległość euklidesowa / Δs).</li>
		<li>Użyj kursora myszy, aby zaznaczyć dwa punkty w pierwszej klatce wideo. Pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o potwierdzenie, że wybrane punkty powinny być używane do śledzenia. Kliknij Start, aby zainicjować proces śledzenia w czasie rzeczywistym, który zostanie wyświetlony w wyskakującym okienku. Można również kliknąć przycisk Ponownie wybierz punkty, aby ponownie wybrać te dwa punkty.</li>
		<li>Monitoruj dokładność procesu śledzenia w wyskakującym okienku.</li>
		<li>Obserwuj wykres punktowy szybkości w funkcji czasu i wykres punktowy odległości w czasie w nowym oknie podręcznym. Zapisz dwie figury, wybierając punkt menu Plik | Zapisz jako w tym samym oknie, aby udokumentować dane.</li>
		<li>Znajdź folder o nazwie PointTrackerData, automatycznie utworzony przez program MATLAB, w tym samym katalogu, w którym znajduje się skrypt MATLAB. Zidentyfikuj plik programu Excel o nazwie label_Data zawierający punkty danych zebrane z klipu wideo na dwóch oddzielnych kartach arkusza. 
		UWAGA: Każde alternatywne oprogramowanie do śledzenia ruchu może być użyte do ilościowego określenia spontanicznej ruchliwości macicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj odpowiedniego oprogramowania (np. Excel lub SigmaPlot 13) do wykonania analizy statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Kuijsters, N. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+peristalsis+and+fertility%3A+current+knowledge+and+future+perspectives%3A+a+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis.</a> Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).</li>
<li>Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menstrual+characteristics+and+prevalence+of+dysmenorrhea+in+college+going+girls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Family+Medicine+and+Primary+Care%22%5BJournal%5D)">Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls.</a> Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).</li>
<li>Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+aerobic+exercise+on+primary+dysmenorrhea%3A+A+clinical+trial+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+education+and+health+promotion%22%5BJournal%5D)">The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study.</a> Journal of education and health promotion. 7, 3(2018).</li>
<li>Lindner, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+prostaglandins+in+the+regulation+of+cyclic+events+in+the+ovary+and+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+prostaglandin+and+thromboxane+research%22%5BJournal%5D)">Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus.</a> Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).</li>
<li>Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysmenorrhea+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+research%22%5BJournal%5D)">Dysmenorrhea and related disorders.</a> F1000 research. 6, 1645(2017).</li>
<li>Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs+for+dysmenorrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+database+of+systematic+reviews%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea.</a> The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751(2015).</li>
<li>Oladosu, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+skeletal+muscle+activity+precedes+spontaneous+menstrual+cramping+pain+in+primary+dysmenorrhea%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+obstetrics+and+gynecology%22%5BJournal%5D)">Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea.</a> American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91(2018).</li>
<li>Lawson, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+exposures+among+nurses+and+risk+of+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+obstetrics+and+gynecology%22%5BJournal%5D)">Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion.</a> American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).</li>
<li>Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+development+in+mice+exposed+to+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Fetal development in mice exposed to isoflurane.</a> Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), 35538(2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).</li>
<li>Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tocolytic+effect+of+catecholamines+in+the+gravid+rat+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+analgesia%22%5BJournal%5D)">The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus.</a> Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylephrine%2C+a+common+cold+remedy+active+ingredient%2C+suppresses+uterine+contractions+through+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling.</a> Scientific reports. 8 (1), 11666(2018).</li>
<li>Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomathematical+pattern+of+EMG+signal+propagation+in+smooth+muscle+of+the+non-pregnant+porcine+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus.</a> PLoS One. 12 (3), 0173452(2017).</li>
<li>Crane, L. H., Martin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pace-maker+activity+in+the+myometrium+of+the+oestrous+rat%3A+in+vivo+studies+using+video-laparoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+fertility%2C+and+development%22%5BJournal%5D)">Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy.</a> Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy metodę oceny spontanicznej kurczliwości całego układu rozrodczego gryzoni, który obejmuje jajniki, jajowody, rogi macicy i pochwę. Zastosowaliśmy podobną metodę, aby wykazać relaksujący wpływ fenylefryny na spontaniczną motorykę macicy13, jednak w przeszłości nie byliśmy w stanie przeprowadzić analizy ilościowej danych. W niniejszej pracy opracowaliśmy algorytm do ilościowej analizy danych motorycznych z wykorzystaniem modułu śledzenia ruchu MATLAB. Jest to przydatna techn...

Jako główny organ żeński, macica jest kluczowa dla reprodukcji i niezbędna dla odżywiania płodu1. Macica składa się z trzech warstw: obwodu macicy, mięśniówki macicy i endometrium. Mięśniówka macicy jest główną warstwą kurczliwą macicy i odgrywa kluczową rolę w porodzie płodu. Endometrium jest najbardziej wewnętrzną warstwą wyściełającą jamę macicy i jest niezbędne do implantacji zarodka. U kobiet w wieku rozrodczym, które nie są w ciąży, warstwa endometrium jest złuszczana co miesiąc na początku cyklu miesiączkowego. Mięśniówka macicy pomaga w tym procesie zrzucania, utrzymując spontaniczne skurcze mięśniówki macicy potrzebne do usunięcia martwiczej tkanki endometrium z macicy1.
Niestety, zwiększona kurczliwość mięśniówki macicy może powodować negatywne skutki uboczne, takie jak bolesne miesiączkowanie lub bolesne skurcze menstruacyjne. Jest to szczególnie widoczne u młodych kobiet i nieródek2. Jednak bolesne miesiączkowanie jest inne dla każdej kobiety i zależy od siły skurczów mięśniówki macicy; Silniejsze skurcze są często związane z uczuciem silnych skurczów3. Kurczliwość mięśniówki macicy można uwidocznić za pomocą USG macicy i często jest rozpoznawana jako fale endometrium. Uważa się, że zwiększone uwalnianie prostaglandyn podczas menstruacji4 w macicy ulegającej złuszczaniu się endometrium przyczynia się do zwiększenia nadkurczliwości mięśniówki macicy, powodując niedokrwienie i niedotlenienie mięśnia macicy, a tym samym zwiększony ból3.
Ciężkie bolesne miesiączkowanie może utrudniać codzienną aktywność niektórych kobiet, a od 3 do 33% kobiet odczuwa bardzo silne bóle, co może spowodować, że kobieta będzie przykuta do łóżka przez 1 do 3 dni każdego cyklu miesiączkowego5. Bolesne miesiączkowanie jest główną przyczyną zachorowalności ginekologicznej u kobiet w wieku rozrodczym, niezależnie od wieku, narodowości i statusu ekonomicznego5. Szacowana częstość występowania bolesnego miesiączkowania jest zarówno wysoka, jak i zmienna, waha się od 45% do 93% u kobiet w wieku rozrodczym5. Ból związany z bolesnym miesiączkowaniem ma wpływ na codzienne życie kobiet i może skutkować słabymi wynikami w nauce u nastolatków, niższą jakością snu, ograniczeniem codziennych czynności i zmianami nastroju5.
Wiele kobiet, które doświadczają ciężkiego bolesnego miesiączkowania, ucieka się do leków dostępnych bez recepty, aby złagodzić swój ból. Takie leki dostępne bez recepty zawierają inhibitory cyklooksygenazy (COX), które zapobiegają tworzeniu się prostaglandyn6. Jednak inhibitory COX są związane z niekorzystnymi zdarzeniami sercowo-naczyniowymi, a około 18% kobiet z bolesnym miesiączkowaniem nie reaguje na te inhibitory7. Dlatego istnieje zapotrzebowanie na nowe leki zmniejszające skurcze menstruacyjne. Ponieważ nadmierna kurczliwość macicy przyczynia się do patogenezy bolesnego miesiączkowania, jedną z możliwych strategii może być stosowanie środków zwiotczających macicę.
Korzystne jest ilościowe określenie efektów potencjalnych leków zwiotczających w modelu naturalnie występujących spontanicznych skurczów przypominających falę mięśniówki macicy. Jednak do tej pory nie opisano skutecznej metody ex vivo do testowania leków rozluźniających mięśnie w nienaruszonej macicy. Obecnie izometryczne pomiary napięcia są wykorzystywane do oceny działania leków zwiotczających (ang. relaxant drug effects). Podczas takich pomiarów pasek mięśni macicy jest utrzymywany na stałej długości pod napięciem wstępnym w kąpieli tkankowej, podczas gdy siła skurczów mięśni macicy jest rejestrowana przed i po stymulacji oksytocyną w obecności lub bez leku zwiotczającego. Chociaż takie podejście jest bardzo przydatne, wymaga drogiego sprzętu. Co więcej, skurcze izometryczne nie przypominają spontanicznych skurczów przypominających falę mięśniową macicy, które naturalnie występują w nienaruszonej macicy. Wyjątkowo fale mięśniówki macicy u gryzoni można uwidocznić jako ruchliwość rogu macicy, gdy cały układ rozrodczy (jajniki, jajowody, macica i pochwa) jest utrzymywany w roztworze buforowym. W tym miejscu przedstawiamy metodę ex vivo monitorowania spontanicznej ruchliwości nienaruszonej macicy myszy umieszczonej na szalce Petriego zawierającej natleniony bufor Krebsa. Opisujemy również algorytm kwantyfikacji ruchliwości z wykorzystaniem trackera ruchu MATLAB. To nowatorskie podejście stanowi łatwą i tańszą alternatywę dla testowania potencjału rozkurczającego naturalnie występujących środków leczniczych i związków syntetycznych.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek epinefryny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; E4642&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's</td><td>PBS Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>17-512Q</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 PROOF</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-2374</td><td></td></tr><tr><td>Rozwarstwianie Ekstra drobno spiczaste precyzyjne kleszcze do odłamków</td><td>Fisher Sceintific</td><td>13-812-42</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione, hartowane nożyczki z drobną tęczówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Preparacja Wysokowydajny modułowy mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kolorowa kamera mikroskopowa o rozdzielczości 5 megapikseli z aktywnym systemem chłodzenia</td><td>Leica</td><td>&nbsp; DFC425 C</td><td></td></tr><tr><td>Stereomaster Mikroskop Światłowodowe źródła światła</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>12-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Waga łodzi</td><td>rybackiej Sceintific&nbsp;</td><td></td><td></td>WB30304</tr><tr><td>Konwertery Astound Standardowy fartuch chirurgiczny&nbsp;</td><td>Kardynał Zdrowia&nbsp;</td><td>9515</td><td>Małe, średnie lub duże</td></tr><tr><td>rękawice</td><td>McKesson Corporation</td><td>20-1080</td><td>Małe, średnie lub duże; bezpudrowe sterylne lateksowe lub nitrylowe rękawice chirurgiczne</td></tr><tr><td>&nbsp; Szalka Petriego</td><td>Corning Falcon</td><td>351029</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>&nbsp; Szalka Petriego</td><td>Corning Falcon</td><td>353001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>95% mieszanina gazów O2- 5% CO2</td><td>Praxair</td><td>&nbsp; MM OXCD5-K</td><td></td></tr><tr><td>Maski z pętlą na uszy</td><td>Valumax International</td><td>5430E-PP</td><td></td></tr><tr><td>DSLR 24,2 MP Aparat</td><td>Canon</td><td>EOS Rebel T6i</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>wersja 2019 lub nowsza</td></tr></tbody></table>

metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na matlab do analizy danych

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Bolesne miesiączkowanie, czyli bolesne skurcze, jest najczęstszym objawem związanym z miesiączką u kobiet, a jego nasilenie może utrudniać codzienne życie kobiet. W tym miejscu przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę, która może być pomocna w testowaniu nowych leków zmniejszających kurczliwość macicy. Metoda ta wykorzystuje unikalną zdolność całego układu rozrodczego myszy do wykazywania spontanicznej ruchliwości, gdy jest utrzymywana ex vivo na szalce Petriego zawierającej natleniony bufor Krebsa. Ta spontaniczna ruchliwość przypomina falistą aktywność mięśniówki macicy ludzkiej, zwaną falami endometrium. Aby wykazać skuteczność metody, zastosowaliśmy dobrze znany lek zwiotczający macicę, epinefrynę. Wykazaliśmy, że spontaniczna ruchliwość całego układu rozrodczego myszy może być szybko i odwracalnie zahamowana przez 1 μM epinefrynę w tym modelu szalki Petriego. Dokumentowanie zmian w motoryce macicy można łatwo wykonać za pomocą zwykłego smartfona lub zaawansowanego aparatu cyfrowego. Opracowaliśmy algorytm oparty na MATLAB, który umożliwia śledzenie ruchu w celu ilościowego określenia spontanicznych zmian ruchliwości macicy poprzez pomiar szybkości ruchów rogu macicy. Główną zaletą tego podejścia ex vivo jest to, że układ rozrodczy pozostaje nienaruszony przez cały czas trwania eksperymentu, zachowując wszystkie wewnętrzne interakcje komórkowe wewnątrz macicy. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest to, że do 10-20% macicy może nie wykazywać spontanicznej ruchliwości. Jak dotąd jest to pierwsza ilościowa metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości macicy w modelu szalki Petriego.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne obrazy wykonane podczas całej procedury izolacji dróg rodnych opisanej w niniejszym protokole. Aby uniknąć zanieczyszczenia buforu futrem, co obniżyłoby jakość wideo, zwilżono ciało myszy 70% etanolem. Głównym punktem orientacyjnym w sekcji sekcji protokołu jest odnalezienie pęcherza moczowego. Macica i pochwa znajdują się poniżej pęcherza moczowego.
Aby przetestować protokół, potraktowaliśmy cały układ rozrodczy epinefryną. E...

Skurcze macicy są ważne dla dobrego samopoczucia kobiet. Jednak patologicznie zwiększona kurczliwość może powodować bolesne miesiączkowanie, szczególnie u młodszych kobiet. W tym miejscu opisujemy prosty preparat ex vivo, pozwalający na szybką ocenę skuteczności leków zwiotczających mięśnie gładkie, które mogą być stosowane w leczeniu bolesnego miesiączkowania.

Metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na MATLAB do analizy danych

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

Nasz protokół jest istotny, ponieważ zapewnia pierwszą ilościową metodę ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości nienaruszonej macicy. To nowatorskie podejście stanowi łatwą i tańszą alternatywę dla testowania potencjału rozkurczającego naturalnie występujących środków leczniczych w związkach syntetycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie wewnątrzmaciczne interakcje komórkowe pozostają nienaruszone przez cały czas trwania eksperymentu.Nadmierna kurczliwość macicy wiąże się z bolesnym miesiączkowaniem, w przypadku którego leki zwiotczające macicę mogą być przydatne w leczeniu. Ta metoda zapewnia łatwy sposób testowania nowych środków zwiotczających. Po potwierdzeniu etapu cyklu rujowego umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i rozłóż kończyny, aby odsłonić brzuszną część miednicy.Zwilż brzuch 70% etanolem i użyj kleszczy, aby ostrożnie podnieść skórę nad łechtaczką. Wykonaj małe poprzeczne nacięcia na bocznych stronach dolnej części brzucha aż do kończyn górnych, aby odsłonić otrzewną. Ostrożnie przeciąć otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy bez uszkadzania rogów macicy, a następnie użyć kleszczy do usunięcia powięzi i tkanki tłuszczowej pokrywającej przewód pokarmowy.Usuń dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte, jelito ślepe oraz okrężnicę wstępującą i poprzeczną. Zlokalizuj pęcherz moczowy, aby zlokalizować pochwę, która znajduje się bezpośrednio pod pęcherzem moczowym. Zlokalizuj spojenie łonowe u zbiegu kości łonowych, ogonowo do pęcherza moczowego i za pomocą nożyczek ostrożnie wykonaj nacięcie po bocznych stronach spojenia łonowego przez tkankę międzyłonową włóknisto-chrzęstną, aby uzyskać dostęp i zapewnić drogę do ekstrakcji pochwy.Przeciąć krocze znajdujące się między odbytem a dolną częścią sromu i użyć kleszczy, aby podnieść pochwę, aby umożliwić powolne wycięcie odbytnicy. Zidentyfikuj dwa rogi macicy, które rozgałęziają się w widelec rostralnie do pochwy i zlokalizuj pokrętny jajowód i jajnik na końcu każdego rogu. Prawidłowa identyfikacja rogów macicy ma kluczowe znaczenie dla zabiegu, aby upewnić się, że tkanki nie są uszkodzone.Użyj małych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć wszelkie więzadła, które łączą się i podtrzymują rogi, jajowody i jajniki w jamie brzusznej, a także usuń pochwę, macicę, jajowody i jajniki. Przenieś cały izolowany układ rozrodczy na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów PBS firmy Dulbecco. Użyj kleszczy i nożyczek chirurgicznych, aby usunąć tkankę łączną i tłuszczową otaczającą rogi macicy i pochwę, a także sierść w okolicy łonowej, która mogłaby pogorszyć jakość obrazu.Usuń więzadło szerokie, aby umożliwić ruchliwość rogów macicy i przemyj tkankę dwa razy świeżym PBS Dulbecco na przemycie przed przeniesieniem izolowanego układu rozrodczego na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry natlenionego roztworu Krebsa. W celu zobrazowania spontanicznej ruchliwości umieść szalkę Petriego na czarnej powierzchni w temperaturze pokojowej i odczekaj od 15 do 30 minut, aby rozpoczęły się spontaniczne skurcze. Gdy można zaobserwować ruch, rejestruj spontaniczną ruchliwość macicy przez 10 minut z płaszczyzny osiowej za pomocą dowolnego rodzaju cyfrowego sprzętu wideo.Następnie przenieść preparat na szalkę Petriego zawierającą natleniony bufor Krebsa uzupełniony badanym związkiem i rejestrować spontaniczną ruchliwość macicy przez dodatkowe 10 minut w ten sam sposób. Pod koniec okresu rejestracji przemyć cały układ rozrodczy w 10 mililitrach PBS Dulbecco na 100-milimetrowej szalce Petriego i przenieść próbkę na nową szalkę Petriego ze świeżo natlenionym buforem Krebsa w celu oceny odwracalności zabiegu. Rejestruj spontaniczną ruchliwość macicy przez około 10 minut w taki sam sposób, jak w przypadku dwóch ostatnich nagrań.Następnie przenieść preparat na inną 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną natlenionym buforem Krebsa uzupełnionym nośnikiem badanego związku, aby upewnić się, że nie ma mechanicznie wywołanych zmian w spontanicznej ruchliwości macicy. Preparat do budowy układu rozrodczego wykazywał dużą ruchliwość w panelach A i C przy braku epinefryny. Ale ten fenotyp jest uśpiony w panelu B z obecnością jednej epinefryny mikro muller.W tym miejscu przedstawiono przykładową analizę danych dotyczących podawania epinefryny i spontanicznej odzyskiwania ruchliwości, ilustrując, w jaki sposób wpływ hormonu na spontaniczną ruchliwość układu rozrodczego można określić ilościowo na podstawie zapisów tkanki pobranej przed, w trakcie i po leczeniu badanym związkiem. Ważne jest, aby unikać ściskania lub nadmiernego rozciągania rogów macicy, w przeciwnym razie nie zaobserwuje się spontanicznej kurczliwości. Nasza metoda może być również stosowana do badania związków, które mogą zwiększać kurczliwość macicy.Procedura ta może być stosowana do ciężarnej macicy myszy we wcześniejszych stadiach ciąży. Eksperyment ten ma potencjał, aby zostać zmodernizowany do formatu płytki sześciodołkowej do przepływowych badań przesiewowych leków.

ex-vivo-method-for-assessing-mouse-reproductive-tract-spontaneous

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Ten manuskrypt zawiera protokół wszczepiania telemetrów myszom w celu pomiaru ciśnienia wewnątrzmacicznego podczas ciąży.

Telemetria wewnątrzmaciczna do pomiaru ciśnienia skurczowego myszy in vivo

Ten protokół opisuje technikę oceny zmian w unaczynieniu matki podczas ciąży u myszy. Za pomocą metod stereologicznych ocenia się ilościowo przebudowę dziesiętnych tętnic spiralnych, a wyniki potwierdza się jakościowo za pomocą immunohistochemii.

Ocena przebudowy naczyń krwionośnych matki w czasie ciąży w macicy myszy

Myszy są powszechnie używane do badania biologii ciąży. W przypadku takich badań wymagane jest jednak przerwanie ciąży, co wyklucza badania podłużne i wymaga wykorzystania dużej liczby zwierząt. Dlatego opisujemy nieinwazyjną technikę ultrasonografii o wysokiej częstotliwości do wczesnego wykrywania i monitorowania zdarzeń poimplantacyjnych u ciężarnej myszy.

Nowatorskie zastosowanie trójwymiarowej ultrasonografii o wysokiej częstotliwości do charakteryzowania wczesnej ciąży u myszy

Upłynnienie nasienia jest niezbędne do uwolnienia nasienia z żelu nasiennego. W badaniu przedstawiono procedury pobierania nasienia z żeńskiego układu rozrodczego po stosunku płciowym oraz pomiaru czasu upłynnienia nasienia.

Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fluorescencyjnie znakowanych fragmentów ludzkiego endometrium przeszczepionych myszom. Metoda pozwala na badanie wpływu wybranych leków na wielkość zmiany endometriotycznej poprzez monitorowanie i kwantyfikację fluorescencji emitowanej przez reporter fluorescencyjny w czasie...

Nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje metodę monitorowania postępu zmian morfologicznych w czasie w macicy w indukowalnym mysim modelu raka endometrium za pomocą obrazowania ultrasonograficznego z korelacją zmian ogólnych i histologicznych.

Nieinwazyjna ocena ultrasonograficzna progresji raka endometrium w kierowanej przez Pax8 delecji supresorów guza Arid1a i Pten u myszy

Ustanowienie ciąży to dynamiczny proces obejmujący skomplikowane przenikanie się zarodków i macicy. Dokładny wkład środowiska macicy matki w te procesy pozostaje aktywnym obszarem badań. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły, które mają pomóc w projektowaniu modeli zwierzęcych in vivo, aby odpowiedzieć na te pytania badawcze.

Metody badania wkładu macicy w powstanie ciąży w mysim modelu owariektomii

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Poznaj metodę ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości macicy myszy z zachowaniem wszystkich interakcji komórkowych. Technika umożliwia testowanie leków rozkurczowych w badaniach nad leczeniem dysmenorrei.

Metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na MATLAB do analizy danych (Wideo) | JoVE Journal

Metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na MATLAB do analizy danych

Przeglądaj więcej filmów