Name: Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: Poznaj metodę hodowli sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu. Technika 3D zwiększa samoodnawianie i różnicowanie osteogeniczne komórek PDL w porównaniu do tradycyjnych metod kultury.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było sponsorowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 81700978), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (1504219050), Fundację Nauk Przyrodniczych w Szanghaju (17ZR1432800) oraz Shanghai Medical Exploration Project (17411972600).

Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szkoły i Szpitala Stomatologicznego, Uniwersytet Tongji. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.
1. Izolacja komórek PDL
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę proliferacyjną do hodowli komórek PDL: pożywkę α-MEM uzupełnioną 10% FCS i 100 U / ml pióra / paciorkowca.</li>
	<li>Przygotuj pojemnik z lodem do przenoszenia izolowanych trzecich zębów trzonowych.</li>
	<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu.</li>
	<li>Ekstrakcja normalnych trzecich zębów trzonowych dotkniętych chorobą człowieka od dorosłych (w wieku 18-28 lat) w Klinice Dentystycznej Szkoły i Szpitala Stomatologicznego Uniwersytetu Tongji.</li>
	<li>Umieścić trzecie zęby trzonowe w pożywce proliferacyjnej i przenieść do laboratorium w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść usunięty ząb na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm, pracując w kapturze z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Dodaj 10 ml PBS, aby umyć usunięty ząb. Powtórz krok prania dwukrotnie.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela delikatnie oddziel PDL od korzenia. 
	UWAGA: PDL należy zeskrobać ze środkowej trzeciej części korzenia, aby uniknąć zanieczyszczeń z tkanek dziąseł lub wierzchołkowych.</li>
	<li>Zmiel PDL na 1-2 mm fragmenty za pomocą wysterylizowanego ostrza skalpela.</li>
	<li>Umieść fragmenty PDL w kolbie hodowlanej T-25, wypełnionej 3-4 ml pożywki proliferacyjnej.</li>
	<li>Wyhodować próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 z wilgotnym powietrzem.</li>
	<li>Zaobserwowano zmianę pożywki hodowlanej po wyrośnięciu komórek PDL. Zwykle potrzeba 1-2 tygodni na wyrośnięcie komórek PDL. Obserwuj wzrost komórek PDL za pomocą mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami.</li>
	<li>Następnie zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Gdy komórki PDL osiągną konfluencję, subhodowla komórek w stosunku 1:4 (pasaż 1).</li>
	<li>Obserwuj wzrost komórek codziennie i zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Wykonuj każde kolejne przejście w stosunku 1:4 po osiągnięciu przez komórki 80% zbieżności. Użyj komórek PDL od trzeciej do piątej generacji do wysiewu komórek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie filmów chitozanowych
<ol>
	<li>W celu przygotowania 1% (v/v) roztworu kwasu octowego dodać 5 ml kwasu octowego do 495 ml podwójnie destylowanej wody w czystej szklanej zlewce.</li>
	<li>W celu przygotowania 1% w/v roztworu chitozanu odważyć 5 g proszku chitozanu (średnia masa cząsteczkowa 400 kDa, 85% stopień acetylacji) i dodać do 495 ml 1% (v/v) roztworu kwasu octowego.</li>
	<li>Mieszać przygotowany roztwór przez 24 godziny za pomocą mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Przygotowany roztwór należy sterylizować w autoklawie, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie chitozanu. 
	UWAGA: Na tym etapie eksperyment można wstrzymać.</li>
	<li>Aby utworzyć warstwy chitozanu, dodaj 1% w/v roztworu chitozanu do naczyń z polistyrenu do kultur tkankowych (TCPS) w ilości 0,25 ml/cm2. Na przykład dodać 0,5 ml 1% w/v roztworu chitozanu do jednego dołka z 24-dołkową płytką.</li>
	<li>Suszyć naczynia TCPS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 24 godziny, aby utworzyć film chitozanowy.</li>
	<li>Przygotować 0,5 N wodorotlenku sodu (NaOH). Wymieszaj 10 g NaOH, po trochu, z dużą objętością podwójnie destylowanej wody za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie rozcieńczyć roztwór, aby uzyskać 0,5 l. 
	UWAGA: Dodaj NaOH do wody - nie dodawaj wody do stałego NaOH. Nie dotykaj NaOH! Może to spowodować oparzenia chemiczne.</li>
	<li>Zneutralizować warstwy chitozanu za pomocą 0,5 N NaOH. Dodać 0,5 ml 0,5 N roztworu NaOH do jednego dołka 24-dołkowej płytki na 2 godziny.</li>
	<li>Umyj folie chitozanu trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną. 
	UWAGA: Na tym etapie eksperyment można wstrzymać.</li>
	<li>Przed wysiewem komórek wysterylizuj 24-dołkowe płytki pokryte chitozanem w 70% alkoholu przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać płytki pokryte chitozanem trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Sterylizuj płytki pokryte chitozanem przez obróbkę w świetle ultrafioletowym przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Rozsiewanie komórek
<ol>
	<li>Wstępnie podgrzać roztwór PBS pożywki proliferacyjnej i roztwór trypsyny/EDTA do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant z kolby do hodowli komórek T-75.</li>
	<li>Przemyć zbiegające się komórki PDL 10 ml roztworu PBS.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu trypsyny/EDTA do kolby do hodowli komórek T-75.</li>
	<li>Inkubować komórki w roztworze trypsyny/EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zakończyć proces trawienia trypsyny, dodając 3 ml pożywki proliferacyjnej do kolby do hodowli komórek T-75.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant ze stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki proliferacyjnej.</li>
	<li>Policz komórki PDL za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Nasiona komórek PDL o gęstości 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104 i 6 x 104 komórki/cm2.</li>
	<li>Hodowla komórek PDL na foliach chitozanu w inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO2 z wilgotnym powietrzem.</li>
	<li>Następnie zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>W dniach 1, 2, 3, 4 i 5 codziennie obserwuj morfologię komórek za pomocą mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami.</li>
</ol>
4. Przeżywalność komórek
<ol>
	<li>Po 1, 3 i 6 dniach hodowli określ przeżycie komórek za pomocą komercyjnego zestawu żywotności/cytotoksyczności.</li>
	<li>W probówce o pojemności 15 ml przygotuj 2 ml świeżego roztworu 2 mM kalceiny-AM i 4 mM homodimeru etydyny w PBS, wirując przez 5 s. 
	UWAGA: Utrzymuj proces w ciemności.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i umyć sferoidy w PBS.</li>
	<li>Inkubować sferoidy w PBS zawierającym 2 mM kalceiny-AM i 4 mM homodimeru etydyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przepłucz sferoidy dwukrotnie w PBS. W przypadku sferoid z jednego dołka na płytce 24-dołkowej należy za każdym razem użyć 2 ml PBS.</li>
	<li>Obserwuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 10x lub 20x.</li>
</ol>

<ol><li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li>
<li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li>
<li>Chen, F. M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+tissue+engineering+and+regeneration%3A+current+approaches+and+expanding+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Review%22%5BJournal%5D)">Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities.</a> Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+periodontal+tissue+regeneration+by+periodontal+cell+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation.</a> Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).</li>
<li>Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Approaches+in+Periodontal+Regeneration%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Periodontal+Defect+Models+in+Animal+Experimental+Work%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Review%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work.</a> Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).</li>
<li>Itaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+changes+of+periodontal+ligament-derived+cells+during+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+engineered+tendon+matrix+in+the+stemness+of+tendon+stem+cells+in+vitro+and+the+promotion+of+tendon-like+tissue+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo.</a> Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).</li>
<li>Elliott, N. T., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+three-dimensional+in+vitro+tissue+models+for+drug+discovery+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li>
<li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li>
<li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Activities+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.+Biomolecules+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li>
<li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li>
<li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+a+three-dimensional%2C+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).</li>
<li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li>
<li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+as+antimicrobial+agent%3A+applications+and+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu wprowadzono system hodowli komórkowych 3D w celu przezwyciężenia pewnych ograniczeń związanych z konwencjonalną jednowarstwową hodowlą komórkową 2D. Zgodnie z protokołem, sferoidy komórkowe PDL zostały z powodzeniem utworzone przez hodowlę komórek na błonach chitozanu. Nasze poprzednie badanie wykazało, że tworzenie sferoidów zwiększyło zdolności do samoodnawiania się i różnicowania osteogennego komórek PDL14. Zamiast używać enzymu do zbierania komórek z TCPS, sferoidy komórek...

Zapalenie przyzębia, inicjowane głównie przez płytkę nazębną1, charakteryzuje się uszkodzeniem tkanek przyzębia, w tym więzadła przyzębia (PDL), kości wyrostka zębodołowego i cementu. Obecne metody leczenia zapalenia przyzębia są zwykle skuteczne w zapobieganiu postępowi aktywnej choroby, ale regeneracja utraconych tkanek przyzębia pozostaje wyzwaniem klinicznym. Ostatnio poczyniono znaczne postępy w metodach regeneracji tkanek przyzębia opartych na komórkach, aby przezwyciężyć wady obecnych metod leczenia2,3,4.
Nasz poprzedni przegląd systematyczny wykazał, że komórki PDL wykazują duży potencjał do regeneracji przyzębia5. Tradycyjnie komórki PDL są hodowane na dwuwymiarowych (2D) podłożach, takich jak polistyren do hodowli tkankowych (TCPS). Jednak charakterystyczne zmiany w komórkach PDL zaobserwowano podczas hodowli in vitro6. Zjawisko to wynika prawdopodobnie z tego, że TCPS 2D różni się od trójwymiarowego (3D) mikrośrodowiska in vivo7. W porównaniu z komórkami hodowanymi na podłożach 2D, komórki hodowane w mikrośrodowisku 3D wykazują więcej podobieństw do komórek in vivo8. Dlatego modele 3D hodowli komórkowych stanowią obiecującą alternatywę dla konwencjonalnej jednowarstwowej hodowli komórkowej 2D.
Konwencjonalna metoda hodowli 3D polega na zamknięciu komórek w biomateriałach 3D. W porównaniu z komórkami zamkniętymi w biomateriałach 3D, sferoidy komórkowe bardziej naśladują sytuację in vivo, ponieważ sferoidy są agregatami komórek rosnących bez ciał obcych9,10,11,12. Doniesiono, że sferoidy komórkowe promowały bioaktywność MSC poprzez zachowanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), w tym fibronektyny i lamininy13. Aby ulepszyć konwencjonalne modele hodowli komórkowych PDL, niedawno opracowaliśmy metodę hodowli komórek 3D PDL, która opiera się na sferoidalnym tworzeniu komórek PDL na foliach chitozanowych14. Tworzenie sferoidów zwiększyło zdolność komórek PDL do samoodnawiania się i różnicowania osteogennego14. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły hodowli sferoidów komórek PDL oparte na filmach chitozanowych. System hodowli 3D sferoid komórkowych PDL przezwycięża niektóre niedociągnięcia związane z konwencjonalną hodowlą komórkową TCPS, a zatem może być odpowiedni do wytwarzania komórek PDL o zwiększonej skuteczności terapeutycznej dla przyszłej regeneracji tkanek przyzębia.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Gibco</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>kwas octowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Chitozan</td><td>Heppe Medical&nbsp; Chitozan GmbH</td><td>/</td><td>masa cząsteczkowa 500 kDa, stopień deacetylacji 85%</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy Żywotność / Cytotoksyczność Zestaw</td><td>molekularny&nbsp; Sondy</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310732</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>KeyGen Biotech&nbsp;</td><td></td><td></td>KGB5001</tr><tr><td>długopis/paciorkowiec</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA&nbsp;</td><td>KeyGen Biotechnologia&nbsp;</td><td></td><td></td>KGM25200</tr><tr><td>stożkowa probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Komórki więzadła przyzębia (PDL) są bardzo obiecujące dla regeneracji tkanek przyzębia. Tradycyjnie komórki PDL są hodowane na dwuwymiarowych (2D) podłożach, takich jak polistyren do hodowli tkankowych (TCPS). Jednak podczas hodowli in vitro zaobserwowano charakterystyczne zmiany w komórkach PDL. Zjawisko to wynika prawdopodobnie z tego, że TCPS 2D różni się od trójwymiarowego (3D) mikrośrodowiska in vivo. W porównaniu z komórkami hodowanymi na podłożach 2D, komórki hodowane w mikrośrodowisku 3D wykazują więcej podobieństw do komórek in vivo. Dlatego modele 3D hodowli komórkowych stanowią obiecującą alternatywę dla konwencjonalnej jednowarstwowej hodowli komórkowej 2D. Aby ulepszyć konwencjonalne modele hodowli komórkowych PDL, opracowaliśmy niedawno metodę hodowli komórek 3D, która opiera się na sferoidalnym tworzeniu komórek PDL na warstwach chitozanu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły hodowli sferoidów komórkowych oparte na filmach chitozanowych. System hodowli 3D sferoid komórkowych PDL pokonuje niektóre ograniczenia związane z konwencjonalną jednowarstwową hodowlą komórkową 2D, a zatem może być odpowiedni do wytwarzania komórek PDL o zwiększonej skuteczności terapeutycznej dla przyszłej regeneracji tkanek przyzębia.

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwoliło na pomyślne utworzenie żywotnych sferoidów komórek PDL. Na Rycini 1 pokazano, że na błonach chitozanowych obserwowano głównie komórki w zawiesinie lub sferoidy zamiast komórek przylegających. Przy gęstości zasiewu 0,5 x 104 komórek/cm2 przylegające komórki PDL stwierdzano sporadycznie w 1. i 3. dniu, a sferoidy komórek PDL obserwowano rzadko. Przeciwnie, przy gęstościach zasiewu 3 x 104</...

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli sferoidów komórek ludzkiego więzadła przyzębia (PDL) za pomocą filmów chitozanowych. Hodowla trójwymiarowych (3D) sferoid komórkowych stanowi alternatywę dla konwencjonalnego systemu hodowli polistyrenowych do hodowli tkankowych (TCPS).

Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Jest to szczegółowy protokół hodowli sferoid komórek więzadeł przyzębia za pomocą filmów chitozanowych. W porównaniu z konwencjonalnym systemem hodowli, system hodowli sferoidalnej wytwarza komórki więzadeł przyzębia o zwiększonej zdolności do samoodnawiania się i różnicowania osteogennego. Na początek przygotuj 1% roztwór chitozanu w stosunku wagowym do objętościowego, zgodnie z zaleceniami w manuskrypcie.Dodaj 0,5 mililitra roztworu chitozanu do każdego dołka 24-dołkowej płytki polistyrenowej do hodowli tkankowej. Suszyć talerz w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby utworzyć filmy chitozanowe. Aby zneutralizować filmy chitozanowe, dodaj 0,5 mililitra 0,5 normalnego wodorotlenku sodu do każdego dołka 24-dołkowej płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Następnie umyj folie chitozanu trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną. Wysterylizuj 24-dołkową płytkę pokrytą chitozanem w 70% alkoholu przez noc w temperaturze pokojowej. Opłucz płytkę trzy razy PBS, a następnie pozostaw ją na noc w świetle ultrafioletowym.Przed wysiewem komórek należy wstępnie podgrzać pożywkę proliferacyjną, roztwór PBS i roztwór trypsyny EDTA do 37 stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant z kolby do hodowli komórkowej i przemyć zlewające się więzadło przyzębia lub komórki PDL 10 mililitrami PBS. Odrzucić PBS i dodać jeden mililitr roztworu trypsyny EDTA do kolby.Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie dodać trzy mililitry pożywki proliferacyjnej, aby zakończyć trawienie trypsyny. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie odwiruj ją przez pięć minut w temperaturze 300 razy g. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach pożywki proliferacyjnej.Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść je na płytce w ilości pięciu, 10, 30 i 60 tysięcy komórek na centymetr kwadratowy. Hoduj komórki PDL w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i nawilżonym powietrzu, zmieniając pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu. Obserwuj morfologię komórek codziennie przez pięć dni za pomocą mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami.Żywotne sferoidy komórek PDL są z powodzeniem tworzone przy użyciu tego protokołu. Sferoidy są rzadko obserwowane w przypadku niższej gęstości wysiewu w pierwszym i trzecim dniu. Ale przy dwóch wyższych gęstościach, różne rozmiary sferoid są obecne od pierwszego dnia.Optymalna gęstość wysiewu to 30 tysięcy komórek na centymetr kwadratowy, ponieważ daje to jednorodne sferoidy. Po pięciu dniach hodowli obserwuje się większe sferoidy dla wszystkich gęstości wysiewu. Test żywotności pokazuje, że większość komórek PDL jest żywa w pierwszym, trzecim i szóstym dniu, ale liczba martwych komórek wzrasta w szóstym dniu.Jednym z ograniczeń tego protokołu jest zmniejszona proliferacja komórek po utworzeniu sferoidów. Potrzebne są więc dalsze badania w celu promowania proliferacji komórek po utworzeniu sferoidów.

formation-human-periodontal-ligament-cell-spheroids-on-chitosan

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano proces wytwarzania nowego, elastycznego chirurgicznego kleju w formie cienkiej warstwy z zatwierdzonych przez FDA składników: chitosanu oraz zieleni indocyjaninowej. Zademonstrowano wiązanie tego kleju z tkanką kolagenową poprzez prosty proces aktywacji z użyciem niskomocnego lasera podczerwonego.

SurgiLux: przygotowanie i demonstracja aktywowanej laserowo cienkiej powłoki chirurgicznego kleju na bazie chitosanu

Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Prezentujemy model tkanki więzadła, w którym trójwymiarowe konstrukty są traktowane ludzką surowicą kondycjonowaną wysilaniem i analizowane pod kątem zawartości kolagenu, funkcji i biochemii komórkowej.

Leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Ten protokół przedstawia metodę hodowli i 3D hodowli komórek podobnych do ameloblastów w mikrograwitacji, aby zachować ich wydłużony i spolaryzowany kształt, a także ekspresję białek specyficzną dla szkliwa. Opisano również warunki hodowli konstruktów inżynierii przyzębia i narządów płuc w warunkach mikrograwitacji.

Rozmnażanie komórek i narządów zębów i dróg oddechowych w mikrograwitacji

Obecny protokół opisuje nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych. Wielkość tych mikrożeli może być precyzyjnie kontrolowana i mogą one wykazywać pęcznienie zależne od pH, ulegać degradacji in vivo i być naładowane cząsteczkami terapeutycznymi, które uwalniają się z czasem w sposób ciągły, co czyni je bardzo istotnymi dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Wytwarzanie mikrożeli chitozanowo-genipinowych o kontrolowanej wielkości i wolnych od emulsji do zastosowań w inżynierii tkankowej

W tym badaniu, szczurzy model indukcji zapalenia przyzębia jest prezentowany poprzez kombinację ligatury retencyjnej i powtarzających się iniekcji lipopolisacharydu pochodzącego z Porphyromonas gingivalis, przez 14 dni wokół pierwszych zębów trzonowych szczęki. Techniki podwiązania i iniekcji LPS były skuteczne w wywoływaniu zapalenia ozębnej, co skutkowało utratą kości wyrostka zębodołowego i stanem zapalnym.

Indukcja zapalenia przyzębia poprzez połączenie ligatury i wstrzyknięcia lipopolisacharydu w modelu szczurzym

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

To badanie opisuje zmodyfikowaną metodę podwiązania nylonu 6-0 do wywoływania zapalenia przyzębia u myszy, która jest wysoce powtarzalna i stanowi alternatywę dla badaczy do badania chorób przyzębia od ich rozwoju do patologicznych konsekwencji.

Mysi model zaawansowanego zapalenia przyzębia wywołanego przez ligaturę nylonową w drugim górnym zębie trzonowym

Poznaj metodę hodowli sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu. Technika 3D zwiększa samoodnawianie i różnicowanie osteogeniczne komórek PDL w porównaniu do tradycyjnych metod kultury.

Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu

Przeglądaj więcej filmów