Name: Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę nokautu genów w komórkach macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla przy użyciu elektroporacji kompleksów CAS9-gRNA. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów regeneracji nerwów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Prof. Elly M. Tanaka za jej ciągłe i długoterminowe wsparcie. Praca ta była wspierana przez grant (317716) Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC), granty na rozpoczęcie badań z South China Normal University (S82111 i 8S0109) oraz grant China Postdoctoral Science Foundation (2018M633067).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach muszą być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach oraz za zgodą odpowiedniej instytucjonalnej komisji rewizyjnej.
1. Przygotowanie mieszanki CAS9-gRNA RNP
<ol>
	<li>Projektowanie i synteza gRNAs. 
	UWAGA: Zapoznaj się z innymi publikacjami dotyczącymi projektowania i syntezy gRNA, w tym jedną dotyczącą wyłącznie aksolotlów15,20,21,22.</li>
	<li>Białko CAS9-NLS można uzyskać, przygotowując je we własnym zakresie lub kupując je komercyjnie.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę CAS9-gRNA, mieszając 5 μg białka CAS9-NLS, 4 μg gRNA, 0,9 μl buforu 10x CAS9 i uzupełnić objętość do 10 μl wolnym od nukleazH2O. Podwielokrotnić mieszaninę i przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli nie zostanie natychmiast zużyta.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek agarozowych do elektroporacji
<ol>
	<li>Przygotować 200 ml 2% (wag./obj.) roztworu agarozy w 1x DPBS. Rozpuść przez podgrzanie roztworu w kuchence mikrofalowej i wylej go na 10 cm szalki Petriego na głębokość około 10 mm (na tyle głęboko, aby przykryć całe zwierzę).</li>
	<li>Pozwól płytkom zastygnąć w temperaturze pokojowej. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.</li>
	<li>Za pomocą skalpeli chirurgicznych przetnij płytkę agarozy, aby zrobić szczelinę do trzymania ogona prosto, studzienkę do dopasowania do ciała zwierzęcia i dwie dodatkowe studzienki do umieszczenia elektrod (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Umieść talerz na lodzie i napełnij go po brzegi lodowatym 1x DPBS. Użyj tego samego rozwiązania DPBS do wykonania płyt, aby zapewnić stałą przewodność elektryczną w konfiguracji.</li>
</ol>
3. Konfiguracja elektroporatora
<ol>
	<li>Skonfiguruj elektroporator. Ustaw impuls poringowy tak, aby składał się z jednego impulsu bipolarnego o napięciu 70 V, o czasie trwania 5 ms, interwale 50 ms i bez zaniku napięcia. Ustaw impuls przesyłowy tak, aby miał cztery impulsy bipolarne 40 V, o czasie trwania 50 ms, interwale 999 ms i 10% zaniku napięcia.</li>
	<li>Podłącz elektrody do elektroporatora i wyreguluj pęsetę tak, aby była oddalona od siebie o 7 mm. Zanurz elektrody w zlewce DPBS przed i pomiędzy elektroporacją.</li>
</ol>
4. Przygotowanie i ładowanie szklanych kapilar do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Wykonaj test rampy na płonącym/brązowym ściągaczu do mikropipet zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić wartość cieplną.</li>
	<li>Ciągnąć kapilary iniekcyjne ze stożkowymi końcami, stosując następujące parametry: ciepło = wartość testu rampy, ciągnięcie = 100, prędkość = 100, czas = 100.</li>
	<li>Obserwuj igłę pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą drobnych kleszczyków przełam kapilarnę pod kątem, tak aby miała skośną końcówkę. Złam w miejscu, w którym jest wystarczająco cienka, aby celować w kanał centralny, a jednocześnie wystarczająco mocna, aby przebić skórę. 
	UWAGA: Punkt, w którym średnica wynosi około 20 μm lub około 50% średnicy rdzenia kręgowego, jest dobrym punktem wyjścia. Aby uzyskać optymalne łamanie, może być konieczne wiele prób.</li>
	<li>Dodać roztwór Fast Green FCF do mieszanki RNP w stosunku 1:30 i załadować około 5 μl mieszanki iniekcyjnej do kapilary za pomocą końcówki do pipety Microloader.</li>
	<li>Zamontuj kapilar na pompie pneumatycznej, ze skośną końcówką skierowaną w dół.</li>
</ol>
5. Konfiguracja pompy pneumatycznej
<ol>
	<li>Skonfiguruj pompę pneumatyczną. Ustaw blokadę na 0,5 funta na cal kwadratowy (psi), wysuń na 2 psi, a czas trwania na bramkowany.</li>
	<li>Przetestuj ustawienia pompy kapilarnej i pneumatycznej, zanurzając kapilar w kropli wody i naciskając pedał nożny w celu wstrzyknięcia. Upewnij się, że mieszanina iniekcyjna wypływa powolnym, ale stałym strumieniem.</li>
	<li>Wyregulować ciśnienie podtrzymania, jeśli mieszanina iniekcyjna zaczyna samoistnie wyciekać lub woda jest zasysana do kapilary. Zwiększyć ciśnienie wyrzutu lub rozbić większą część kapilary, jeśli mieszanina iniekcyjna wypływa zbyt wolno. Zmniejszyć ciśnienie wyrzutu, jeśli wtrysk wypływa zbyt szybko.</li>
</ol>
6. Wstrzykiwanie mieszanki RNP do rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Znieczulaj aksolotle w 0,03% roztworze benzokainy przez co najmniej 10 minut. Sprawdź, czy zwierzęta nie reagują, przewracając je do góry nogami w wodzie.</li>
	<li>Podnieś zwierzę za pomocą kleszczy pierścieniowych i połóż je na łóżku z silikonu, lewą stroną zwierzęcia skierowaną do góry i ogonem skierowanym w prawo. Umieść miejsce wstrzyknięcia w środku pola widzenia mikroskopu stereoskopowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Ustaw mikromanipulator tak, aby kapilar wchodził pod kątem 60° z prawej strony pola widzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Zidentyfikuj rdzeń kręgowy i kanał centralny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Rdzeń kręgowy to struktura rurkowa nad struną grzbietową.</li>
	<li>Kierując się do kanału centralnego, przesuń naczynia włosowate do przodu, aby delikatnie przebić skórę i mięsień do centralnego kanału rdzenia kręgowego. Ogranicz ruch naczyń włosowatych do małych kroków, ponieważ rdzeń kręgowy znajduje się tuż pod mięśniami ogona.</li>
	<li>Naciśnij i przytrzymaj pedał nożny, aby wstrzyknąć mieszankę do kanału centralnego. Obserwuj, czy mieszanina RNP rozprzestrzenia się wzdłuż kanału centralnego jako niebieska linia w obu kierunkach, co pokazuje, że kapilara została prawidłowo ustawiona (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Jeśli tak się nie stanie, przytrzymaj pedał nożny, jednocześnie lekko przesuwając kapilarnę do środka i na zewnątrz, aż mieszanina RNP zacznie wchodzić do środka. Jeśli naczynia włosowate zostaną zatkane przez tkankę, oczyść ją, wyrzucając do wody pod wyższym ciśnieniem.</li>
	<li>Dostosuj ciśnienie wyrzutu tak, aby było wystarczające, aby mieszanina RNP rozprzestrzeniła się w kanale centralnym, ale nie na tyle, aby wysadziła konstrukcję.</li>
	<li>Przytrzymaj pedał nożny, tak aby mieszanina iniekcyjna rozprowadzała się dalej wzdłuż kanału centralnego, aż dotrze do pęcherzyka końcowego na końcu rdzenia kręgowego i komór w mózgu. 
	UWAGA: Może to potrwać do 2 minut w zależności od wielkości zwierzęcia. Po pewnym czasie może być konieczne zwiększenie ciśnienia, aby mieszanina RNP dostała się do komór mózgu.</li>
	<li>Po udanym wstrzyknięciu należy jak najszybciej przystąpić do elektroporacji.</li>
</ol>
7. Elektroporacja
<ol>
	<li>Przenieść zwierzę za pomocą kleszczy pierścieniowych na przygotowaną płytkę do elektroporacji agarozy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E) na lodzie. Umieść ogon w szczelinie tak, aby był umieszczony w warstwie agarozy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Umieść elektrody w studzienkach po obu stronach ogona. Upewnij się, że całe zwierzę i elektrody są pokryte lodowatym PBS.</li>
	<li>Naciśnij przełącznik nożny, aby rozpocząć elektroporację.</li>
	<li>Po zakończeniu elektroporacji włóż zwierzę z powrotem do wody.</li>
	<li>W razie potrzeby należy wstrzyknąć więcej zwierząt.</li>
	<li>Sprawdź, czy elektroporowane zwierzęta są zdrowe po ustąpieniu znieczulenia i czy nie ma uszkodzeń ogona.</li>
</ol>
8. Ocena skuteczności nokautu
<ol>
	<li>Napraw ogon zwierzęcia poddanego elektroporacji. Wykonaj przekroje ogona, a następnie barwienie immunohistochemiczne, aby ocenić skuteczność nokautu na poziomie białka. 
	UWAGA: Jeśli amputacja ogona ma być wykonana po elektroporacji, można do tego celu użyć odciętego ogona. Na przykład zwierzęta poddane elektroporacji gRNA przeciwko Gfp lub tyrozynazie mogą być używane jako kontrola negatywna4.</li>
	<li>Alternatywnie, elektroporowany rdzeń kręgowy może zostać wyekstrahowany i poddany lizie w celu uzyskania DNA. Wykonaj genotypowanie PCR, a następnie sekwencjonowanie Sangera lub sekwencjonowanie nowej generacji, aby ocenić procent edytowanych loci15. 
	UWAGA: Wynikowa wydajność edycji będzie zaniżona rzeczywista wydajność edycji dla NSC, ze względu na włączenie nieelektroporowanych komórek i neuronów, które nie mają wierzchołkowego kontaktu z centralnym światłem, a zatem nie otrzymają mieszanki RNP.</li>
</ol>

<ol><li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration%3A+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li>
<li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Soil+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li>
<li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li>
<li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein%E2%80%93gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002(2016).</li>
<li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li>
<li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).</li>
<li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Fei, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+201706855%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li>
<li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sal-Site%3A+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li>
<li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li>
<li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl%3A+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in%5BTitle%5D)+AND+%22the+Blastema.+PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li>
<li>Fei, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+optimization+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li>
<li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li>
<li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salamander+spinal+cord+regeneration%3A+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li>
<li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Salamanders+in+Regeneration+Research%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li>
<li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260(2015).</li>
<li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+husbandry%2C+breeding%2C+metamorphosis%2C+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisany protokół pozwala na ograniczony czasowo i przestrzennie nokaut genów w NSC w rdzeniu kręgowym aksolotl. Obecny protokół pozwala na precyzyjne namierzanie NSC w określonym czasie i miejscu z wysoką penetracją. Pozwala to uniknąć potencjalnych działań niepożądanych wynikających z nokautu genów w NSC w innych regionach, takich jak mózg, które występują podczas korzystania z systemu Cre-LoxP. Pozwala to również uniknąć skutków rozwojowych wynikających z uporczywego nokautu, co pozwala na badanie funkcji genów skoncen...

Rdzeń kręgowy większości kręgowców nie jest w stanie zregenerować się po urazie, co prowadzi do trwałego kalectwa. Kilka salamander, takich jak aksolotl, jest godnymi uwagi wyjątkami. Aksolotl może w pełni zregenerować strukturalnie identyczny rdzeń kręgowy i całkowicie przywrócić funkcję rdzenia kręgowego. Duża część zdolności regeneracyjnych rdzenia kręgowego aksolotla wynika z komórek wyściółki. Komórki te wyściełają kanał centralny i w przeciwieństwie do tych u ssaków, komórki wyściółki aksolotla pozostają jako nerwowe komórki macierzyste (NSC) po rozwoju embrionalnym. Po urazie rdzenia kręgowego (np. w wyniku amputacji ogona) te NSC namnażają się, aby odrosnąć rurkę wyściółkową i różnicować się, zastępując utracone neurony1,2,3. Odkrycie, w jaki sposób NSC rdzenia kręgowego aksolotla pozostają pluripotencjalne i aktywują się po urazie, może dostarczyć cennych informacji na temat opracowywania nowych strategii terapeutycznych dla pacjentów.
Dzięki postępom w technice nokautowania genów CRISPR-Cas9, wykonywanie nokautów w celu rozszyfrowania funkcji genu stało się łatwiejsze i okazało się, że ma szerokie zastosowanie u różnych gatunków, w tym aksolotlów4,5,6,7,8. Niedawne wydanie pełnego genomu aksolotla i transkryptomu pozwala teraz na ukierunkowanie dowolnego locus genomowego i lepszą ocenę efektów poza celem9,10,11,12,13,14. Opracowano zoptymalizowane protokoły nokautowania i wbijania aksolotli przy użyciu systemu CRISPR-Cas915. Wykazano, że dostarczanie maszynerii CRISPR-Cas9 w postaci rybonukleoproteiny białkowej CAS9-gRNA (RNP) jest bardziej wydajne niż przy użyciu plazmidów kodujących Cas9 i gRNA4. Jest to prawdopodobnie spowodowane tym, że RNP jest mniejszy niż wektory plazmidowe, jego zdolność do natychmiastowego tworzenia pęknięć DNA i chroni gRNA przed degradacją RNA. Ponadto użycie RNP omija transkrypcję i translację; W ten sposób unika się problemów, takich jak siła promotora i optymalne wykorzystanie kodonów, gdy elementy plazmidowe pochodzą z innego gatunku.
Badania nad utratą funkcji są jednym z ogólnych podejść do badania potencjalnych funkcji interesujących genów. W celu zbadania funkcji genów podczas regeneracji, najlepiej byłoby wykonać nokaut tuż przed kontuzją, aby uniknąć wpływu na rozwój. Ponadto nokaut powinien być ograniczony zarówno do NSC, jak i do regionu regeneracji. Wyeliminowanie docelowego genu we wszystkich NSC (w tym w mózgu, co ma miejsce w systemach Cre-LoxP) może wywołać efekty niezwiązane z regeneracją, które mogą zakłócić interpretację wyników. Na szczęście struktura rdzenia kręgowego aksolotla stwarza wyjątkową okazję do nokautowania w NSC w czasie i przestrzeni. Większość NSC rdzenia kręgowego styka się z kanałem centralnym i stanowi zdecydowaną większość komórek stykających się z kanałem centralnym16,17. Dlatego wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego, a następnie elektroporacja, umożliwia dostarczenie do NSC rdzenia kręgowego w żądanym regionie w określonym czasie4,18,19. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób jest to wykonywane, co prowadzi do wysoce penetrującego nokautu w docelowych NSC rdzenia kręgowego. Następnie przeprowadza się dalszą analizę w celu zbadania wpływu na regenerację i zachowanie NSC.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Benzokaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Benzokaina 0,03 % (wag./vol)</td><td>Wymieszać 500 ml 10&razy; TBS, 500 ml 400% (wag./obj.) Holtfreter' s i 30 ml 10% (wag./obj.) roztworu podstawowego benzokainy. Napełnić objętość do 10 l dH2O. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzokaina 10 % (wag./obj.)</td><td>Zmieszać 50 g benzokainy w 500 ml 100% (obj./obj.) etanolu. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 12 miesięcy.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego 1,2 mm średnica zewnętrzna, średnica wewnętrzna 0,94 mm</td><td>Instrument jąkający się&nbsp;</td><td>BF120-94-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>bufor CAS9, 10x</td><td>Mix 200 mM HEPES i 1,5 M KCl w wodzie wolnej od RNaz. Dostosuj pH do 7,5. Filtrować sterylizować, porcjować i przechowywać w temperaturze &minus; 20 &stopni; C przez okres do 24 miesięcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>białko CAS9-NLS&nbsp; &nbsp;</td><td>PNA Bio</td><td>CP03</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych, 10cm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Kleszcze drobne</td><td>Fine Scientific Instruments</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Nepa Gene&nbsp;</td>Generator impulsów <td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BEX</td><td>CUY21EDIT II</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Solution, 5x</td><td>Rozpuść 12,5 mg proszku Fast Green FCF w 10 ml 1&razy; Pbs.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet płonących/brązowych&nbsp;</td><td>Instrument jąkający się&nbsp;</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Holtfreter' Roztwór S 400% (wag./obj.)&nbsp;</td><td>Rozpuścić 11,125 g MgSO4&middot; 7H2O, 5,36 g CaCl2&middot; 2H2O, 158,4 g NaCl i 2,875 g KCl w 10 l dH2O. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Końcówki</td> do pipet Merck <td>105886</td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MN-153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>SYS-PV830</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze pierścieniowe</td><td>Fine Scientific Instruments</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buforowana sól fizjologiczna, 10x</td><td>Rozpuść 24,2 g zasady Tris i 90 g NaCl w 990 ml dH2O. Dostosuj pH do 8,0, dodając 10 ml HCl o stężeniu 37% (obj. / obj.). Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta z 2-okrągłą elektrodą platynową o zmiennej szczelinie, średnica 10 mm</td><td>Nepa Gene&nbsp;</td><td></td><td></td>CUY650P10</tr></tbody></table>

bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-grna cas9

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Aksolotl posiada unikalną zdolność do pełnej regeneracji swojego rdzenia kręgowego. Wynika to w dużej mierze z tego, że komórki wyściółki pozostają przez całe życie jako nerwowe komórki macierzyste (NSC), które namnażają się, aby zreformować cewkę wyściółkową i różnicować się w utracone neurony po urazie rdzenia kręgowego. Rozszyfrowanie, w jaki sposób te NSC zachowują pluripotencję po rozwoju i namnażają się po urazie rdzenia kręgowego w celu zreformowania dokładnej struktury przed urazem, może dostarczyć cennych informacji na temat tego, jak rdzenie kręgowe ssaków mogą się regenerować, a także potencjalnych opcji leczenia. Przeprowadzenie nokautów genów w określonych podzbiorach NSC w ograniczonym czasie pozwoli na badanie mechanizmów molekularnych stojących za tymi procesami regeneracyjnymi, bez zakłóceń spowodowanych efektami zakłócającymi rozwój. Opisano tutaj metodę wykonywania nokautu genów w NSC rdzenia kręgowego aksolotla przy użyciu systemu CRISPR-Cas9. Poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację, docelowe geny są eliminowane w NSC w określonych obszarach rdzenia kręgowego w pożądanym punkcie czasowym, co pozwala na badania molekularne NSC rdzenia kręgowego podczas regeneracji.

Iniekcja i elektroporacja kompleksu CAS9-gRNA przeciwko Sox2 do kanału centralnego rdzenia kręgowego aksolotla doprowadziły do masowej utraty immunoreaktywności SOX2 w większości NSCs rdzenia kręgowego, przy zastosowaniu gRNA przeciwko tyrozynazie (Tyr) jako kontroli (Rycyna 2A). B3-tubulina (barwiona TUJ1) jest markerem neuronów i nie była wyrażana w NSCs, a komórki SOX2- TUJ1- otaczające kanał centralny uznano za komórki z delecjami Sox2. Ilościowa analiz...

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia ograniczonego czasowo i przestrzennie nokautowania genów w rdzeniu kręgowym aksolotla poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację.

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Protokół ten umożliwia szybkie i wysoce penetrujące nokautowanie genów w ograniczonych czasowo i przestrzennie nerwowych komórkach macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla w celu zbadania molekularnych mechanizmów regeneracji rdzenia kręgowego. Technika ta pozwala na badanie funkcji genów w nerwowych komórkach macierzystych, ich medyczną regenerację bez zakłócania przez efekty rozwojowe lub efekty innych typów komórek. Nerwowe komórki macierzyste aksolotla w dużej mierze przyczyniają się do ich zdolności do regeneracji rdzenia kręgowego.Zrozumienie mechanizmów regeneracji może doprowadzić do uzyskania informacji potrzebnych do opracowania metod leczenia urazów rdzenia kręgowego u ludzi. Metoda ta dostarcza informacji na temat tego, w jaki sposób nerwowe komórki macierzyste aksolotla reagują regeneracyjnie na uraz rdzenia kręgowego. Prawidłowe umieszczenie kapilary iniekcyjnej w centralnej kolumnie rdzenia kręgowego może być trudne, a ćwiczenie na zwierzętach doświadczalnych pomaga w opanowaniu techniki.Wgląd w podawaną lekcję może pokazać, jak wykonać wstrzyknięcie i jak wygląda udane wstrzyknięcie. Aby przygotować mieszaninę białek rybojądrowych przewodnika RNA Cas9, wymieszaj pi

direct-gene-knock-out-axolotl-spinal-cord-neural-stem-cells-via

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Mutageneza ukierunkowana na geny jest teraz możliwa w szerokim zakresie organizmów przy użyciu technik edycji genomu. W tym miejscu demonstrujemy protokół celowanej mutagenezy genów przy użyciu aktywatora transkrypcji, takiego jak nukleazy efektorowe (TALEN) u Astyanax mexicanus, gatunku ryb, który obejmuje ryby powierzchniowe i jaskiniowe.

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół mikroiniekcji do edycji genów w zarodkach sumów kanałowych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. W tym protokole przewodnikowe RNA i białko Cas9 zostały mikrowstrzyknięte do żółtka jednokomórkowych zarodków. Protokół ten został zweryfikowany poprzez wyeliminowanie dwóch genów związanych z odpornością suma kanałowego.

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Tutaj opisujemy protokół wprowadzania nokautu genu do zewnątrzkomórkowego amastigotu Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu może być śledzony albo przez liczenie komórek w aksenowej kulturze amastigotów, albo przez proliferację wewnątrzkomórkowych amastigotów po inwazji komórek gospodarza.

Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

Tym celem tego protokołu jest produkcja chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi pochodzącymi z tkanki dawcy zmutowanej, Cas9, przy użyciu technik przeszczepu tkanek embrionalnych.

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Poznaj metodę nokautu genów w komórkach macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla przy użyciu elektroporacji kompleksów CAS9-gRNA. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów regeneracji nerwów.

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9 (Wideo) | JoVE Journal

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9

Przeglądaj więcej filmów