Name: Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modeli ksenoprzeszczepów PDX i pierwszorzędowych linii komórkowych z próbek raka żołądka u myszy NSG. Technika ta umożliwia dokładniejszą ocenę terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81572392); Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2016YFC1201704); Najwyższej klasy naukowe i techniczne innowacyjne talenty młodzieżowe w ramach specjalnego programu wsparcia Guangdong (2016TQ03R614).
Szczególnie dziękujemy Guangzhou Sagene Biotech Co., Ltd. za pomoc w przygotowaniu figur.

To badanie na ludziach zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Oceny Etyki Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, Chiny). Badanie na zwierzętach zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Sun Yat-sen. Uwaga: wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi, w tym z wytycznymi dotyczącymi ochrony przed narażeniem zawodowym przed patogenami przenoszonymi przez krew.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Pobrać tkanki raka żołądka (P0 = pasaż 0) bezpośrednio z operacji. Próbka guza powinna być większa niż 0,5 cm3.</li>
	<li>Przygotuj 3-4 ml roztworu podstawowego: na przykład pożywkę RPMI-1640 (1x) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Umieścić świeżą próbkę guza w roztworze podstawowym w temperaturze 4 °C na nie dłużej niż 4 godziny.</li>
</ol>
2. Ustanowienie modelu PDX (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Aby zapewnić sterylne pole operacyjne, należy dezynfekować wszystkie materiały światłem ultrafioletowym przez ponad 30 minut przed przeniesieniem do laboratorium dla zwierząt. 
	Uwaga: salę operacyjną należy zdezynfekować światłem ultrafioletowym przez 30 minut, zanim wyczyścimy biurko środkiem dezynfekującym supozytoria kwasu dichloroizocyjanurowego. Następnie powidon-jod jest używany do dezynfekcji skóry.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek ostrożnie wypreparuj tkanki nowotworowe i przytnij je na kilka małych kawałków (około 1 mm3 kostki) w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Znieczulenie samic myszy NOD-SCID-IL2rg (NSG) w wieku od 5 do 7 tygodni przez wystawienie na działanie 1-1,5% izofluranu za pomocą aparatu do znieczulenia.
	<ol>
		<li>Znieczulaj mysz, aż przestanie się szarpać, ale utrzyma równomierny oddech. 
		UWAGA: Probówka o pojemności 50 ml to prosty sprzęt, który działa podobnie do aparatu do znieczulenia. Stosowanie weterynaryjnej maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu, nie jest konieczne ze względu na krótki czas działania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj 1 cm nacięcie na obu bokach grzbietu za pomocą sterylnych nożyczek i wszczep jeden kawałek guza w każdy bok myszy.
	<ol>
		<li>Aby upewnić się, że kawałek guza nie wysunie się, użyj sterylnych kleszczy, aby rozbić tkankę podskórną. Następnie przytnij kawałek tkanki nowotworowej i umieść go w głębokim miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij obszar implantu szwem podskórnym za pomocą igieł chirurgicznych do szwów i oznacz uszy myszy oznaczonymi kolczykami</li>
	<li>Wysterylizuj ranę jodem.</li>
	<li>Po operacji delikatnie umieść myszy w pustej klatce, zachowując leżącą mostek. Zwróć szczególną uwagę na stan myszy; Budzą się i zaczynają chodzić około 3-4 minuty później. Umieść myszy, które przeszły operację, w innej nowej klatce, oddzielone od tych, które nie zostały poddane operacji.</li>
	<li>Oceń wielkość guza za pomocą badania palpacyjnego miejsca implantacji. Mierz guzy suwmiarką z noniuszem dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Gdy guz osiągnie średnicę 10 mm, stan zwierzęcia pogarsza się lub guz owrzodzenia, należy poddać mysz eutanazji metodą zatwierdzoną przez IRB. Reimplantacja pobranych świeżych fragmentów guza do 2 nowych myszy w celu pasażowania lub tymczasowe przechowywanie próbek w PBS na lodzie w celu wyizolowania pierwotnych linii komórkowych.</li>
</ol>
3. Kriokonserwacja tkanek
UWAGA: Ta część odnosi się głównie do metod stosowanych w zestawie Cryo Kit do żywych tkanek. Główne zestawy i wyposażenie są wymienione w Tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji metodą zatwierdzoną przez IRB, gdy guz ma średnicę większą niż 10 mm.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek powoli izoluj guz od myszy.</li>
	<li>Umyj tkanki nowotworowe za pomocą DPBS w naczyniu o średnicy 10 cm. Wypreparuj i usuń martwicze obszary, tkankę tłuszczową, skrzepy krwi i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek.</li>
	<li>Wytnij tkanki nowotworowe do maksymalnej grubości 1 mm za pomocą formy.</li>
	<li>Umyj plastry z DPBS w naczyniu o średnicy 10 cm. 
	UWAGA: Proces witryfikacji polega na użyciu probówek oznaczonych V1/V2/V3 w krokach 3.6-3.8. Głównymi składnikami są DMSO i sacharoza.</li>
	<li>Przenieść plastry do probówki V1 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zwinąć i krótko odwrócić probówkę, a następnie umieścić ją w temperaturze 4 °C na kolejne 4 minuty.</li>
	<li>Wlej roztwór V1 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm. Przenieść plastry do probówki V2 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę V2 w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zwiń i odwróć rurkę na krótko, a następnie umieść ją w temperaturze 4 °C na kolejne 4 minuty.</li>
	<li>Wlej roztwór V2 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm. Przenieść plastry do probówki V3 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zwinąć i krótko odwrócić probówkę i umieścić ją w temperaturze 4 °C na co najmniej 5 minut. Upewnij się, że wszystkie plastry opadają na dno tuby.
	<ol>
		<li>Jeżeli kilka plasterków pozostaje na wodzie, zwinąć i na krótko odwrócić rurkę, a następnie ponownie umieścić probówkę w temperaturze 4 °C, aż wszystkie plastry całkowicie opadną; jeśli to konieczne, wyrzucić pływające plastry</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Wlej roztwór V3 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Przytnij uchwyty na chusteczki do odpowiedniej długości i umieść je na sterylnej gazie. Przełóż plastry na uchwyty. Owiń uchwyty gazą i umieść je w ciekłym azocie za pomocą kleszczy, a następnie inkubuj przez 5 minut.</li>
	<li>Oznacz fiolki kriogeniczne informacjami o tkankach.</li>
	<li>Przenieś posiadacze z plastrami tkanek do fiolek kriogenicznych, które są przechowywane w ciekłym azocie.</li>
</ol>
4. Izolacja komórek pierwotnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Sterylizować kleszcze i nożyczki parą pod wysokim ciśnieniem w temperaturze 121 °C przez 30 min.</li>
	<li>Wyciąć próbki raka żołądka z wyciętych próbek lub pobranych tkanek PDX. Umieść tkanki na lodzie, a następnie przenieś je do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Wypreparuj i usuń martwicze obszary, tkankę tłuszczową, skrzepy krwi i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek.</li>
	<li>Umyj tkanki nowotworowe raz DPBS zawierającym 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny w naczyniu o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Pokrój tkankę nowotworową na 1 mm3 kawałki na pokrywie naczynia; maksymalna grubość każdego kawałka powinna wynosić 1 mm.</li>
	<li>Przenieść tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z około 7 ml roztworu kolagenazy typu 1 i trypsyny (1:14). Krótko zmieszaj mieszaninę.</li>
	<li>Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30-40 minut. Mieszać mieszaninę co 5 minut.</li>
	<li>Dodaj równą objętość pożywki RPMI-1640 (1x) uzupełnionej o 10% FBS do probówki. Dokładnie wymieszaj mieszaninę.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml przez powolną filtrację przez filtr 40 μm. 
	UWAGA: Użyj filtrów 40 μm, aby zapewnić wyższy stosunek komórek rakowych. W razie potrzeby można zastosować filtry 100 μm do zachowania większej liczby typów komórek, takich jak komórki immunologiczne.</li>
	<li>Odwirować filtraty przy 113-163 x g przez 5-7 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad 5 ml PBS i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Jeśli osad jest czerwony, zawiera wiele erytrocytów. Delikatnie zawiesić osad z 500 μl buforu do lizy czerwonych krwinek. Po 5 minutach inkubacji dodać 5 ml PBS i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad z pożywką hodowlaną i przenieść mieszaninę do sterylnego naczynia o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Zastąp pożywkę pożywką zawierającą surowicę co 2-3 dni.</li>
	<li>Przejdź przez komórki pierwotne za pomocą trypsyny/EDTA, gdy osiągną 50% konfluencji.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Ca-a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Sugano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+gastric+cancer+in+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practive+%26+Research+in+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening of gastric cancer in Asia.</a> Best Practive & Research in Clinical Gastroenterology. 29 (6), 895-905 (2015).</li>
<li>Nikfarjam, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demographic+survey+of+four+thousand+patients+with+10+common+cancers+in+North+Eastern+Iran+over+the+past+three+decades%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+Journal+of+Cancer+Prevention%22%5BJournal%5D)">Demographic survey of four thousand patients with 10 common cancers in North Eastern Iran over the past three decades.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (23), 10193-10198 (2014).</li>
<li>Coccolini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+gastric+cancer%3A+What+we+know+and+what+we+still+have+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Advanced gastric cancer: What we know and what we still have to learn.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (3), 1139-1159 (2016).</li>
<li>Goetze, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+treatment+in+locally+advanced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Updates+in+Surgery%22%5BJournal%5D)">Multimodal treatment in locally advanced gastric cancer.</a> Updates in Surgery. 70 (2), 173-179 (2018).</li>
<li>Graziosi, L., Marino, E., Donini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+Treatment+of+Locally+Advanced+Gastric+Cancer%3A+Will+the+West+Meet+the+East%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multimodal Treatment of Locally Advanced Gastric Cancer: Will the West Meet the East?</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (3), 918(2019).</li>
<li>Choi, Y. Y., Noh, S. H., Cheong, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Gastric+Cancer+Treatment%3A+From+the+Golden+Age+of+Surgery+to+an+Era+of+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Evolution of Gastric Cancer Treatment: From the Golden Age of Surgery to an Era of Precision Medicine.</a> Yonsei Medical Journal. 56 (5), 1177-1185 (2015).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCGA+divides+gastric+cancer+into+four+molecular+subtypes%3A+implications+for+individualized+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TCGA divides gastric cancer into four molecular subtypes: implications for individualized therapeutics.</a> Chinese Journal of Cancer Research. 33 (10), 469-470 (2014).</li>
<li>Tirino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+New+in+Gastric+Cancer%3A+The+Therapeutic+Implications+of+Molecular+Classifications+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">What's New in Gastric Cancer: The Therapeutic Implications of Molecular Classifications and Future Perspectives.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li>
<li>Roschke, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotypic+complexity+of+the+NCI-60+drug-screening+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Karyotypic complexity of the NCI-60 drug-screening panel.</a> Cancer Research. 63 (24), 8634-8647 (2003).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+mouse+models%3A+A+high+fidelity+tool+for+individualized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft mouse models: A high fidelity tool for individualized medicine.</a> Oncology Letters. 17 (1), 3-10 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspectives+of+patient-derived+xenograft+models+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+OF+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Current status and perspectives of patient-derived xenograft models in cancer research.</a> Journal OF Hematology & Oncology. 10 (1), 106(2017).</li>
<li>Kawaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Update+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Translational+Breast+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Current Update of Patient-Derived Xenograft Model for Translational Breast Cancer Research.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 131-139 (2017).</li>
<li>Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+Tumor+Heterogeneity+in+Patient-Derived+Tumor+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts.</a> Cancer Research. 75 (15), 2963-2968 (2015).</li>
<li>Liu, X., Meltzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Cancer+in+the+Era+of+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Gastric Cancer in the Era of Precision Medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (3), 348-358 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShultz%2C+LD+%22Human+cancer+growth+and+therapy+in+immunodeficient+mouse+models%22">Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models</a>. (7), Cold Spring Harbor. 694-708 (2014).</li>
<li>McDermott, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+cord+blood+engraftment+between+immunocompromised+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains.</a> Blood. 116 (2), 193-200 (2010).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2Fgamma+%28c%29+%28null%29+mouse%3A+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/gamma (c) (null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+human+hematopoietic+stem+cells+and+human+breast+cancer+cells+in+NSG+mice%3A+a+novel+approach+to+generate+tumor+cell+specific+human+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of human hematopoietic stem cells and human breast cancer cells in NSG mice: a novel approach to generate tumor cell specific human antibodies.</a> MAbs. 6 (4), 968-977 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rak żołądka jest agresywną chorobą o ograniczonych możliwościach terapeutycznych; W ten sposób modele raka żołądka stały się kluczowym zasobem umożliwiającym funkcjonalne badania naukowe z bezpośrednim przełożeniem na praktykę kliniczną 4,8,17. W tym miejscu opisaliśmy metody i protokół tworzenia modeli PDX raka żołądka i pierwotnych linii komórkowych. Co ważne, zarówno cechy morfologiczne, jak i biologiczne wycinków raka żołądk...

Rak żołądka jest piątym najczęściej występującym nowotworem na świecie i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka. W 2018 roku na całym świecie zdiagnozowano ponad 1 000 000 nowych przypadków raka żołądka, a szacuje się, że 783 000 osób zostało zabitych przez tę chorobę1. Zachorowalność i śmiertelność z powodu raka żołądka pozostają bardzo wysokie w krajach Azji Północno-Wschodniej2,3. Pomimo znacznego postępu w dziedzinie terapii przeciwnowotworowych, rokowania pacjentów z zaawansowanym rakiem żołądka pozostają złe, a pięcioletni wskaźnik przeżycia wynosi około 25%4,5,6,7,. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych strategii terapeutycznych w raku żołądka
Leczenie raka żołądka jest wyzwaniem ze względu na jego wysoką heterogeniczność8,9. Tak więc, pytanie o to, jak poradzić sobie z wyzwaniami związanymi z heterogenicznością nowotworów, aby realizować medycynę precyzyjną, jest kluczowe dla badań nad rakiem. Modele in vitro i in vivo odgrywają kluczową rolę w wyjaśnianiu heterogenicznych mechanizmów i biologii raka żołądka. Jednakże, chociaż istnieje wiele linii komórkowych raka żołądka i wiele konwencjonalnych transgenicznych modeli myszy do badań przedklinicznych, wady tych modeli ograniczają ich zastosowania10. Ponieważ cechy tych modeli zmieniły się w kulturze, nie modelują one już heterogeniczności guza, a ich odpowiedzi nie były w stanie przewidzieć reakcji u ludzi11. Kwestie te poważnie ograniczają możliwość identyfikacji podgrup pacjentów onkologicznych, które zareagują na leki celowane. Krótkoterminowa hodowla guzów pierwotnych zapewnia stosunkowo szybki i spersonalizowany sposób badania przeciwnowotworowych właściwości farmakologicznych, które prawdopodobnie będą znakiem rozpoznawczym spersonalizowanego leczenia raka.
Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) są preferowane jako alternatywny model przedkliniczny do profilowania odpowiedzi na leki12. Ponadto modele PDX oferują potężne narzędzie do badania inicjacji i progresji raka13,14. Modele PDX zachowują histologiczny wygląd komórek nowotworowych, zachowują heterogeniczność wewnątrznowotworową i lepiej odzwierciedlają istotne ludzkie składniki mikrośrodowiska guza15,16. Jednak ograniczeniem szeroko stosowanych modeli PDX jest niski wskaźnik sukcesu w tworzeniu i seryjnym rozmnażaniu ludzkich guzów litych. W tym badaniu opisano przyzwoicie skuteczne metody tworzenia modeli PDX i pierwotnych linii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Biologix, Shandong, Chiny</td><td>15-1040</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop biologiczny</td><td>OLYMPUS, Tokio, Japonia</td><td>Wirówka OLYMPUS CKX41</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Mittelsachsen, Niemcy.</td>Inkubator CO2 <td>5427R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA</td><td>HERACELL 150i</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Basalmedia Technology, Szanghaj, Chiny</td><td>L40601</td><td></td></tr><tr><td>Elektrotermostatyczna szafka na wodę</td><td>Yiheng, Szanghaj, Chiny</td><td>DK-8AXX</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Biotechnologia żubrów, Vancouver, Kanada</td><td>86150040</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter, Chiny</td><td>CN2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw żywych tkanek Zestaw kriogeniczny</td><td>Celliver Biotechnology, Szanghaj, Chiny</td><td>LT2601</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do rozmrażania żywych tkanek</td><td>Celliver Biotechnology, Szanghaj, Chiny</td><td>LT2602</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>Biocytogen, Pekin, Chiny</td><td>B-CM-002-4-5W</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin& streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA</td><td>8118367</td><td></td></tr><tr><td>Igły do szwów chirurgicznych z gwintem</td><td>LingQiao, Ningbo, Chiny</td><td>3/8 łuku 4 razy; 10</td><td></td></tr><tr><td>Formy i ostrza pomocnicze przetworzone tkankowo</td><td>Celliver Biotechnology, Szanghaj, Chiny</td><td>LT2603</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA</td><td>2003779</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 1</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA</td><td>17100017</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Wykorzystanie modeli przedklinicznych do poszerzenia naszego zrozumienia biologii nowotworów i zbadania skuteczności środków terapeutycznych jest kluczowe dla badań nad rakiem. Chociaż istnieje wiele uznanych linii komórkowych raka żołądka i wiele konwencjonalnych transgenicznych modeli myszy do badań przedklinicznych, wady tych modeli in vitro i in vivo ograniczają ich zastosowania. Ponieważ cechy tych modeli zmieniły się w kulturze, nie modelują one już heterogeniczności guza, a ich odpowiedzi nie były w stanie przewidzieć reakcji u ludzi. W związku z tym opracowywane są alternatywne modele, które lepiej reprezentują heterogeniczność guza. Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) zachowują histologiczny wygląd komórek nowotworowych, zachowują niejednorodność wewnątrznowotworową i lepiej odzwierciedlają istotne ludzkie składniki mikrośrodowiska guza. Jednak opracowanie modelu PDX zajmuje zwykle 4-8 miesięcy, co jest czasem dłuższym niż oczekiwane przeżycie wielu pacjentów z żołądkiem. Z tego powodu ustalenie pierwotnych linii komórek nowotworowych może być skuteczną metodą uzupełniającą badania odpowiedzi na leki. Obecny protokół opisuje metody ustalania modeli PDX i pierwotnych linii komórek rakowych na podstawie próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań nad biologią nowotworów.

W tym przypadku tkanki nowotworowe pobrane podczas operacji przechowywano w roztworze zapasowym do momentu wykonania kolejnego kroku. W ciągu 4 godzin tkanki nowotworowe pocięto na małe fragmenty i wszczepiono w okolice grzbietowe myszy NSG, które znieczulono za pomocą waty nasączonej izofluranem. Guzy o objętości przekraczającej 1 cm3 można było wyciąć w celu wszczepienia nowym myszom (Rycina 1) lub ostrożnie pokroić i przechować w ciekłym azocie zgodnie z protokołem. W niniejszy...

Obecny protokół opisuje metody tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych linii komórek rakowych z próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań w zakresie biologii nowotworów.

Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Modele ksenoprzeszczepów i pierwotne linie komórkowe pochodzące od pacjentów stają się integralną częścią opracowywania leków oraz inicjowania i postępu badań nad biologią nowotworów. Modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów zachowują histologiczny wygląd komórek nowotworowych, zachowują niejednorodność wewnątrznowotworową i lepiej odzwierciedlają istotne ludzkie składniki mikrośrodowiska guza. Jego modele służą do dokładniejszego odwzorowania ludzkiego raka niż tradycyjne linie komórek nowotworowych i mają potencjał, aby poprawić ocenę przedkliniczną nowych terapii przeciwnowotworowych.Ponadto modele te mogą być przydatne w porównywaniu cech molekularnych lub sygnatur nowotworowych między różnymi podgrupami pacjentów z rakiem. Myszy NSG są zalecane jako model myszy z niedoborem odporności. Ze względu na ciężki niedobór odporności myszy we wszystkich eksperymentach należy zachować bezpłodność.W sterylnych warunkach użyj kleszczy i nożyczek, aby dokładnie wypreparować tkanki nowotworowe i przyciąć je na kilka małych kawałków. Po znieczuleniu myszy użyj sterylnych nożyczek, aby wykonać jednocentymetrowe nacięcie na obu bokach grzbietu. Użyj sterylnych kleszczy, aby rozbić tka

establishment-gastric-cancer-patient-derived-xenograft-models-primary

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje protokół generowania przerzutów przez organoidy CRC pochodzące z PDX, znakowane lentiwirusem GFP, do śledziony myszy z niedoborem odporności. Mikroprzerzuty nowotworowe kolonizujące inne narządy można wykryć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu oceny ekspresji GFP.

Ustalanie eksperymentalnego modelu mysiego przerzutów: wszczepianie komórek organoidowych CRC z ekspresją GFP w modelu PDX w celu wykrycia mikroprzerzutów

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Tutaj opisujemy protokół tworzenia i hodowli trójwymiarowych (3D) organoidów żołądkowych pochodzących od ludzi i myszy oraz metodę transferu organoidów 3D do jednowarstwowej 2-wymiarowej. Opisano również zastosowanie monowarstwy nabłonka żołądka jako nowatorskiego testu na ranę drapaną do badań nad regeneracją.

Pierwotna jednowarstwowa hodowla nabłonka żołądka pochodząca od myszy i człowieka do badania regeneracji

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Opisano metodę tworzenia organoidów przy użyciu ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) do badań przesiewowych in vitro, co daje dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Guzy PDX zostały zebrane/przetworzone na małe kawałki mechanicznie lub enzymatycznie, a następnie metodą Cleversa do wyhodowania organoidów nowotworowych, które zostały pasażowane, kriokonserwowane i scharakteryzowane w stosunku do oryginalnego PDX.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.

Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

Obecny protokół ustanawia i charakteryzuje model ksenoprzeszczepu (PDX) anaplastycznego raka tarczycy (ATC) oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) pochodzącego od pacjenta, ponieważ modele PDX szybko stają się standardem w dziedzinie onkologii translacyjnej.

Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów

Ten protokół opisuje ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności. Model podsumowuje zaawansowany rak jelita grubego, chorobę z przerzutami i pozwala na ocenę nowych leków terapeutycznych w klinicznie istotnym scenariuszu przerzutów do płuc i wątroby.

Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Organoidy pochodzące od pacjentów żołądkowych znajdują coraz większe zastosowanie w badaniach, jednak brakuje formalnych protokołów do generowania ludzkich organoidów żołądkowych z jednokomórkowych trawień o standaryzowanej gęstości wysiewu. W protokole przedstawiono szczegółową metodę wiarygodnego tworzenia organoidów żołądka z tkanki biopsyjnej uzyskanej podczas endoskopii górnego odcinka kręgosłupa.

Ustalenie i charakterystyka organoidów żołądkowych pochodzących od pacjenta z biopsji łagodnego ciała żołądka i nabłonka antralnego

Poniższy protokół skupia się na ustanowieniu pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich (STS) pochodzącego od pacjenta. Model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć podłoże molekularne i profil farmakologiczny tych rzadkich nowotworów złośliwych i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu poprawę leczenia STS.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Poznaj metodę tworzenia modeli ksenoprzeszczepów PDX i pierwszorzędowych linii komórkowych z próbek raka żołądka u myszy NSG. Technika ta umożliwia dokładniejszą ocenę terapii przeciwnowotworowych.

Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Przeglądaj więcej filmów