Name: Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Naucz się izolować komórki nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych i hodować je jako ślikule lub monowarstwy. Ta metoda umożliwia badanie replikacji wirusów w warunkach zbliżonych do in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Jamesowi P. Bridgesowi za dostarczenie istotnych wskazówek na temat metodologii hodowli komórek pierwotnych. Matthew J. Beucler otrzymał wsparcie od National Institutes of Health Training Grant T32-ES007250. Prace te były również wspierane przez granty National Institutes of Health R01-AI121028 i R21-DE026267 przyznane Williamowi E. Millerowi.

Te protokoły i badania zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie w Cincinnati (Federal-wide Assurance #00003152, IRB protocol 2016-4183). Tkanka ślinowa jest powszechnie wycinana w wielu zabiegach chirurgicznych głowy i szyi i zwykle nie jest zaangażowana w proces złośliwy. Zazwyczaj świeżo wyciętą tkankę gruczołu ślinowego wykorzystuje się w ciągu 2-4 godzin po usunięciu od pacjenta (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1A).
1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli (BEGM)
	<ol>
		<li>Dodaj komponenty z zestawu dostarczonego przez producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Umyj każdą probówkę raz za pomocą pożywki bazowej, aby zapewnić pełne przeniesienie składników. Następnie dodaj pozbawioną węgla węgla płodową surowicę bydlęcą, aby uzyskać końcowe stężenie 4% surowicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC)
	<ol>
		<li>Aby przygotować 10x bulion, dodaj 40,15 g NH4Cl, 5,0 g NaHCO3 i 0,186 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i doprowadź do końcowej objętości 200 ml za pomocą dH2O. Następnie przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przed użyciem rozcieńczyć do stężenia roboczego 1x w sterylnymdH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązanie do dysocjacji
	<ol>
		<li>Do 100 ml butelki z roztworem dypazy (patrz Tabela Materiałów) dodać 0,15 g kolagenazy typu III. Po całkowitym rozpuszczeniu kolagenazy przefiltrować wysterylizować nowy roztwór i podwielokrotność. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Trawienie tkanek
<ol>
	<li>Używając płytki do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm, mechanicznie rozdrobnij tkankę na drobne kawałki o wielkości ~1-2 mm za pomocą sterylizowanych w autoklawie nożyczek preparacyjnych i kleszczy chirurgicznych (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B, C). Tkanka łączna między kawałkami powinna zostać przecięta, aby zapewnić odpowiednią separację i łatwość w dalszych krokach.</li>
	<li>Dodać 6 ml roztworu dypazy/kolagenazy do tkanki mielonej. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez około 30 minut do 1 godziny.</li>
	<li>Przerwać tkankę, pipetując pipetą serologiczną o pojemności 5 ml 15-20 razy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 30 minut do 1 godziny.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.3 i 2.4 jeszcze dwa-trzy razy lub do momentu, gdy tkanka zacznie przypominać zawiesinę i będzie mogła łatwo przejść przez otwór pipety (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D). 
	nuta: Początkowy rozmiar próbki tkanki i stopień rozdrobnienia tkanki określą, ile razy należy powtórzyć kroki 2.3 i 2.4. Zazwyczaj otrzymujemy tkankę o wymiarach około 1 cm x 1 cm. Dodatkowo można monitorować dysocjację tkanek za pomocą standardowego mikroskopu do odwróconych kultur tkankowych, aby śledzić postęp dysocjacji komórek z tkanki. Małe skupiska komórek są idealne do początkowego wzrostu komórek ślinowych w postaci salkul.</li>
</ol>
3. Powlekanie studni matrycą membranową podstaw
UWAGA: Matryca membrany podstawnej (BMM) powinna być rozmrożona przez noc w temperaturze 4 °C na dzień przed jej użyciem. Po rozmrożeniu BMM powinien być stale przechowywany na lodzie lub w temperaturze 4 °C, ponieważ w wyższych temperaturach szybko zestala się (tj. tworzy żel). Ponadto należy zachować ostrożność, jeśli próbki zostały schłodzone na lodzie przed posiewem na BMM, ponieważ zimne próbki "stopią" BMM i wystawią komórki na działanie plastikowego naczynia.
<ol>
	<li>Powoli pipetować BMM (patrz Tabela Materiałów) do każdej studzienki, która ma być pokryta. Równomiernie i powoli rozprowadź BMM na studni. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, używamy 500 μl na każdy dołek płytki sześciodołkowej, ale objętość tę można dostosować do użycia na innych wariantach płytek, takich jak 12-dołkowe lub 24-dołkowe, lub w razie potrzeby dla grubszych lub cieńszych hydrożeli.</li>
	<li>Inkubować powlekane płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut przed użyciem, aby umożliwić BMM zestalenie się.</li>
</ol>
4. Filtrowanie niestrawionej tkanki, liza RBC i posiewanie komórek
<ol>
	<li>Przenieść homogenat tkankowy z etapu 2,5 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj płytkę raz 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w celu przeniesienia pozostałych komórek.</li>
	<li>Przefiltrować homogenat do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek z nylonowej siatki o średnicy 70 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę. Odcedzone komórki odwirowywać przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10x bufor do lizy RBC w sterylnym dH2O, aby uzyskać 1x roztwór roboczy.</li>
	<li>Odessać supernatant. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 10 ml 1x buforu do lizy RBC. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 20-25 ml DPBS, aby zneutralizować bufor do lizy RBC i zminimalizować lizę komórek śliny. Wirować przez 5 minut przy 500 x g. 
	UWAGA: Po leczeniu buforem do lizy RBC osad komórkowy powinien być biały. Czerwony kolor w granulkach oznacza, że nie wszystkie RBC zostały w pełni zmielone. W razie potrzeby powtórz kroki od 4.4 do 4.5, aby uzyskać całkowitą lizę wszystkich RBC.</li>
	<li>Odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad w 1-2 ml BEGM na studzienkę, a następnie umieścić zawieszone komórki w studzienkach pokrytych BMM. Inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po posianiu na BMM komórki uformują się w kuliste struktury lub "salisfery" w ciągu 2-3 dni. Komórki mogą być utrzymywane jako salisfery przez około 5-7 dni, zanim BMM zacznie ulegać degradacji, umożliwiając komórkom dostęp i przyleganie do plastiku i wzrost jako monowarstwa.</li>
</ol>
5. Hodowla salisfer i utrzymanie na BMM
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z dołków, następnie dodać 1 ml roztworu dypazy/kolagenazy do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~15 minut lub do momentu, gdy BMM w większości się rozpuści.</li>
	<li>Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przemyj studzienki raz DPBS, aby uzyskać pozostałe komórki. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant. Zawiesić osad w 2 ml trypsyny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą dowolnej kompletnej pożywki zawierającej 10% surowicy. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant. Ponownie zawieś komórki w DPBS, aby usunąć resztki pożywki, trypsynę i surowicę. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant. Ponownie zawiesić w BEGM i umieścić zawieszone komórki na zestalonych szalkach hodowlanych pokrytych BMM. Zawieszone komórki można również posiewać bezpośrednio na szalkach poddanych działaniu kultur komórkowych w celu proliferacji jako monowarstwa. Więcej informacji na temat wzrostu komórek ślinowych w postaci monowarstwowej, patrz punkt 6. Komórki wyhodowane na BMM lub na plastiku powinny być karmione świeżym BEGM co 2-3 dni.</li>
	<li>Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Hodowla salisfer na potraktowanych plastikowych naczyniach do hodowli tkanek
UWAGA: Jeśli utrzymujesz komórki jako monowarstwę na plastiku, zacznij od tego kroku. Poniższy protokół dotyczy komórek rosnących w naczyniu o średnicy 100 mm.
<ol>
	<li>Zassać media. Umyj raz DPBS, aby usunąć resztki mediów.</li>
	<li>Dodać 2 ml trypsyny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut lub do całkowitego odłączenia komórek.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą 4 ml dowolnej kompletnej pożywki zawierającej 10% surowicy. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umyć płytkę raz około 5 ml DPBS w celu zebrania pozostałych komórek. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant. Ponownie zawieś komórki w 6-10 ml DPBS, aby usunąć resztki pożywki.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić w BEGM. Umieść komórki na poddanych działaniu środka plastikowych szalkach do hodowli tkankowych. Karm świeżym BEGM co 2-3 dni.</li>
	<li>Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
7. Kriokonserwacja komórek
UWAGA: Kriokonserwacja komórek może być wykonana z pojedynczej zawiesiny komórkowej pochodzącej zarówno z komórek salisfery, jak i z komórek hodowanych jednowarstwowo.
<ol>
	<li>Policz komórki na hematocytometrze, aby obliczyć całkowitą ilość obecnych komórek.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant. Zawiesić osad w BEGM z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO). Koncentracja komórek powinna wynosić od 2 x 106 komórek/ml do 10 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Podwielokrotne komórki do sterylnych kriogenicznych probówek do przechowywania. Umieść probówki w izolowanym stojaku piankowym i inkubuj w temperaturze -80 °C przez noc, aby powoli zamrozić komórki.</li>
	<li>Następnego dnia umieść probówki w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Komórki należy szybko rozmrozić w temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu komórki należy granulować w ilości 500 x g, a pożywkę zawierającą DMSO usunąć przed posiewem.</li>
</ol>

<ol><li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands%2C+Part+1%3A+Anatomy%2C+Infectious%2C+and+Inflammatory+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Imaging+Science%22%5BJournal%5D)">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47(2018).</li>
<li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolmberg%2C+KV+%22Monographs+in+Oral+Science%22">Monographs in Oral Science</a>. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).</li>
<li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).</li>
<li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21(2018).</li>
<li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%3A+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Rheumatology.+Dis%22%5BJournal%5D)">Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li>
<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li>
<li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li>
<li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus%3A+epidemiology+and+infection+control%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li>
<li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li>
<li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+human+and+mouse+salivary+glands%3A+A+practice+guide+for+salivary+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li>
<li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells%3A+A+STR+analysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li>
<li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li>
<li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li>
<li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li>
<li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands%3A+Hyposalivation+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li>
<li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%3A+Differentiation+of+Salivary+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li>
<li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie podają nic do ujawnienia.

Dysfunkcja śliny stanowi problem dla jakości życia osób cierpiących na zespół Sjögrena, a także osób poddawanych radioterapii z powodu nowotworów sąsiadujących z gruczołami ślinowymi 3,4,5,16. Jedną z proponowanych terapii w leczeniu tych pacjentów jest hodowla funkcjonalnych komórek macierzystych śliny lub organoidów in vitro, które można następnie wprowadzić do uszkodzonego gruczołu ślinowego...

U ssaków gruczoły ślinowe są zorganizowane w 3 pary głównych gruczołów ślinowych: śliniankę, śliniankę podżuchwową i gruczoły podjęzykowe. Istnieje również szereg mniejszych gruczołów zlokalizowanych na języku i rozsianych po całej jamie ustnej1. Główne gruczoły są odpowiedzialne za dużą objętość produkowanej śliny2. Oprócz zapewnienia ochrony przeciwbakteryjnej poprzez wydzielane czynniki, ślina jest ważna w procesie żucia i smarowania pokarmu, gdy przechodzi przez przełyk2. W związku z tym dysfunkcja gruczołów ślinowych stanowi problem medyczny, w którym osoby cierpiące, które nie są w stanie wytworzyć wystarczającej ilości śliny, są bardziej podatne na rozwój chorób, takich jak ubytki w zębach lub kandydoza jamy ustnej3. Dodatkowo zmniejszona ilość śliny powoduje większe trudności w jedzeniu i trawieniu pokarmów, co ma znaczący wpływ na jakość życia.
Dysfunkcja gruczołów ślinowych występuje głównie u pacjentów cierpiących na zespół Sjögrena, chorobę autoimmunologiczną, lub u pacjentów z rakiem głowy i szyi, którzy przeszli radioterapię3,4,5,6. Uszkodzone acini wydzielnicze w obrębie gruczołów w wyniku autoimmunizacji lub radioterapii nie ulegają samoodnowie, co powoduje, że pacjent żyje z nieodwracalnymi uszkodzeniami6. Badania nad gruczołami ślinowymi również przyciągnęły uwagę badaczy zainteresowanych mechanizmami patogenezy wirusa. Niektóre patogeny, takie jak ludzki wirus cytomegalii (HCMV), uporczywie replikują się w gruczołach ślinowych, co następnie umożliwia przeniesienie powstającego wirusa do nowego gospodarza za pośrednictwem śliny7,8. W związku z tym istnieje niezaspokojona potrzeba opracowania solidnych i powtarzalnych modeli in vitro tkanki gruczołów ślinowych w celu rozwiązania i zrozumienia różnorodnych problemów medycznych.
Kilka modeli systemu mysich gruczołów ślinowych zostało wykorzystanych jako punkt wyjścia do zrozumienia i scharakteryzowania różnych komórek nabłonkowych, które tworzą gruczoły ślinowe9,10. Istnieją oczywiste i główne różnice między ludzkimi i mysimi gruczołami ślinowymi11. Przede wszystkim ludzka ślinianka przyuszna jest większa w stosunku do ślinianki podżuchwowej, podczas gdy mysz podżuchwowa i ślinianka przyuszna są znacznie podobne pod względem wielkości1,2,11. Chociaż istnieją unieśmiertelnione ludzkie linie komórkowe podżuchwowe, istnieją poważne obawy, że unieśmiertelnione komórki nie utrzymują dokładnie fenotypu pierwotnej tkanki i drugorzędne obawy, że unieśmiertelnione komórki nie pochodzą w rzeczywistości z samego nabłonka śliny12. Z tych powodów istnieje zainteresowanie i potrzeba zbadania pierwotnej tkanki ślinowej od ludzi.
Tutaj opisujemy protokół izolacji pierwotnych komórek nabłonkowych z ludzkich gruczołów ślinowych do hodowli tkankowej. Nasz protokół jest oparty na pracach Pringle'a i wsp. oraz Trana i wsp., z modyfikacjami wprowadzonymi w celu ogólnego uproszczenia ich procedur13,14. Po pierwsze, podczas gdy protokół Trana i wsp. wymaga długiej, pięciogodzinnej inkubacji w celu enzymatycznego trawienia tkanki ślinowej, nasz zmodyfikowany protokół okazał się skuteczny przy zaledwie jednogodzinnej inkubacji, podobnie jak w przypadku Pringle i wsp. Po drugie, używamy różnych enzymów do trawienia tkanek, w szczególności nie używamy trypsyny, jak to jest używane w oryginalnym protokole Tran i wsp., ale zamiast tego używamy mieszaniny dypazy i kolagenazy. Wolimy unikać trypsyny w początkowych etapach trawienia, ponieważ ostatnie badania sugerują, że początkowe trawienie tkanki ślinowej przez trypsynę powoduje zmniejszoną żywotność komórek, prawdopodobnie przez utratę rzadkiej populacji komórek macierzystych15. Na koniec hodujemy salisfery na powierzchni macierzy błony podstawnej (BMM) przy użyciu komercyjnie dostępnej pożywki pierwotnie opracowanej do namnażania komórek nabłonka oskrzeli. Nasz protokół może być stosowany do izolowania komórek śliny z ślinianek przyusznych, podżuchwowych i podjęzykowych. Komórki te wyrażają amylazę ślinową i inne geny specyficzne dla śliny, co wskazuje, że utrzymują fenotyp podobny do komórek nabłonka groniastego śliny7. Udało nam się wygenerować posiewy śliny z >50 pierwotnych próbek tkanek ludzkich przy użyciu tej metodologii. Co więcej, pierwotne komórki śliny można łatwo poddać krioprezerwacji do wykorzystania w późniejszym terminie.

<table><tbody><tr><td>Naczynia hodowlane 100 mm</td><td>Thermo Scientific 172931</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td><td>Lonza</td><td>CC-3171</td><td>Dodaj zestaw pocisków zgodnie z instrukcjami producenta. Uzupełnij 20 ml surowicy pozbawionej węgla drzewnego.</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 i mikro; m siatka nylonowa</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel pozbawiony płodowej surowicy bydlęcej</td><td>Gibco</td><td>12676-029</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu III</td><td>Worthington</td><td>LS004182</td><td>Przechowywać w 4 & st. C.</td></tr><tr><td>Rurka kriogeniczna</td><td>Fisher</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Zastosowania komórek</td><td>do dyspazy</td><td>07923</td><td>Rozpuść kolagenazę, aby uzyskać 0,15% (w/v) zapasu. Filtruj sterylizację, a następnie przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Corning</td><td>55-031-PC</td><td></td></tr><tr><td>General Chemicals</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PathClear Ekstrakt z błony podstawnej</td><td>Cultrex</td><td>3432-005-01</td><td>Rozmrozić w 4 & stopni; C co najmniej 24 godziny przed użyciem. Zawsze obchodź się z lodem.</td></tr><tr><td>Sześciodołkowe naczynia</td><td>hodowlane Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>Fisher</td><td>22-079-742</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Gruczoły ślinowe są miejscem o dużym zainteresowaniu badaczy zainteresowanych wieloma aspektami chorób ludzkich. Jednym z celów naukowców jest przywrócenie funkcji gruczołów uszkodzonych przez radioterapię lub z powodu patologii związanych z zespołem Sjögrena. Drugim celem naukowców jest zdefiniowanie mechanizmów, za pomocą których wirusy replikują się w tkance gruczołowej, gdzie mogą uzyskać dostęp do płynów ślinowych ważnych dla transmisji poziomej. Cele te podkreślają potrzebę solidnego i dostępnego modelu gruczołów ślinowych in vitro, który może być wykorzystany przez badaczy zainteresowanych wyżej wymienionymi, jak również pokrewnymi obszarami badawczymi. Tutaj omawiamy prosty protokół izolowania komórek nabłonkowych z ludzkich gruczołów ślinowych i rozmnażania ich in vitro. Nasz protokół może być dalej optymalizowany, aby sprostać potrzebom poszczególnych badań. Krótko mówiąc, tkanka ślinowa jest oddzielana mechanicznie i enzymatycznie w celu wyizolowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek. Selekcja komórek nabłonkowych odbywa się poprzez posiew na macierzy błony podstawnej w obecności pożywki zoptymalizowanej pod kątem wzrostu komórek nabłonkowych. Powstałe w ten sposób kultury mogą być utrzymywane jako trójwymiarowe skupiska, zwane "salisferami", lub hodowane jako monowarstwa na poddanych działaniu tworzywa sztucznego szalkach do hodowli tkankowych. Protokół ten powoduje wzrost niejednorodnej populacji głównie komórek nabłonkowych, które mogą być rozmnażane przez 5-8 pasaży (15-20 podwojeń populacji) przed przejściem starzenia komórkowego.

Dwa do trzech dni po wysianiu komórek z trawionej tkanki na BMM, komórki szybko zaczną tworzyć małe skupiska, które będą nadal zwiększać swój rozmiar, osiągając od 15 do 20 komórek na skupisko (Rysunek 2A). Zazwyczaj widoczne są resztki komórkowe oraz oddzielone martwe komórki, które należy usunąć poprzez aspirację i uzupełnienie świeżym medium. Komórki będą nadal proliferować w formie salisfer przez około 3-10 dni lub tak długo, jak warstwa BMM pozostanie ni...

Prezentujemy metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych. Komórki te wykazują wzorce ekspresji genów zgodne z tym, że pochodzą z nabłonka śliny i mogą być hodowane jako salisfery na matrycach błony podstawnej pochodzących z komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm lub jako monowarstwy na traktowanych szalkach hodowlanych.

Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Generowanie pierwotnych modeli komórkowych lub struktur podobnych do organoidów jest kluczem do odpowiedzi na wiele współczesnych pytań w biologii. Na przykład od dłuższego czasu interesują nas mechanizmy wykorzystywane przez ludzkie wirusy do ułatwiania replikacji w gruczole ślinowym, ponieważ jest to ważne miejsce transmisji poziomej. Rozwój systemu opartego na salisferze opisany w tym protokole jest kluczowym postępem w naszym dążeniu do odpowiedzi na tego typu pytania.Ta technika pozwala nam generować komórki pierwotne z wielu różnych próbek pobranych od pacjentów. Modele komórkowe bardziej przypominają sytuację typu in vivo, ponieważ komórki nie są modelowane ani przekształcane, jak wiele typów komórek powszechnie stosowanych w eksperymentach in vitro. Użyliśmy tego protokołu do wygenerowania podobnych komórek z pierwotnego gruczołu podżuchwowego myszy, a protokół byłby prawdopodobnie przydatny dla innych narządów o podobnych strukturach komórkowych.W ciągu dwóch do czterech godzin po wyjęciu od pacjenta, na płytce hodowlanej, użyj autoklawowanych, wysterylizowanych nożyczek preparacyjnych i kleszczy chirurgicznych, aby zmielić tkankę gruczołu ślinowego na drobne kawałki o wie

isolation-salivary-epithelial-cells-from-human-salivary-glands-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano zoptymalizowany protokół izolacji komórek macierzystych z gruczołu ślinowego myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne oraz umożliwia izolację salisfer zawierających komórki o charakterystyce komórek macierzystych.

Izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Ten film przedstawia protokół hodowli salisfer, trójwymiarowych sferoid pochodzących z gruczołów ślinowych. Ślikule mogą być dalej wykorzystywane do oceny wpływu raka głowy i szyi na produkcję śliny z gruczołów ślinowych dotkniętych chorobą pacjentów.

Hodowla salisfer z tkanki gruczołów ślinowych: metoda rozwoju salisfer z komórek nabłonka pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych

Opisano technikę genetycznego manipulowania komórkami nabłonkowymi w całych embrionalnych gruczołach podżuchwowych myszy (SMG) hodowanych ex vivo za pomocą transferu genów wirusowych. Metoda ta wykorzystuje wrodzoną zdolność nabłonka SMG i mezenchymy do spontanicznej rekombinacji po oddzieleniu i zakażeniu zaczątków nabłonka wektorami adenowirusowymi.

Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych

Wykorzystanie trójwymiarowych kultur organotypowych do wizualizacji morfologii i funkcjonalnych markerów gruczołów ślinowych może dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów uszkodzenia tkanek po promieniowaniu. Opisano tutaj protokół cięcia, hodowli, napromieniania, barwienia i obrazowania skrawków gruczołów ślinowych o grubości 50–90 μm przed i po ekspozycji na promieniowanie jonizujące.

Radioterapia kultur organotypowych z modeli gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych Kluczowe cechy in vivo

Gruczoł łzowy (LG) ma dwa typy komórek wyrażających aktynę α mięśni gładkich (αSMA): komórki mioepitelialne (MEC) i perycyty. MEC są pochodzenia ektodermalnego, znajdują się w wielu tkankach gruczołowych, podczas gdy perycyty to komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pochodzenia endodermalnego. Protokół ten izoluje MEC i perycyty od mysich LG.

Izolacja komórek mioepitelialnych z dorosłych mysich gruczołów łzowych i podżuchwowych

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka dziąseł poprzez dodanie inhibitora Rocka, Y-27632, do metody tradycyjnej. Metoda ta jest łatwiejsza, mniej czasochłonna, poprawia właściwości komórek macierzystych i wytwarza większą liczbę komórek nabłonkowych o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632

Mieszek włosowy zawiera populację nabłonków i komórki mezenchymalne. Populację nabłonka wybrano z niejednorodnej populacji komórek pęcherzyków zębowych poprzez zapewnienie odrębnej pożywki hodowlanej. Komórki nabłonkowe przetrwały i utworzyły kolonie w podłożu wolnym od surowicy.

Izolacja komórek nabłonkowych z ludzkiego pęcherzyka zębowego

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Naucz się izolować komórki nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych i hodować je jako ślikule lub monowarstwy. Ta metoda umożliwia badanie replikacji wirusów w warunkach zbliżonych do in vivo.

Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Przeglądaj więcej filmów