Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Protokół ten jest istotny, ponieważ koncentruje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, EV, poprzez połączenie technologii, umożliwiając jednocześnie oddzielenie wirionów od EV. Metoda ta maksymalizuje odzysk EV powyżej obecnego złotego standardu ultrawirowania w celu wielokrotnej dalszej analizy i charakterystyki preparatów EV wolnych od wirusów. Protokół ten jest idealny do badania EV i infekcji wirusowych.

Ta metoda może być dostosowana do innych systemów wirusowych, takich jak HTLV, Ebola, Zika i inne. Spodziewałbym się, że osoba po raz pierwszy korzystająca z tej metody będzie miała problemy z przygotowaniem nanocząstek, dlatego zalecamy uważne przestrzeganie naszych specyfikacji. W zależności od systemu może być konieczna pewna optymalizacja.

Wizualna demonstracja tej metody jest ważna dla zilustrowania ogólnego przepływu pracy i niuansów protokołu, co skróci czas i zmniejszy liczbę błędów dla początkujących użytkowników. Zacznij od przygotowania supernatantu hodowli z zakażonych lub transfekowanych komórek. Hoduj około 10 mililitrów późnych komórek logarytmicznych przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, upewniając się, że wszystkie odczynniki podłoża są wolne od pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Gdy kultura jest gotowa, zagnieździć komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 razy G przez pięć minut i wyrzucić osad. Przefiltrować supernatant sterylnym filtrem 0,22 mikrometra i zebrać filtrat do czystej probówki. Dodać równą objętość odczynników wytrącających PEG do filtratu i kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu wymieszania.

Inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji odwirować mieszaninę w temperaturze 1500 razy G przez 30 minut, aby uzyskać niejednorodny pęcherzyk zewnątrzkomórkowy lub osad EV. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 150 do 300 mikrolitrach 1X PBS, bez wapnia i magnezu.

Trzymaj pelety na lodzie, przygotowując gradient gęstości. Przygotować pożywkę o gradiencie gęstości jodiksanolu z 11 frakcjami gęstości, w zakresie od sześciu do 18% jodiksanolu, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wymieszaj każdą probówkę przez wirowanie i ułóż warstwy frakcji gęstości w czystej i suchej ultrawirówce z wahadłowym wiadrem.

Dodaj ponownie zawieszony granulat EV na wierzch warstwowego gradientu i ultraodwiruj probówkę przy 10 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 90 minut. Ostrożnie przenieś każdą frakcję z probówki ultrawirówkowej do nowej probówki do mikrowirówki. Przygotuj 30% zawiesinę nanocząstek do wzbogacenia frakcji EV, mieszając równe objętości NT80, NT82 i 1X-PBS.

Wirować mieszaninę nanocząstek, aby zapewnić jednorodność. Dodać 30 mikrolitrów zawiesiny do każdej frakcji gęstości i wymieszać, pipetując lub odwracając probówki. Najbardziej krytycznym etapem jest dodanie nanoartykułów w celu zagęszczenia EV, po rozdzieleniu w gradinie gęstości.

Bez tego odzysk pojazdów elektrycznych jest słaby. Obracaj nanocząstkę zawierającą frakcje gęstości przez noc, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować frakcje gęstości w temperaturze 20 000 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Wylej płyn i umyj granulat EV dwukrotnie 1X-PBS. Aby przygotować osad do izolacji RNA, należy go ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach autoklawowanej, dejonizowanej wody, przefiltrowanej i potraktowanej depsy, zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. RNA można następnie wyizolować za pomocą komercyjnego zestawu.

Do analizy za pomocą elektroforezy żelowej ponownie zawiesić osad w 15 mikrolitrach buforu Laemmli. Podgrzej próbkę do 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Powtórz etap ogrzewania jeszcze dwa razy, delikatnie wirując i obracając próbkę w dół między cyklami ogrzewania.

Odwirować próbkę przez 15 sekund w temperaturze 20 000 razy G i załadować supernatant bezpośrednio do żelu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, ogranicz ilość cząstek załadowanych do żelu i uruchom go pod napięciem 100 woltów, aby zapobiec przedostawaniu się załadowanych nanocząstek do żelu. Wytrącanie PEG pozwala na znacznie bardziej efektywny odzysk pojazdów elektrycznych niż tradycyjne ultrawirowanie.

Przy użyciu 10 mililitrów kultury takie podejście daje około 500-krotnie wyższą wydajność niż ultrawirowanie. Takie podejście skutkuje również zwiększoną skutecznością izolacji egzosomów, co jest widoczne w wyższych poziomach białek markerowych egzosomów. Analiza Western PLA pokazuje 3000-krotny wzrost CD81, czterokrotny wzrost CD63 i 40-krotny wzrost CD9.

Co więcej, protokół ten pozwala na dalsze badania mechanizmów infekcji HIV1 za pośrednictwem EV, poprzez izolację EV od wersji. Analiza Western PLA pokazuje, że EV znajdują się w trzech populacjach frakcji. Podczas gdy wirus jest obecny tylko w dwóch z nich.

Wykroczenia EV od 10.8 do 12 są wolne od infekcji wirusowej. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że nanocząsteczki mają kluczowe znaczenie dla optymalnego wzbogacenia pojazdów elektrycznych. Ich dodatek jest koniecznością.

Można przeprowadzić wiele dalszych testów, takich jak western blot, PCR, czysta analiza diomecha za pomocą spektrometrii mas w testach komórkowych na płytkach. Pozwalają one na charakterystykę, badania mechanistyczne i/lub funkcjonalne. Technika ta pozwala na przeprowadzenie konkretnych badań, które badają ładunek i funkcjonalność pojazdów elektrycznych bez zanieczyszczania tła wirusowego.

Stanowi to podstawę do badania EV w patogenezie i opracowywania potencjalnych środków terapeutycznych. Aby przezwyciężyć ograniczenia tej techniki oraz zastosować przygotowanie i izolację EV do dużych objętości, zalecamy stosowanie zaawansowanych systemów, takich jak filtracja z przepływem stycznym. Najbardziej niebezpiecznym instrumentem do użycia jest ultrawirówka podczas separacji w gradieniu gęstości.

Upewnij się, że wszystkie probówki wirówkowe ważą tyle samo, aby uniknąć niewyważenia i potencjalnej awarii wirnika.