Name: Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Poznaj metodę przesiewowego badania inhibitorów kinaz przy użyciu mikromacierzy białkowych NAPPA. Ta technika umożliwia analizę aktywności kinaz ludzkich i ich mutacji klinicznych w wysokiej przepustowości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim w laboratorium LaBaera za pomoc i krytykę podczas rozwoju projektu. Projekt ten był wspierany przez U01CA117374 grantowe NIH, U01AI077883 i Fundację Virginii G. Piper.

<ol><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li>
<li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li>
<li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacological+Sciencies%22%5BJournal%5D)">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li>
<li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571%2C+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li>
<li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+frontline+treatment+and+long-term+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+Anticancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li>
<li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinions+in+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li>
<li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li>
<li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li>
<li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prevention%22%5BJournal%5D)">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li>
<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li>
<li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li>
<li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28click+chemistry%29-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li>
<li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li>
<li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li>
<li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li>
<li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNASU+plasmid+and+PSI%3ABiology-Materials+repositories%3A+resources+to+accelerate+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów Podczas fazy optymalizacji badania aktywności kinaz na matrycach NAPPA, jednym z głównych źródeł zaobserwowanego tła i niskiego zakresu dynamiki był BSA zastosowany w mieszance drukarskiej. BSA dostarczało pierwszorzędowe aminy niezbędne do sieciowania z powierzchnią aminozelanu i na miejscu wychwytywało DNA i przeciwciało wychwytujące. Jednak BSA jest silnie ufosforylowany, co utrudnia wykrycie sygnału autofosforylacji na tablicy powyżej szumu tła. Aby rozwiązać ten problem, przetestowano kilka alternatyw dla BSA w mieszance drukarskiej i zidentyfikowano polilizynę jako dobry substytut. Polilizyna nie ma żadnego miejsca fosforylacji; W związku z tym tło z tablic niewyrażonych jest bardzo minimalne. Co więcej, mikromacierze wydrukowane za pomocą polilizyny są powtarzalne i wykazują dobry poziom białek (ryc. 2).
Kolejną krytyczną modyfikacją przeprowadzoną w standardowym teście NAPPA było dodanie etapu leczenia fosfatazą/DNazą. Traktowanie mikromacierzy fosfatazą pozwala na usunięcie fosforylacji, która wystąpiła w mieszaninie IVTT podczas syntezy i wychwytywania białek (ryc. 3). Źródłem tej fosforylacji może być wewnętrzna aktywność autofosforylacji lub aktywność kinaz obecnych w mieszaninie IVTT. Usunięcie całej fosforylacji po ekspresji umożliwiło łatwą identyfikację kinaz, które są aktywne i mogą ulegać autofosforylacji (ryc. 3).
Krytyczne kroki w ramach protokołu NAPPA to solidna technologia, ale zgodnie z oczekiwaniami istnieje kilka krytycznych kroków. Pierwszym z nich jest pozyskanie wysokiej jakości DNA w odpowiednim stężeniu. Użycie DNA o niskiej jakości lub w niskich stężeniach spowoduje wygenerowanie niskiej jakości mikromacierzy z kilkoma cechami, które nie są wyrażane i wyświetlane na odpowiednich poziomach, zmniejszając liczbę analizowanych białek w macierzy. Drugim krytycznym krokiem jest ekspresja białek w mikromacierzy. Zastosowanie systemu IVTT, który będzie wyrażał wysoki poziom funkcjonalnego białka, jest niezbędne do badania aktywności kinazy w macierzy.
Kolejnym krytycznym krokiem w procesie przesiewowym TKI jest sposób postępowania z mikromacierzami. Mikromacierze nie powinny wysychać na żadnym etapie protokołu i zaleca się delikatne obchodzenie się z nimi, aby zapobiec zadrapaniom, które mogą zwiększyć sygnał tła. Ponieważ tablice z całego eksperymentu zostaną porównane ze sobą, ważne jest, aby upewnić się, że każdy etap inkubacji jest równy na wszystkich szkiełkach. Na przykład czas wymagany do wykonania jednego kroku w pojedynczej macierzy powinien być brany pod uwagę, gdy przetwarzana jest partia 20 tablic, aby zapobiec różnicom w długości inkubacji między macierzami.
Wreszcie, projekt eksperymentu i włączenie zarówno kontroli pozytywnych, jak i ujemnych ma kluczowe znaczenie dla kontroli jakości i analizy danych. Pierwszy zestaw kontroli to te wydrukowane w każdej tablicy i obejmuje kontrole ujemne [tj. puste miejsca (bez wydrukowanego materiału), wodę lub pusty wektor (wyrażają tylko znacznik)], a także kontrolę pozytywną (tj. oczyszczoną IgG, która jest wykrywana przez przeciwciało drugorzędowe i jest obojętna na zmiany poziomów fosforylacji). Łącznie mierzą one poziomy tła mikromacierzy, możliwe przeniesienie podczas drukowania oraz intensywność sygnału metody detekcji.
Kolejnym zestawem kontroli są kontrole przesiewowe leków i obejmują odfosforylowane i autofosforylowane mikromacierze (w obecności lub bez DMSO). Jak wspomniano wcześniej, zdefosforylowana mikromacierz mierzy poziom fosforylacji po traktowaniu fosfatazą, a tym samym poziom wyjściowy dla wszystkich innych eksperymentów. Im niższy jest poziom podstawowy, tym wyższy jest zakres dynamiczny testów. Układy autofosforylowane prezentują maksymalne poziomy fosforylacji ze wszystkich macierzy, a sygnał powinien być silny i wyraźny. Służy do analizy danych, ale także jako kontrola, czy wszystkie reakcje zostały pomyślnie przeprowadzone na tablicy.
Ograniczenia techniki Obecnie jednym z ograniczeń przedstawionych tutaj badań przesiewowych leków jest ich zdolność do badania przesiewowego tylko kinaz białkowych, które mogą ulegać autofosforylacji. Jednym z możliwych sposobów przezwyciężenia tego problemu jest wydrukowanie kinazy i znanego substratu w tym samym miejscu. Udało się przeprowadzić jednoczesne drukowanie DNA dla dwóch odrębnych białek15, co sugeruje wykonalność tego podejścia. Co więcej, białko wyświetlane na tablicy może nie być prawidłowo złożone, co skutkuje nieaktywnym białkiem. Zastosowanie systemu ekspresji opartego na człowieku spowodowało znaczną poprawę aktywności kinazy mierzonej na matrycy; Jednak niektóre białka nadal nie mogą być analizowane na macierzy ze względu na jej nieaktywność.
Drugim ograniczeniem jest pomiar fosforylacji za pomocą przeciwciała anty-fosfo-tyrowego. Pomimo braku swoistości w odniesieniu do motywu miejsca fosforylacji, wszystkie zmierzone fosforylacje wystąpiły na resztach tyrozyny, pozostawiając seryny i treoniny oraz ich odpowiednie kinazy. Do tej pory bez powodzenia przetestowano ponad 10 przeciwciał Pan Pho-Ser/Thr, pomimo kilku prób optymalizacji warunków inkubacji i mycia. Nowy system wykrywania, który jest niezależny od przeciwciał, może być najlepszą opcją do rozszerzenia liczby kinaz białkowych, które mogą być badane pod kątem hamowania leków. W tym kontekście dostępnych jest kilka opcji, w tym radioaktywność lub podejścia chemiczne, takie jak koniugacja kliknięć. Wymagana jest seria optymalizacji, aby zminimalizować sygnał tła i zapewnić dobry zakres dynamiki dla testów.
Trzecim ograniczeniem jest pozyskiwanie klonów cDNA, które mają zostać wydrukowane na tablicy. Klony cDNA mogą być generowane przy użyciu dowolnej techniki klonowania, w tym systemów rekombinacji specyficznych dla danego miejsca, takich jak Creator lub Gateway23. Inną opcją jest zakup klonów z biblioteki DNAsu znajdującej się w <https://dnasu.org/DNASU/Home.do>, gdzie ponad 17 000 klonów cDNAs, w tym cały ludzki kinom, jest łatwo dostępnych do wykorzystania do budowy macierzy NAPPA24.
Czwartym ograniczeniem jest to, że nie każde laboratorium jest wyposażone w odpowiedni sprzęt do wytwarzania i badania przesiewowego własnych macierzy NAPPA. Protokół ten zapewnia alternatywne metody generowania DNA do wydrukowania na mikromacierzy, bez potrzeby stosowania sprzętu o wysokiej przepustowości, oraz protokoły do ręcznego wykonywania wszystkich etapów hybrydyzacji. Jednak dostęp do macierz i skanera mikromacierzy jest nadal konieczny. Jedną z opcji rozwiązania tego problemu jest skorzystanie z podstawowej usługi i obiektu NAPPA, które można znaleźć pod adresem <http://nappaproteinarray.org/>, który dystrybuuje niestandardowe mikromacierze NAPPA po cenie akademickiej non-profit. Wreszcie, podobnie jak w przypadku każdej metodyki badań przesiewowych, dane uzyskane na tablicach są podatne na artefakty (dodatnie lub negatywne) i dlatego powinny być walidowane za pomocą testów ortogonalnych.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod Na rynku dostępnych jest kilka platform do badań przesiewowych kinaz białkowych. Jednym z rutynowo stosowanych podejść są testy wiązania, które można przeprowadzić z fragmentami białka, domeną kinazy, większymi fragmentami białek z domeną kinazy i niektórymi regionami regulatorowymi, a nawet białkami o pełnej długości. Białka są zwykle ulegane ekspresji w systemach bakteryjnych ze względu na koszt i prostotę protokołów ekspresji i oczyszczania. Interakcja między lekiem będącym przedmiotem zainteresowania a białkiem jest następnie mierzona za pomocą pewnego rodzaju testu raportowego, takiego jak na przykład fluorescencja lub obecność znaczników. Głównym ograniczeniem tego zestawu podejść jest fakt, że białko niekoniecznie jest aktywne podczas interakcji z lekiem, co może skutkować identyfikacją interakcji fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Fragmenty białek są szczególnie podatne na zmiany w konformacji i braku aktywności, a wszystkie uzyskane dane powinny zostać zwalidowane przy użyciu aktywnych białek, najlepiej w ich pełnej długości. Kolejnym ograniczeniem niektórych platform jest możliwość ekranowania tylko analogów ATP, co ogranicza jego ogólne zastosowanie.
Większość dostępnych na rynku usług w zakresie badań przesiewowych TKI przy użyciu metod enzymatycznych wykorzystuje tylko dzikie wersje kinazy będącej przedmiotem zainteresowania, a czasami tylko kilka wybranych mutantów. Wiedząc, że oporność na leki jest bardzo powszechna u pacjentów leczonych TKI, ważne jest, aby móc mierzyć odpowiedź na lek u różnych mutantów w celu wyboru najbardziej odpowiedniego inhibitora. Ze względu na charakter NAPPA, badanie przesiewowe mutantów kinazy jest proste i można je łatwo przeprowadzić, a jedynym wymaganym narzędziem jest włączenie mutanta kinazy do kolekcji cDNA NAPPA, co można przeprowadzić na przykład poprzez mutagenezę specyficzną dla miejsca.
Przyszłe zastosowania Jedną z najczęstszych form leczenia w leczeniu nowotworów z wykorzystaniem inhibitorów kinaz jest nabywanie mutacji w celu leku w trakcie leczenia. Badania przesiewowe tych mutantów pod kątem ich odpowiedzi na inhibitory kinaz mają kluczowe znaczenie dla wyboru drugiej/trzeciej generacji TKI w celu uzyskania spersonalizowanego leczenia dla każdego pacjenta. Przedstawione tutaj podejście do badań przesiewowych leków zapewnia bezstronną platformę przesiewową, w której każdy inhibitor kinazy tyrozynowej może być testowany na panelu kinaz tyrozynowych obecnych w ludzkim genomie. Ponieważ białka wyświetlane na macierzach NAPPA ulegają ekspresji in vitro z cDNA wydrukowanego na szkiełku, każdy zmutowany wariant może być łatwo włączony do kolekcji cDNA w celu wyświetlenia na tablicy. Obiekt, w którym mutanty kinazy mogą być generowane i wyrażane na macierzy, w połączeniu z wysoką przepustowością techniki NAPPA, zapewnia unikalne środowisko do badania mutantów kinaz i ich reakcji na leki, dzięki czemu NAPPA nadaje się do spersonalizowanych badań przesiewowych leków, co jest jednym z celów medycyny precyzyjnej.

Kinazy białkowe są odpowiedzialne za fosforylację swoich celów i mogą modulować złożone szlaki molekularne, które kontrolują wiele funkcji komórkowych (np. proliferację komórek, różnicowanie, śmierć komórki i przetrwanie). Deregulacja aktywności kinazy jest związana z ponad 400 chorobami, co sprawia, że inhibitory kinaz są jedną z głównych klas leków dostępnych w leczeniu wielu chorób, w tym raka, zaburzeń sercowo-naczyniowych i neurologicznych, a także chorób zapalnych i autoimmunologicznych1,2,3.
Wraz z nadejściem medycyny precyzyjnej, identyfikacja nowych terapii, zwłaszcza inhibitorów kinaz, ma duże znaczenie farmaceutyczne i kliniczne. Do identyfikacji możliwych nowych par kinazy/inhibitorów kinazy można zastosować kilka podejść, w tym projektowanie de novo inhibitorów kinaz i identyfikację nowych celów dla istniejących leków zatwierdzonych przez FDA. To ostatnie jest szczególnie atrakcyjne, ponieważ czas i pieniądze potrzebne do wdrożenia tych leków w klinikach są drastycznie zmniejszone ze względu na dostępność danych z poprzednich badań klinicznych. Kanonicznym przykładem zmiany przeznaczenia inhibitora kinazy jest imatynib, początkowo przeznaczony do leczenia przewlekłej białaczki szpikowej (CML) poprzez hamowanie BCR-Abl, który może być również z powodzeniem stosowany w leczeniu guzów podścieliskowych przewodu pokarmowego z nadekspresją c-Kit (GISTs)4,5,6,7.
Badania przesiewowe inhibitorów kinaz mogą być przeprowadzane w testach wiązania lub testach enzymatycznych. Pierwsza klasa testów koncentruje się na interakcjach białko-lek i może dostarczyć informacji, takich jak miejsce ligacji i powinowactwo. Ponieważ aktywność kinazy w czasie tych testów jest nieznana, wiele interakcji może zostać pominiętych lub błędnie zidentyfikowanych z powodu zmian konformacyjnych w białku. Z drugiej strony, testy enzymatyczne wymagają, aby kinazy białkowe były aktywne i dostarczały cennych informacji na temat wpływu inhibitora na aktywność enzymu, jednak ten rodzaj badań przesiewowych jest na ogół bardziej czasochłonny i kosztowny. Obecnie oba rodzaje testów są komercyjnie dostępne z kilku źródeł. Stanowią one niezawodną opcję do badań przesiewowych inhibitorów kinaz z kilkoma ograniczeniami, w tym: I) większość metod obejmuje indywidualne testowanie wielu kinaz, co może sprawić, że badanie przesiewowe dużego zestawu białek będzie kosztowne; II) zestaw kinaz, które mają być badane, jest ograniczony do listy wstępnie wyselekcjonowanych kinaz typu dzikiego i kilku dobrze znanych zmutowanych wersji niektórych kinaz, co utrudnia testowanie wielu nowych zmutowanych izoform.
W tym kontekście, mikromacierze białkowe są potężną platformą, która jest w stanie przezwyciężyć niektóre z ograniczeń oferowanych przez komercyjnie dostępne techniki. Nadaje się do wykonywania testów enzymatycznych w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych przy użyciu pełnodługich, aktywnych białek o dowolnej sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Mikromacierze można wygenerować za pomocą metody samoorganizującej się, takiej jak NAPPA (nukleinowa programowalna matryca białkowa), w której białka są wyrażane w samą porę przed testami, co zwiększa prawdopodobieństwo, że te wyświetlane w macierzy są rzeczywiście aktywne. Białka wyświetlane na NAPPA są wytwarzane przy użyciu rybosomów i białek opiekuńczych pochodzenia ludzkiego w celu zwiększenia prawdopodobieństwa naturalnego fałdowania i aktywności.
Białka są początkowo programowane poprzez drukowanie na powierzchni mikromacierzy cDNA kodujących interesujące nas geny, połączone za pomocą znacznika przechwytującego, razem z agentem wychwytującym. Białka są następnie wytwarzane na mikromacierzach przy użyciu systemu transkrypcji i translacji in vitro (IVTT), a świeżo eksprymowane białka są unieruchamiane na powierzchni mikromacierzy przez czynnik wychwytujący. Wyrażone macierze NAPPA mogą być używane do badania białek wyświetlanych na tablicy w sposób bezstronny, wysokoprzepustowy8,9.
Poprzednio pokazano, że białka wyświetlane na tablicach NAPPA są prawidłowo złożone, aby wchodzić w interakcje ze znanymi partnerami10; ponadto, ich aktywność enzymatyczna została po raz pierwszy wykorzystana w 2018 roku, kiedy pokazano, że kinazy białkowe wyświetlane na mikromacierzy autofosforylatują11. Do tej pory metodologia NAPPA była wykorzystywana do wielu różnych zastosowań, w tym do odkrywania biomarkerów12,13,14,15,16,17, interakcje białko-białko10,18, identyfikacja substratu19, oraz badania przesiewowe na obecność narkotyków<klasa SUP="xref">11. Jej elastyczność jest jedną z kluczowych cech platformy, która pozwala na dostosowanie do każdej aplikacji.
Tutaj przedstawiono protokół badania przesiewowego inhibitorów kinazy tyrozynowej w samoorganizujących się matrycach NAPPA. Platforma jest zoptymalizowana pod kątem wyświetlania aktywnych ludzkich kinaz białkowych oraz do analizy aktywności kinaz białkowych, z niskim tłem i wysokim zakresem dynamiki. Wśród modyfikacji wdrożonych w celu wykorzystania NAPPA do badań przesiewowych inhibitorów kinaz znajdują się: I) zmiany w chemii drukującej, II) defosforylacja mikromacierzy białkowej przed badaniem przesiewowym inhibitora kinazy oraz III) optymalizacja wykrywania fosforylowanych białek na matrycy. Protokół ten jest pierwszym w swoim rodzaju i dostarcza unikalnych informacji na temat badania kinaz w mikromacierzach NAPPA.

<table><tbody><tr><td><mocne>odczynnik/materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki dołkowe 364 (do układu)</td><td>Genetix</td><td>x7020</td><td></td></tr><tr><td>800 &micro; L 96-dołkowa płytka zbiorcza</td><td>Abgene</td><td>AB-0859</td><td></td></tr><tr><td>96-pinowe urządzenie</td><td>Boekel</td><td>140500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Millipore-Sigma</td><td>1.00066</td><td></td></tr><tr><td>Aceton 99,9%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa uszczelka do płytek 96-dołkowych</td><td>VWR</td><td>76004-236</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilan (3-aminopropylotrietoksysilan)</td><td>Pierce</td><td>Przeciwciało 80370</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 wytwarzane u myszy</td><td>Millipore Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag królicze przeciwciało (poliklonalne)</td><td>Millipore Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan sól disodowa hydrat agar</td> bakteriologiczny <td>Millipore-Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>37535</td><td></td></tr><tr><td>Brij 35</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>BP345-500</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>DeepWell Block, skrzynka 50</td><td>ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0661</td><td></td></tr><tr><td>DEPC woda</td><td>Ambion</td><td>9906</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik interkalujący DNA</td><td>Invitrogen</td><td>P11495</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Millipore-Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Płyty filtracyjne</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA77002804</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki przepuszczalne dla gazu, pudełko 50</td><td>sztuk ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pudełko</td><td>Wheaton</td><td>900201</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl (kwas solny)</td><td>Milipore-Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>System IVTT oparty na człowieku</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPure Mouse IgG cała cząsteczka</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>31202</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>KCl (chlorek potasu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4(Fosforan potasu jednozasadowy)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kinazy</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9802</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (octan potasu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P1190</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza białkowa lambda</td><td>New England Biolabs</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25X60I24789001LS</td><td></td></tr><tr><td>Metalowy 30-suwakowy stojak bez uchwytów</td><td>Wheaton</td><td>900234</td><td></td></tr><tr><td>MgCL2 (chlorek magnezu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (orthovanadan sodu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (chlorek sodu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc (octan sodu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (wodorotlenek sodu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.10 / 740414.10</td><td></td></tr><tr><td>Anion Nucleoprep II</td><td>Macherey Nagel</td><td>740503.1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>Milipore-Sigma</td><td>79617</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny (0,01%)</td>Fosfataza białkowa <td>Millipore-Sigma</td><td>A-005-C</td><td></td></tr><tr><td>(Lambda)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>RNAzy</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka</td><td>Grace Bio-Labs, Inc</td><td>44904</td><td></td></tr><tr><td>Pakiety krzemionkowe</td><td>VWR</td><td>100489-246</td><td></td></tr><tr><td>Płytka jednodołkowa</td><td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu (3M, pH 5,5)</td><td>Pożywka Millipore-Sigma</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>TB (Terrific Broth)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T0918</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>IBI IB70144</td><td></td><td></td>naukowej</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Udogodnienia</td><td>Maker/ model</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programowalny inkubator chłodzący</td><td>Inkubator Torrey Pines IN30 z wytrząsarką chłodzącą</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do rozwoju bakterii</td><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td>ATR Multitron</tr><tr><td>Kolektor próżniowy z pułapką na odpady</td><td>płynne MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well autopippetor/ciecz</td><td>Genmate lub Biomek FX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dozownik cieczy</td><td>Mikromacierz DNA Wellmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Genetix QArray2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna stacja hybrydyzująca</td><td>Tecan HS4800 Pro Skaner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikromacierzy</td><td>Tecan PowerScanner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwantyfikacja danych z mikromacierzy</td><td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz są kluczowe dla lepszego zrozumienia właściwości leku i identyfikacji potencjalnie nowych celów o implikacjach klinicznych. Zgłoszono kilka metodologii umożliwiających przeprowadzenie takich badań przesiewowych. Jednak każdy z nich ma swoje własne ograniczenia (np. badania przesiewowe tylko analogów ATP, ograniczenie do stosowania oczyszczonych domen kinaz, znaczne koszty związane z testowaniem więcej niż kilku kinaz jednocześnie oraz brak elastyczności w badaniach przesiewowych kinaz białkowych z nowymi mutacjami). W tym miejscu przedstawiono nowy protokół, który pokonuje niektóre z tych ograniczeń i może być stosowany do bezstronnych badań przesiewowych inhibitorów kinaz. Mocną stroną tej metody jest jej zdolność do porównywania aktywności inhibitorów kinaz w wielu białkach, zarówno między różnymi kinazami, jak i różnymi wariantami tej samej kinazy. Wykorzystuje się samoorganizujące się mikromacierze białkowe generowane w wyniku ekspresji kinaz białkowych przez ludzki system transkrypcji i translacji in vitro (IVTT). Białka wyświetlane na mikromacierzy są aktywne, co pozwala na pomiar działania inhibitorów kinaz. Poniższa procedura szczegółowo opisuje kroki protokołu, od generowania mikromacierzy i selekcji po analizę danych.

Samoorganizujące się mikromacierze NAPPA stanowią solidną platformę, która może być wykorzystywana w wielu różnych zastosowaniach, w tym do odkrywania biomarkerów, badania oddziaływań białko-białko, identyfikacji substratów oraz przesiewania leków10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
Ogólna metodologia przyjęta do badania aktywności kinaz oraz przesiewania inhibitorów kinaz tyrozynowych na mikrotablicach NAPPA została przedstawiona schematycznie na Rysunku 1. Najpierw mikrotablice NAPPA są generowane poprzez immobilizację cDNA i czynnika wychwytującego na powleczonych mikrotablicach. Następnie cDNA służą jako matryca do transkrypcji i translacji białek z wykorzystaniem ludzkiego systemu IVTT, a nowo zsyntetyzowane białka są immobilizowane przez czynnik wychwytujący9. Jakość wydrukowanej mikrotablicy można monitorować poprzez pomiar poziomu DNA (potwierdzając spójność drukowania) lub białka wykazanego na tablicy (potwierdzając ekspresję i wychwyt białka; Rysunek 1). Aby zmniejszyć sygnał tła i zwiększyć zakres dynamiczny eksperymentu, mikrotablice są traktowane 1) fosfatazą lambda w celu usunięcia fosforylacji z reszt Ser/Thr/Tyr, a następnie 2) DNazą, aby uprościć chemię w plamce i zmniejszyć tło (Rysunek 1).
Kolejnym krokiem jest reakcja autofosforylacji, w której mikromacierze inkubuje się z buforem kinazy w obecności ATP (negatywna kontrola macierzy, określana jako mikromacierze defosforylowane), a bufor kinazy jest uzupełniany o ATP (kontrola dodatnia, określana jako macierze autofosforylowane) lub ATP + DMSO (kontrola nośnika). Należy podkreślić, że na tym etapie nie dodaje się kinazy; w związku z tym wewnętrzną aktywność każdej kinazy unieruchomionej na mikromacierzy określa się poprzez pomiar poziomu jej fosforylacji z wykorzystaniem przeciwciała pan anty-fosfotyrozynowego, a następnie przeciwciała wtórnego znakowanego cy3 (Rysunek 1).
Kontrola jakości macierzy NAPPA-kinase, zawierających panel ludzkich kinaz białkowych naniesionych w czterech kopiach, została przedstawiona na Rysunku 2. Poziomy unieruchomionego DNA zmierzono za pomocą barwienia DNA, co wykazało jednolity sygnał w obrębie mikromacierzy, sugerując, że ilość DNA naniesiona na macierz była równomierna. Można również zaobserwować kilka punktów bez żadnego barwienia DNA. Punkty te odpowiadają niektórym kontrolom, w których z mieszaniny do naniesienia pominięto DNA [t.j. puste miejsca (nic nie naniesiono), punkty z wodą, punkt z oczyszczonym IgG (poli-lizyna, łącznik i oczyszczone IgG), sama mieszanina do naniesienia (pełna mieszanina do naniesienia: poli-lizyna oraz łącznik i przeciwciało anty-flag, bez żadnego DNA)]. Poziomy białek wykazanych na mikromacierzach NAPPA-kinase oceniono po reakcji IVTT przy użyciu przeciwciała anty-tag.
Do screeningu kinaz wykorzystano znacznik Flag, a poziom białka wykazanego na mikrotablicy zmierzono za pomocą przeciwciała anty-flag. Jak pokazano, większość plamek zawierających cDNA wykazała wykrywalne poziomy białka. Niektóre plamki kontrolne bez cDNA również ujawniły sygnał z przeciwciałem anty-flag: plamka IgG (użyta do wykrycia aktywności przeciwciała wtórnego) oraz plamki z pustym wektorem (cDNA koduje tylko znacznik) (Rysunek 2). Mikrotablice NAPPA-kinase wykazały dobrą powtarzalność między slajdami, przy czym korelacja poziomów ekspresji białek między różnymi partiami nadruków była wyższa niż 0,88 (Rysunek 2). W obrębie tej samej partii korelacja była jeszcze wyższa, bliska 0,92 (dane nie pokazano).
Następnie, aktywność autofosforylacji kinazy białek wyeksponowanych na macierzy zmierzono przy użyciu przeciwciała przeciwko fosfotyrozynie (Rysunek 3). Białka wyeksponowane na macierzy wykazały wysokie poziomy fosforylacji po ekspresji (Rysunek 3, lewa strona), co może być spowodowane wewnętrzną aktywnością kinazy białek wyeksponowanych na macierzy lub obecnością aktywnych kinaz w mieszaninie IVTT. Fosforylację tę całkowicie usunięto poprzez traktowanie fosfatazą lambda, a następnie takie macierze wykorzystano do testów kinazy. Po defosforylacji reakcje autofosforylacji przeprowadzone bez ATP nie wykazały istotnych poziomów fosforylacji, zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy macierze inkubowane w buforze kinazy w obecności ATP wykazały fosforylację białek już po 15 min (Rysunek 3). W celu przesiewania leków aktywność kinazy mierzono po 60 min reakcji autofosforylacji, aby zmaksymalizować liczbę przetestowanych kinaz.
Porównanie macierzy, w których poziomy fosforylacji mierzono bezpośrednio po ekspresji białek (Rysunek 3, lewo) oraz po 60 min reakcji autofosforylacji (Rysunek 3, prawo) wykazało: i) białka fosforylowane tylko po ekspresji, co sugeruje, że mogą one być fosforylowane egzogennie przez białka obecne w mieszaninie IVTT, ale nie mogą ulegać autofosforylacji; ii) białka fosforylowane tylko po reakcji autofosforylacji, co sugeruje, że białka te nie były aktywne po ekspresji i wymagały kofaktorów obecnych w buforze kinazy, aby stać się aktywnymi; lub iii) białka fosforylowane na obu macierzach, co sugeruje, że były one aktywne w obu warunkach (Rysunek 3).
Jako przykład wyników uzyskanych podczas przesiewania inhibitorów tyrozynokinazy na matrycach NAPPA-kinase wykorzystano trzy inhibitory kinaz o odmiennej selektywności względem kinaz białkowych: staurosporynę, imatynib i ibrutynib. We wszystkich badaniach przesiewowych zdefosforylowane mikrotablice NAPPA inkubowano z rosnącymi stężeniami TKI (w zakresie od 100 nM do 10 uM) podczas reakcji autofosforylacji. Pierwszym przetestowanym TKI była staurosporyna, globalny inhibitor kinaz białkowych, który wykazał silne hamowanie kinaz na mikrotablicy w odniesieniu do niemal wszystkich badanych kinaz11.
Następnie przetestowano imatynib, inhibitor ABL i c-Kit stosowany w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej oraz guzów stromalnych przewodu pokarmowego4,5,6,7. Na macierzach NAPPA-kinase imatynib wykazał znaczną redukcję aktywności Abl1 oraz BCR-Abl1, podczas gdy inne kinazy pozostały w większości niezakłócone (Rysunek 4A). Ilościowe oznaczenie aktywności kinaz zostało znormalizowane względem macierzy defosforylowanej i przedstawione jako procent macierzy kontrolnej dodatniej (sam nośnik). Dane dla TNK2 (kinaza nieistotna), Abl1 oraz BCR-Abl1 przedstawiono na Rysunku 4B. Zgodnie z oczekiwaniami, imatynib wykazał selektywne hamowanie w stosunku do Abl1 i BCR-ABl1. Dane dla c-Kit były niejednoznaczne ze względu na brak aktywności na macierzach kontrolnych dodatnich.
Na koniec przetestowano ibrutynib, zatwierdzony przez FDA kowalencyjny inhibitor kinazy tyrozynowej Brutona (BTK). Ibrutynib jest obecnie stosowany w leczeniu kilku nowotworów krwi z nadaktywną BTK, w tym przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL), chłoniaka komórek płaszcza oraz makroglobulinemii Waldenströma21,22. Rysunek 4C przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane podczas przesiewu ibrutynibu. Aktywność kinaz ABL1 (kinaza nieistotna), BTK (cel kanoniczny) oraz ERBB4 (potencjalny nowy cel) pokazano na Rysunku 4D. Dane sugerują, że ERBB4 może być hamowany przez ibrutynib w sposób zależny od dawki. Hamowanie to zostało potwierdzone in vitro oraz w testach komórkowych11, co demonstruje skuteczność tej platformy.
Wszystkie te dane sugerują, że platforma mikroarray NAPPA-kinase może być wykorzystana do bezstronnego przesiewania inhibitorów TK. Ponadto badanie przesiewowe jest szybkie i można je łatwo dostosować tak, aby objęło dowolne warianty interesujących nas kinaz białkowych.
<img alt="Schemat procesu autofosforylacji ze ścieżką ATP; detekcja fosforylacji; układ przesiewania leków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja kontroli jakości i przesiewania inhibitorów kinaz tyrozynowych w matrycach NAPPA. Matryce NAPPA są drukowane z cDNA kodującym białko docelowe połączone z tagiem i przeciwciałem wychwytującym. Podczas reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) syntetyzowane białka są wychwytywane na powierzchni mikromacierzy poprzez tag za pomocą przeciwciała wychwytującego. Kontrola jakości (QC) matryc jest przeprowadzana poprzez pomiar poziomu DNA nadrukowanego na szkiełku, przy użyciu fluorescencyjnego barwnika przerywającego DNA, oraz poziomu białek wykazanych na matrycy przy użyciu przeciwciał specyficznych dla tagu. W celu przesiewania kinaz mikromacierze są traktowane DNazą i fosfatazą po reakcji IVTT, aby usunąć nadrukowane DNA oraz wszelkie fosforylacje, które mogły zajść podczas syntezy białek. Odfosforylowane matryce są teraz gotowe do użycia w przesiewaniu leków. Dla każdego testu rutynowo stosuje się trzy zestawy kontrolne: (I) matryce odfosforylowane, w których reakcja autofosforylacji jest przeprowadzana bez ATP; (II) mikromacierze autofosforylowane, w których reakcja autofosforylacji jest przeprowadzana w obecności ATP; oraz (III) matryca traktowana DMSO (nośnik), w której reakcja autofosforylacji jest przeprowadzana z ATP i DMSO. Szkiełka traktowane różnymi stężeniami inhibitorów kinaz podlegają dokładnie temu samemu protokołowi, który stosuje się dla matryc traktowanych DMSO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikromacierzy: barwienie DNA, detekcja białek i wykres rozrzutu dla korelacji ekspresji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki kontroli jakości dla samoorganizujących się macierzy NAPPA-kinase. Przedstawiono zawartość DNA zmierzoną za pomocą fluorescencyjnego barwnika przerwanego do DNA (po lewej) oraz poziomy białek obecnych na mikromacierzy zmierzone za pomocą przeciwciała anty-Flag (środek). Po prawej stronie znajduje się wykres korelacji poziomów białek obecnych na dwóch macierzach NAPPA-kinase wydrukowanych w osobnych partiach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment fosforylacji; autofosforylacja z ATP; schemat western blot; analiza przebiegu czasowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki aktywności kinazy w matrycach NAPPA-kinase. Do badania aktywności kinaz białkowych w matrycy wykorzystano mikrozespoły zawierające kinazy białkowe w czterech powtórzeniach; aktywność mierzono poprzez oznaczanie fosforylacji białek z użyciem przeciwciała anty-pTyr, a następnie przeciwciała anty-mysiego znakowanego cy3. Matryce kontrolne, które nie były poddane działaniu fosfatazy/DNazy i w których podczas reakcji autofosforylacji pominięto ATP, posłużyły do pomiaru fosforylacji tła po ekspresji białek (post-expression). Pozostałe mikrozespoły potraktowano fosfatazą/DNA, a następnie przeprowadzono reakcję autofosforylacji bez ATP (mikrozespół defosforylowany, kontrola negatywna) lub z ATP (mikrozespoły autofosforylowane). W przypadku mikrozespołów autofosforylowanych reakcję autofosforylacji przeprowadzono przez 15 min, 30 min, 45 min lub 60 min, zgodnie z oznaczeniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki testu inhibicji kinazy; siatka i wykresy aktywności dla zależności dawka-odpowiedź dla imatynibu i ibrutynibu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne dane z przesiewu kinaz tyrozynowych na matrycach NAPPA-kinase. (A) Matryce NAPPA-kinase traktowane fosfatazą/DNazą inkubowano z rosnącymi stężeniami imatynibu podczas reakcji autofosforylacji, a aktywność kinazy zmierzono za pomocą przeciwciała anty-fosfotyrozynowego. (B) Ilościowe oznaczenie aktywności kinazy zaobserwowanej na matrycach NAPPA-kinase wystawionych na działanie imatynibu. Dane znormalizowano względem sygnału z matryc kontroli negatywnej (defosforylowanych) i przedstawiono jako procent matryc kontroli pozytywnej (reakcja autofosforylacji przeprowadzona w obecności DMSO). Podobne dane przedstawiono dla przesiewu ibrutynibu (C,D). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Rauf et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1. Alternatywny protokół przesiewania inhibitorów tyrozynokinaz w macierzach NAPPA z wykorzystaniem zautomatyzowanej stacji hybrydyzacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA to potężna platforma mikromacierzy białkowych, która może być wykorzystywana do badania aktywności i funkcji białek w bezstronny sposób o wysokiej przepustowości. Białka wyświetlane na NAPPA są wytwarzane w ludzkim systemie ekspresji przy użyciu rybosomów i białek opiekuńczych pochodzących z człowieka w celu zwiększenia prawdopodobieństwa naturalnego fałdowania i aktywności. Wykorzystanie macierzy NAPPA do badań przesiewowych inhibitorów kinaz stanowi nową platformę do testowania nowych leków i klinicznie istotnych mutacji kinaz.Mikromacierze białkowe wygenerowane za pomocą metodologii NAPPA mogą być wykorzystywane do wielu różnych zastosowań, w tym do odkrywania biomarkerów, interakcji białko-białko, identyfikacji substratów i badań przesiewowych leków. Po drodze wykonuj kroki kontroli jakości. Przetestuj jakość swojego preparatu DNA, mikromacierzy DNA i mikromacierzy białkowej.Jeśli na którymkolwiek etapie jakość nie jest dobra, po prostu zacznij od nowa. Procedurę zademonstruje Lisa Miller, technik w moim laboratorium. Aby przygotować rozwój bakterii do domowego mini-prepu o wysokiej przepustowości, najpierw zaszczepij bakterie na płycie ślimakowej w formacie 96 dołków i pozwól im rosnąć przez 16 godzin.Następnego dnia napełnij każdą studzienkę płytki z głęboką studzienką 1,5 mililitra wspaniałej pożywki bulionowej, uzupełnionej przeciwciałem ampicyliną. Przeciwciało zależy od markera selekcyjnego na plazmidzie. Następnie wysterylizuj 96-pinowe urządzenie z 80% etanolem i płomieniem.Użyj sterylnego 96-pinowego urządzenia, aby pobrać kolonie z inkubowanej przez noc płytki agarowej i zanurzyć ją w dołkach płytki głębokiej studzienki, aby zaszczepić kulturę. Przykryj blok uszczelką przepuszczającą gaz i inkubuj na wytrząsarce przez 22 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od 300 do 800 obr./min. Następnie należy przeprowadzić hodowle osadów i ponownie zawiesić kultury zgodnie z rękopisem.Poddaj bakterie lizie, dodając 200 mikrolitrów roztworu po dwa do każdej studzienki, uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką i odwróć pięć razy. Inkubuj komórki dokładnie przez pięć minut. Aby zneutralizować roztwór, dodaj 200 mikrolitrów roztworu trzy, uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką i odwróć pięć razy.Następnie obracaj płytkę w temperaturze 3800 G, cztery stopnie Celsjusza, przez 30 minut, aby usunąć supernatant z lizatu. Aby przygotować płytki z żywicy anionowymiennej, najpierw wymieszaj zawiesinę anionowymienną i wlej zawiesinę do szklanego koryta. Ułóż płytki filtracyjne na płycie głębokiej studzienki, aby działały jak naczynie na odpady.Następnie, za pomocą dysz P1000 z szerokiej płyty, wymieszaj gnojowicę i przenieś 450 mikrolitrów gnojowicy do każdej studzienki płyt filtracyjnych. Odwirować i odrzucić przepływ. Teraz przenieś supernatanty lizatu do stosu płytki żywicznej i bloku studni głębinowej.Obracaj ułożone w stos talerze przez pięć minut z prędkością 30 razy G z najwolniejszą prędkością narastania i wyrzuć przepływ. Aby umyć kolumnę, dodaj 400 mikrolitrów roztworu buforu płuczącego N3 do każdej studzienki. Przenieś płytkę żywiczną do kolektora próżniowego, aby usunąć bufor myjący.Powtórz etap mycia trzy razy, a następnie usuń pozostały bufor płuczki za pomocą krótkiego, pięciominutowego wirowania 30 razy, G.To wymyć DNA, umieść płytkę z żywicą na czystej płytce zbiorczej o pojemności 800 mikrolitrów. Dodaj 300 mikrolitrów roztworu N5 do każdej studzienki i pozostaw w temperaturze pokojowej na dziesięć minut. Następnie obracaj ułożone w stos talerze przez pięć minut z prędkością 20 razy G z powolną prędkością narastania do 233 razy G przez jedną minutę.Przed użyciem przechowuj talerze w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Najpierw umieść szkiełka na stojaku i zanurz je w szklanym zbiorniku zawierającym roztwór powlekający odczynnik 2% aminozelanu w acetonie. Kołysz się na zjeżdżalniach przez 15 minut.Następnie opłucz szkiełka w acetonie, a następnie spłucz je w wodzie. Następnie wysusz szkiełka za pomocą sprężonego powietrza. na nie pod każdym kątem przez około trzy minuty, aż wszystkie kropelki wody zostaną usunięte.Przechowuj powlekane szkiełka w temperaturze pokojowej na metalowym stojaku w szczelnie zamkniętym pudełku. Teraz przystąp do wytrącania DNA zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie ponownie zawieś osad DNA w 20 mikrolitrach ultraczystej wody i wstrząsaj z prędkością 1000 obr./min przez dwie godziny.Aby przygotować próbkę matrycy, dodaj 10 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki drukarskiej, która zawiera przeciwciało, środek sieciujący i polilizynę do każdej próbki DNA. Uszczelnij płyty folią aluminiową i wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 90 minut przy 1000 obr./min. Przechowuj talerze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W dniu drukowania krótko zawiruj i obróć płyty. Przenieś 28 mikrolitrów każdej próbki na płytkę 384-dołkową. Umieść szkiełka pokryte aminozelanem i płytkę 384-dołkową na pokładzie macierzy i uruchom program drukowania mikromacierzy.Po zakończeniu drukowania oznacz mikrotablice. Mikromacierze mogą być przechowywane przez wiele miesięcy do czasu dalszego użytkowania. Aby zmierzyć poziom DNA, umieść szkiełka w pudełku z pipetami i zablokuj je 50 mililitrami buforu blokującego.Inkubuj szkiełka na kołyszącym się shakerze w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie wyrzuć roztwór i dodaj 20 mililitrów buforu blokującego i 33 mikrolitry barwnika interkalacyjnego fluorescencyjnego DNA. Inkubować przez 15 minut z mieszaniem.Po zakończeniu inkubacji szybko spłucz szkiełka ultra czystą wodą i osusz powietrzem pod ciśnieniem. Mikromacierze są gotowe do skanowania. Aby odciągnąć mikromatryce, zablokuj szkiełka, jak pokazano wcześniej, a następnie spłucz je ultra czystą wodą i wysusz przefiltrowanym sprężonym powietrzem.Przymocuj uszczelkę do każdego suwaka. Dodaj 130 mililitrów mieszanki do transkrypcji i translacji in vitro na szkiełka i delikatnie masuj uszczelki, aby mieszanina transkrypcji i translacji in vitro rozprowadziła się i pokryła cały obszar matrycy bez żadnych pęcherzyków. Nałóż małe okrągłe uszczelki portów na oba porty.Inkubować przez 90 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza w celu ekspresji białka, a następnie 30 minut w temperaturze 15 stopni Celsjusza w celu unieruchomienia białka pytającego. Następnie zdejmij uszczelkę, umyj szkiełka trzy razy po pięć minut w 15 mililitrach TBST z mlekiem i zablokuj w tym samym roztworze na godzinę. W celu wykrycia białek na tablicy, usuń TBST z mlekiem, umieść szkiełka na płytce siatkowej i nałóż 600 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego, mysiego anty-Flag, rozcieńczonego od 1 do 200 i 1x TBST uzupełnionego 5% mlekiem.Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka 50 mililitrami 1x TBST i 5% mleka na bujanym shakerze trzy razy przez pięć minut każde. Powtórz procedurę dla przeciwciała drugorzędowego.Po zakończeniu godzinnej inkubacji umyj szkiełka 1x TBST na bujanej wytrząsarce trzy razy po pięć minut każda. Następnie szybko spłucz szkiełka ultra czystą wodą i wysusz je powietrzem pod ciśnieniem. Slajdy są gotowe do skanowania.Aby przeprowadzić leczenie fosfatazą i DNazą, umyj i zablokuj odciągnięte szkiełka TBST uzupełnionym 3% BSA, jak opisano w manuskrypcie. Następnie umieść szkiełka na płytce siatkowej i nałóż 200 mikrolitrów roztworu DNazy fosfatazy. Umieść szkiełko nakrywkowe do mikromacierzy na wierzchu, aby uniknąć parowania.Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez godzinę i 30 minut w piekarniku. Następnie umyj szkiełka 1x TBST i 0,2 molowym chlorkiem sodu na bujanej shakerze trzy razy przez pięć minut każda. Aby przeprowadzić leczenie farmakologiczne i reakcję kinazy, umieść szkiełka na płytce siatkowej i nałóż 200 mikrolitrów roztworu kinazy lekowej.Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uniknąć parowania. Inkubować przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w piekarniku. Kluczem do powtarzalnych danych jest stały czas inkubacji na wszystkich slajdach.Jest to szczególnie ważne podczas reakcji kinazy. Należy wziąć pod uwagę czas potrzebny na przetworzenie każdego preparatu. Następnie umyj szkiełka 1x TBST i 0,2 molowym chlorkiem sodu na bujanej shakerze trzy razy przez pięć minut każde.Powtórz wykrywanie białka, używając jako przeciwciała pierwszorzędowego przeciwciała fosfotyrozyny rozcieńczonego od 1 do 100 w TBST, uzupełnionego 3% albuminą surowicy bydlęcej. Stosować 1x TBST i 3% albuminę surowicy bydlęcej do przemywania po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym oraz TBST do przemywania po inkubacjach z przeciwciałem drugorzędowym. Umyj i wysusz jak poprzednio.W celu uzyskania obrazu załaduj mikromacierze do magazynka uchwytów na szkiełka. Załaduj magazynek do skanera mikromatrycowego. Skanuj wszystkie mikromacierze ze zoptymalizowanymi ustawieniami i pamiętaj o wyłączeniu automatycznego wzmocnienia podczas porównywania obrazów w różnych eksperymentach.Przenieś obrazy do oprogramowania do analizy ilościowej, wyrównaj siatkę z plamkami i określ ilościowo intensywność sygnału każdej cechy na mikromacierzy. Kontynuuj analizę statystyczną. W tym badaniu mikromacierz wykazała, że większość plamek zawierających komplementarne DNA z powodzeniem wykazywała wykrywalne poziomy białka.Mikromacierze kinazy NAPPA wykazały dobrą odtwarzalność wśród preparatów, przy czym korelacja poziomów wyświetlania białek między różnymi partiami drukarskimi była wyższa niż 0,88. Reprezentatywne wyniki aktywności kinaz w macierzach kinaz NAPPA wykazały wysoki poziom fosforylacji białek po ekspresji. Porównanie mikromacierzy, w których mierzono poziomy fosforylacji zaraz po traktowaniu fosfatazą i po 60 minutach reakcji autofosforylacji, sugeruje obecność aktywnych kinaz białkowych w macierzy.W przypadku macierzy kinaz NAPPA imatynib wykazywał znaczące zmniejszenie aktywności ABL1 i BCR-ABL1, podczas gdy inne kinazy pozostały w większości nienaruszone. Aktywność kinazy znormalizowana w stosunku do defosforylowanej macierzy i reprezentowana jako procent pozytywnej mikromacierzy kontrolnej wykazała selektywne hamowanie imatynibu w kierunku ABL1 i BCR-ABL1. Typowe wyniki uzyskane dla badań przesiewowych ibrutynibu wykazały, że aktywność kinazy nieistotnej kinazy ABL1 pozostaje niezaburzona.Cel kanoniczny BTK i potencjalny nowy cel ERBB4 wykazały zmniejszoną aktywność w obecności ibrutynibu. Dane sugerują, że ERBB4 może być hamowany przez ibrutynib w sposób zależny od dawki. Powodzenie badań przesiewowych mikromacierzy białkowej w dużym stopniu zależy od jakości samej mikromacierzy.Należy zastosować kilka cech kontroli dodatniej i ujemnej, aby umożliwić właściwą analizę danych. Test kinazy NAPPA jest platformą przesiewową i jako taki uzyskane dane powinny zostać zweryfikowane w testach kontrolnych, które mogą obejmować testy kinazy in vitro lub testy komórkowe. Ponieważ nasz protokół zaczyna się od cDNA, każda mutacja lub zmiana kinazy może być łatwo włączona do mikromacierzy i badana z dużą przepustowością.Podczas przygotowywania zawiesiny i płytek żywicy anionowymiennej zaleca się stosowanie masek zapobiegających ewentualnemu wdychaniu cząstek żywicy.

kinase-inhibitor-screening-in-self-assembled-human-protein-microarrays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Opisano podejście do badań przesiewowych materiałów w celu opracowania mikromacierzy domieszkowanych białkiem pochodzącym zol-żel przy użyciu nowej metody produkcji druku pinów. Metodologia ta została zademonstrowana poprzez opracowanie mikromacierzy acetylocholinoesterazy i multikinaz, które są wykorzystywane do opłacalnych badań przesiewowych małych cząsteczek.

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Poznaj metodę przesiewowego badania inhibitorów kinaz przy użyciu mikromacierzy białkowych NAPPA. Ta technika umożliwia analizę aktywności kinaz ludzkich i ich mutacji klinicznych w wysokiej przepustowości.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Przeglądaj więcej filmów