Indukowane różnicowanie komórek podobnych do komórek M w monowarstwach jelita krętego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych
26 lipca 2019
Ten protokół opisuje, jak indukować różnicowanie komórek M w monowarstwach jelita krętego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych oraz metody oceny ich rozwoju.
Brakuje pełnego zrozumienia roli, jaką komórki M odgrywają w homeostazie jelit i obronie immunologicznej, ze względu na rzadkość występowania komórek M w jelicie. Indukowane różnicowanie komórek M w hodowlach pochodzących z ludzkich jelitowych komórek macierzystych pozwoli na badanie rozwoju i funkcji komórek M. Aby pokryć membrany Transwell, umieść żądaną liczbę Transwell w 24-dołkowej płytce, tworząc system dwukomorowy.
Rozcieńczyć macierz zewnątrzkomórkową lub ECM 25-krotnie w zimnym, sterylnym, buforowanym fosforanem soli fizjologicznej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego na zimno roztworu do każdej górnej komory na membranie. Przykryj płytkę 24-dołkową pokrywką i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny, aby umożliwić zestalenie ECM na membranie.
Po dwóch godzinach wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w kapturze do hodowli tkankowej. Za pomocą sterylnej pęsety odwróć każdy Transwell, aby delikatnie usunąć pozostały roztwór. Pozostaw membrany do wyschnięcia na powietrzu w kapturze z otwartą pokrywą podczas zbierania komórek.
Wyjąć płytkę z enteroidami jelita krętego z inkubatora i delikatnie usunąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki przez aspirację próżniową lub za pomocą pipety. Aby rozbić ECM, dodaj 500 mikrolitrów lodowatego 0,5 milimolowego EDTA do każdej studzienki zawierającej enteroidy jelita krętego zawieszone w ECM. Energicznie pipetować w górę i w dół za pomocą pipetera P1000 ustawionego na 500 mikrolitrów, aby rozbić ECM, uwalniając w ten sposób enteroidy jelita krętego do roztworu.
Zbierz roztwór z każdej studzienki do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Granuluj komórki w wirówce w temperaturze 140 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Osad powinien być widoczny, ale można go łatwo usunąć, dlatego powoli usuwaj supernatant przez aspirację próżniową lub za pomocą pipety.
Aby strawić ścisłe połączenia połączeniowe i rozbić enteroidy jelita krętego na pojedyncze komórki, ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach trypsyny o temperaturze pokojowej na każde pięć zebranych studzienek. Za pomocą pipetera P1000 pipetuj w górę i w dół, aby zdezagregować grudki. Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut lub krócej.
Dodaj jeden mililitr zaawansowanego DMEM F-12 z 10% FPS na 500 mikrolitrów trypsyny, aby dezaktywować trypsynę. Pipetować w górę iw dół za pomocą P1000 ustawionego na 500 mikrolitrów co najmniej 50 razy w kierunku boku stożkowej rurki, aby dalej rozdzielić pozostałe grudki na pojedyncze komórki. Umieść sitko o średnicy 40 mikronów na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów i dodaj jeden mililitr zaawansowanego DMEM F-12 o 10% FPS, aby zwilżyć sitko do komórek.
Odpipetować zawiesinę jednokomórkową z 15-mililitrowego stożka na sitko. Umyj sitko jednym mililitrem zaawansowanego DMEM F-12 z 10% FPS. Przenieś komórki, które przeszły przez sitko do komórek, z 50-mililitrowej stożkowej rurki do nowej 15-mililitrowej stożkowej rurki.
Policz komórki za pomocą hemocytometru. Odwiruj komórki w nowej 15-mililitrowej probówce o temperaturze 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Osad komórkowy powinien być widoczny.
Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety, ponownie oszczędzając supernatant na wypadek przemieszczenia się osadu. Ponownie zawiesić osad komórkowy w MCMGF plus za pomocą 10 mikromolowych Y27632. Upewnij się, że membrany kodowane ECM całkowicie wyschły, zgodnie z oceną wzrokową.
Umyj górną komorę 200 mikrolitrami MCMGF plus. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdej górnej komory. Dodaj 700 mikrolitrów MCMGF plus z 10 mikromolami Y27632 do każdej dolnej komory.
Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Po jednym dniu wzrostu usuń pożywkę z górnej komory i zastąp ją 200 mikrolitrami świeżego MCMGF plus, aby zapobiec wzrostowi wielu warstw komórek. Gdy monowarstwy osiągną około 80% zlewania się, zwykle między pierwszym a trzecim dniem po wysiewie, zastąp podłoża podstawne pożywkami różnicującymi dla studzienek kontrolnych lub pożywkami z komórek M dla dołków indukcyjnych komórek M.
Zastąp pożywkę w górnej komorze pożywką różnicującą dla obu warunków. Aby zweryfikować różnicowanie komórek M za pomocą QRTPCR, najpierw usuń pożywkę z górnej i dolnej komory. Delikatnie umyj górną komorę dwukrotnie 300 mikrolitrami PPS o temperaturze pokojowej.
Dodaj 300 mikrolitrów TRIzolu do każdej górnej komory i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W międzyczasie oznacz mikroprobówki wirówkowe dla każdej studzienki i dodaj 700 mikrolitrów TRIzolu do każdej probówki. Zebrać homogenat komórkowy, delikatnie pipetując trzykrotnie w górę i w dół za pomocą P1000, a następnie przenieść zawartość do odpowiednich probówek do mikrowirówek.
Wiruj przez pięć sekund, aby wymieszać. Utrzymuj próbki w temperaturze pokojowej przez dodatkowe trzy minuty, a następnie kontynuuj stosowanie standardowych protokołów QRTPCR lub przechowuj próbki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Aby zweryfikować różnicowanie komórek M za pomocą immunofluorescencji, najpierw usuń pożywkę z górnej komory.
Delikatnie umyć dwa razy 300 mikrolitrami PBS o temperaturze pokojowej. Dodaj 100 mikrolitrów 4% PFA w PBS o temperaturze pokojowej do górnej komory. Przykryj talerz folią i odstaw na 25 minut w temperaturze pokojowej.
Po usunięciu PFA umyć górną komorę trzykrotnie 300 mikrolitrami PBS o temperaturze pokojowej. Inkubować monowarstwy ze 100 mikrolitrami 5% BSA rozpuszczonego w PBS przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej, aby zablokować monowarstwy przed usunięciem roztworu. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego GP2 w jednym procencie BSA w PBS w rozcieńczeniu od jednego do 100 i dodać 100 mikrolitrów na studzienkę.
Plamić przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności, przed usunięciem roztworu. Umyj górną komorę trzykrotnie 300 mikrolitrami PBS o temperaturze pokojowej. Przygotuj wtórny roztwór barwienia z fluorescencyjnie znakowanej kozy anty-mysiej falloidyny IgG i DAPI i dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę.
Plamić przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj studzienki trzykrotnie 300 mikrolitrami PBS. Następnie umieść pięciomikrolitrową kroplę roztworu montażowego na szklanym szkiełku.
Wyjmij studzienkę z płytki 24-dołkowej i odwróć. Podczas wyjmowania membrany z Transwell, membrana musi pozostać całkowicie płaska. Wybrzuszenia w membranie uniemożliwiają mocne uszczelnienie szkiełka i mogą znacznie wpłynąć na jakość obrazu.
Aby zapewnić sukces, ostrożnie odetnij membranę ze studni za pomocą ostrego skalpela. Umieść membranę komórkami skierowanymi do góry na kropli roztworu montażowego na szkiełku podstawowym. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu montażowego na górę i środek membrany i umieść szkiełko nakrywkowe na górze, aby uszczelnić membranę między szkiełkiem szklanym a szkiełkiem nakrywkowym.
Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności przez 24 godziny. Limfocyty M są wykrywane przez powierzchniową ekspresję GP2 przez immunofluorescencje. Zazwyczaj w zlewającej się monowarstwie obserwuje się od jednej do pięciu komórek M w danym polu mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu w dniach od sześciu do ośmiu po wysiewie w próbkach traktowanych RANKL i TNF alfa.
W próbkach niepoddanych działaniu substancji nie obserwuje się ekspresji GP2. Ortogonalny widok płaszczyzny XZ nałożonej sondą falloidynową pokazuje struktury aktyny otaczające każdą komórkę i ekspresję GP2 na wierzchołkowej powierzchni komórek M. Model ten podsumowuje niską częstotliwość limfocytów M znajdujących się w jelicie człowieka.
Aby określić, czy komórki M rozwinięte w tym modelu są w stanie wiązać się z IgA, obecność IgA na komórkach M jest wizualizowana za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorem, które rozpoznaje ciężki łańcuch IgA w surowicy ludzkiej. Limfocyty M traktowane IgA przez godzinę mają IgA związane z powierzchnią wierzchołkową, podczas gdy komórki M w studzienkach kontrolnych, które były traktowane tylko drugorzędowym przeciwciałem przeciwko IgA, nie mają wykrywalnego sygnału. Co więcej, IgA specyficznie wiąże się z wierzchołkową powierzchnią komórek M i nie jest związana z żadnymi komórkami pozbawionymi barwienia powierzchni GP2.
Ponadto komórki M mają charakterystycznie krótszą gęstą aktynę na swojej powierzchni wierzchołkowej. Przejście na pożywki różnicujące uzupełnione RANKL TNF alfa, gdy monowarstwy są w około 80% zlewne, jest kluczem do osiągnięcia dobrego różnicowania komórek M. Technika ta pozwoli naukowcom na zbadanie kwestii związanych z rozwojem komórek M, a także interakcjami patogenów gospodarza i badaniami transportu leków z udziałem komórek M.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje różnicowanie komórek M z jednowarstwowych hodowli jelita cienkiego (ileum) pochodzących z ludzkich komórek macierzystych oraz metody oceny ich rozwoju. Zrozumienie funkcji komórek M jest kluczowe dla badania homeostazy jelitowej i obrony immunologicznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Immunologia
Wstęp
- Komórki M występują rzadko w jelitach, co utrudnia ich badanie.
- Indukowana różnicowanie pozwala na lepsze zrozumienie roli komórek M.
- Kultury ludzkich komórek macierzystych jelita stanowią model do tych badań.
- Metody oceny obejmują qRT-PCR oraz immunofluorescencję.
Cel badania
- Indukcja różnicowania komórek M w monowarstwach jelita cienkiego (ileum).
- Opracowanie metod oceny rozwoju komórek M.
- Pogłębienie zrozumienia funkcji komórek M w układzie odpornościowym.
Zastosowane metody
- Powlekanie membran Transwell macierzą zewnątrzkomórkową.
- Izolacja i dysagregacja enteroidów jelita cienkiego.
- Aplikacja pośrodków do hodowli komórkowej i różnicowania.
- Weryfikacja różnicowania za pomocą QRTPCR i immunofluorescencji.
Główne wyniki
- Skuteczna różnicowanie komórek M z kultur pochodzących z komórek macierzystych.
- Opracowanie metod oceny rozwoju komórek M.
- Wykazanie potencjału do badania funkcji komórek M.
Wnioski
- Niniejszy protokół zapewnia niezawodną metodę różnicowania komórek M.
- Otwiera on możliwości dalszych badań nad odpornością jelitową.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zbadania roli komórek M.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia generowanie powtarzalnego modelu ludzkich komórek M z enteroidów jelita krętego pochodzących z komórek macierzystych, co rozwiązuje problem niedoboru pierwotnych komórek M do badań nad immunologią i oddziaływaniami patogenów. Zapewniając skalowalny system do badania transportu antygenów i odporności śluzówkowej, model ten wspiera walidację celów w opracowywaniu leków żołądkowo-jelitowych oraz w badaniach nad szczepionkami. Model ułatwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku leków biologicznych i terapii doustnych, których działanie opiera się na wchłanianiu zapośredniczonym przez komórki M.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zależnych od komórek M szlaków transcytozy antygenów w celu walidacji celów w odporności śluzówkowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odnawialny system istotny dla ludzi, co pozwala ograniczyć zależność od rzadkich izolacji z tkanek pierwotnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych wyników, takich jak ekspresja powierzchniowa GP2 i wiązanie IgA, w celu standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Wspiera zastosowania w obrazowaniu wysokotreściowym (high-content imaging) oraz cytometrii przepływowej do przesiewowego wyznaczania modulatorów różnicowania lub funkcji komórek M.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje biologię komórek M jelita ludzkiego w celu oceny wiązania patogenów oraz mechanizmów transportu leków podawanych doustnie.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przedkliniczną ewaluację leków biologicznych i nanocząsteczek zaprojektowanych do dostarczania celowanego w komórki M.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, dostarczając zróżnicowany model nabłonkowy do weryfikacji hipotez w zakresie immunologii śluzówkowej oraz dostarczania leków drogą doustną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację funkcjonalną markerów specyficznych dla komórek M oraz mechanizmów pobierania antygenów.
- Przesiewy: Umożliwia opracowanie testów do ilościowego określania wydajności różnicowania komórek M oraz wiązania ligandów.
- Analityka: Generuje dane z QRTPCR i immunofluorescencji do analizy porównawczej warunków różnicowania.
- Badania translacyjne: Wiąże się z badaniami przedklinicznymi nad skutecznością doustnych szczepionek oraz translokacją drobnoustrojów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną platformę z indukowalnym różnicowaniem do wielokrotnego zastosowania w projektach z zakresu immunologii i farmakologii.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie procesów pośredniczących w komórkach M dzięki zastosowaniu powtarzalnego modelu ludzkiego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje różnicowanie poprzez stymulację RANKL i TNF-α, co zmniejsza zmienność w uzysku komórek M.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) nad doustnymi lekami biologicznymi poprzez przewidywanie potencjału wchłaniania przez błonę śluzową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o biodostępność zależną od komórek M.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, obsłudze enteroidów oraz technikach polaryzacji nabłonka.
- Zależnie od systemów Transwell, powlekania macierzą zewnątrzkomórkową oraz suplementacji cytokinami (RANKL, TNF-α).
- Konieczna jest standaryzacja czasu różnicowania oraz progów konfluencji (~80%) w celu zapewnienia spójnej indukcji komórek M.
- Wymaga optymalizacji w liniach enteroidów pochodzących od różnych dawców, aby uwzględnić zmienność wydajności różnicowania.
- Ograniczone przez niską częstotliwość generowania komórek M (1–5 na pole widzenia), co wymusza zastosowanie czułych metod detekcji, takich jak immunofluorescencja.
