Name: Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metody inokulacji blastospor Metarhizium i zbierania hemolimfy u kleszczy Rhipicephalus microplus. Techniki te umożliwiają badanie odpowiedzi immunologicznej bezkręgowców na infekcje grzybicze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) z Brazylii, kod finansowy 001. CAPES zapewniło stypendium doktoranckie dla A.F. Marciano. Dziękujemy Krajowej Radzie Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq) Brazylii za udzielenie stypendium doktoranckiego dla J. Fiorottiego. Badania te były również wspierane przez granty Fundacji Carlosa Chagasa Filho na rzecz Badań Stanu Rio de Janeiro (FAPERJ) i CNPq. V.R.E.P. Bittencourt jest badaczem CNPq.

Kleszcze użyte w niniejszym badaniu zostały uzyskane ze sztucznej kolonii, prowadzonej na Federalnym Uniwersytecie Wiejskim w Rio de Janeiro, której metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Wykorzystania Zwierząt Kręgowych (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Kleszcz nabrzmiałe samice
<ol>
	<li>Po zebraniu kleszczy umyj nabrzmiałe samice wodą z kranu i zanurz je w 0,5% (v/v) roztworze podchlorynu sodu na 3 minuty w szklanej zlewce o pojemności 500 ml w celu higieny skórek (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1), a następnie osusz wszystkie samice za pomocą sterylnych ręczników papierowych (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Podziel samice na jednorodne grupy ważone (po 20 samic każda): jedna grupa bez żadnego leczenia, jedna grupa kontrolna zaszczepiona 5 μl 0,1% wodnego roztworu monooleinianu polioksyetylenosorbitanu (v/v) i jedna grupa zakażona zaszczepiona 5 μl w 1,0 x 10 7 blastospory mL-1, 
	UWAGA: Tylko nieleczone kleszcze były używane do pomiaru objętości i stężenia hemocytów. Wykonano trzy powtórzenia każdej grupy.</li>
</ol>
2. Inokulacja patogenów między tarczką a główką
UWAGA: W niniejszym badaniu, entomopatogeniczne zawiesiny grzybów zostały użyte jako przykład.
<ol>
	<li>Zawiesić blastospory grzybów w 1 ml 0,1% wodnego roztworu monooleinianu polioksyetylenosorbitanu (v/v) i dostosować do końcowego stężenia 1,0 x 107 blastospor mL-1. Dodać porcję 5 μl zawiesiny blastospor Metarhizium (<klasa silna="xfig">Rysunek 3) na powierzchnię folii parafinowej z tworzywa sztucznego. 
	UWAGA: Zawiesinę blastospor Metarhizium dostosowano za pomocą komory Neubauera. Aby przyspieszyć proces zaszczepiania, do powierzchni folii parafinowej z tworzywa sztucznego można dodać wiele pęcherzyków, z których każdy odpowiada 5 μl.</li>
	<li>Użyj ultracienkiej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i igły 0,3 mm, aby pobrać zawiesinę i wprowadzić ją do kleszcza. Należy pamiętać, aby przed użyciem strzykawki usunąć całe powietrze.</li>
	<li>Zaszczepić 5 μl zawiesiny grzybów w samicy kleszcza między scutum a capitulum. Zaszczepić samice z grupy kontrolnej 5 μl 0,1% wodnego roztworu monooleinianu polioksyetylenosorbitanu (v/v) bez grzyba. 
	UWAGA: Niewielka objętość hemolimfy może być obecna na otworze po wkłuciu igły. Uważaj, aby nie zaszczepić powietrza.</li>
</ol>
3. Inokulacja grzybów entomopatogenicznych między udem nogi a ciałem samicy kleszcza
<ol>
	<li>Zaszczepić samice zawiesiną grzybów (5 μl przy 1,0 x 107 blastosporach mL-1) między nogą a ciałem samicy, używając ultracienkiej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml połączonej z igłą 0,3 mm. Zaszczepić samice z grupy kontrolnej 5 μl 0,1% wodnego roztworu monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (v/v). 
	UWAGA: Gdy inokulacja blastospor Metarhizium jest wykonywana między nogą tigh a ciałem samicy kleszcza, niewielka objętość hemolimfy może być obecna na tigh po wkłuciu igły. Uważaj, aby nie zaszczepić powietrza.</li>
</ol>
4. Grzbietowa kolekcja hemolimfy
<ol>
	<li>Użyj gumowej części zestawu do infuzji ze skrzydełkami, rurki kapilarnej 0,3 mm i końcówki z filtrem, aby wykonać pobranie hemolimfy.</li>
	<li>Rozciąć żeński naskórek grzbietowy za pomocą igły 0,3 mm.</li>
	<li>Po przerwaniu należy delikatnie uciskać przednią część ciała kleszcza. Obserwuj, jak prawie przezroczysta ciecz wydostaje się z miejsca zakłócenia. Zebrać hemolimfę, zasysając płyn przez końcówkę filtra sprzężoną z gumową częścią zestawu do infuzji ze skrzydełkami i rurką kapilarną 0,3 mm. 
	UWAGA: Nie naciskaj mocno ciała kleszcza podczas jego unieruchomienia, ponieważ może to zakłócić pracę jelita środkowego i zanieczyścić hemolimfę. Poczekaj, aż delikatne ciśnienie usunie płyn bez zanieczyszczenia.</li>
</ol>
5. Kolekcja hemolimfy z nogi kleszcza
<ol>
	<li>Unieruchom kleszcza, odetnij kawałek przedniej nogi nożyczkami. 
	UWAGA: Można przyciąć jedną lub więcej nóg, a także tę samą nogę można przyciąć więcej niż jeden raz.</li>
	<li>Delikatnie uciskaj tylną część ciała kleszcza. Obserwuj przezroczysty pęcherzyk cieczy, który pojawia się w miejscu cięcia i zbierz go rurką kapilarną, jak opisano w kroku 4.3. 
	UWAGA: Nie naciskaj mocno ciała kleszcza podczas jego unieruchomienia, ponieważ może to zakłócić pracę jelita środkowego i zanieczyścić hemolimfę. Poczekaj, aż delikatne ciśnienie usunie płyn bez zanieczyszczenia.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie hemolimfy
<ol>
	<li>Po pobraniu hemolimfy umieść ją w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml uprzednio wypełnionych 30 μl koktajlu proteazy i 82 μl buforu soli fizjologicznej. Trzymaj mikroprobówki na lodzie przez cały czas trwania kolekcji hemolimfy.</li>
	<li>Odwirować próbki (500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C). Po odwirowaniu hemocyfy utworzy się miękka osada hemocytów. 
	UWAGA: W celu ilościowego oznaczania hemolimfy należy określić ilościowo objętość hemolimfy uzyskaną przez zliczenie całkowitej objętości wewnątrz mikroprobówki i odjęcie objętości koktajlu proteazy i buforu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant (hemolimfę bezkomórkową). Delikatnie zawieś komórki, na przykład w kulturze L-15 firmy Leibovitz dostosowanej do pH 7,0-7,2. Określ ilościowo hemocyty, umieszczając 10 μl zawieszonych hemocytów w komorze Neubauera.</li>
</ol>
7. Przygotowanie preparatu do pobierania próbek hemocytu
<ol>
	<li>Odetnij przednią nogę kleszcza nożyczkami.</li>
	<li>Delikatnie uciskaj tylną część ciała kleszcza. Obserwuj przezroczysty pęcherzyk cieczy, który pojawia się w miejscu cięcia.</li>
	<li>Nałóż krople hemolimfy bezpośrednio na czyste szkiełka mikroskopowe, a następnie użyj odpowiednich metod do barwienia komórek.
	<ol>
		<li>Aby wybarwić hemocyty za pomocą Giemsy, wysusz hemolimfę na szkiełku na powietrzu przez 30 minut, utrwal ją w temperaturze pokojowej metanolem przez 3 minuty i zabarwij w roztworze Giemsy (stosunek 1:9 roztworu buforowego Sorensena, pH 7,2) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka pod bieżącą wodą, aby usunąć nadmiar barwnika, wysusz szkiełko na powietrzu i oceń komórki pod kątem 400x w mikroskopie optycznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Parasitologia+Veterin%C3%A1ria%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).</li>
<li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li>
<li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li>
<li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li>
<li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+C%3A+Toxicology+and+Pharmacolpgy%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li>
<li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+on+the+surface%3A+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li>
<li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li>
<li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium%3A+unveiling+hemocyte+quantification%2C+GFP-fungi+virulence%2C+and+ovary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li>
<li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li>
<li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+%26+Environmental+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li>
<li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNation%2C+JL+%22Insect+Physiology+and+Biochemistry%22">Insect Physiology and Biochemistry</a>. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).</li>
<li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%A9moires+de+l%27Acad%C3%A9mie+royale+des+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Torino%22%5BJournal%5D)">Mémoires de l'Académie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751(1848).</li>
<li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organ+waxing+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Quarterly+Journal+of+the+Mythic+Society%22%5BJournal%5D)">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+ticks%22">Biology of ticks</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li>
<li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+%28Homarus+americanus%29+and+the+European+lobster+%28Homarus+gammarus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Research%22%5BJournal%5D)">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li>
<li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+immunity+and+its+signaling%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Survival+Journal%22%5BJournal%5D)">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li>
<li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li>
<li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%2C+salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Inokulacja patogenów jest przydatna, gdy badanie ma na celu zbadanie działania mikroorganizmów in vivo w eksperymentalnych modelach stawonogów, ponieważ zapewnia, że patogen znajduje się wewnątrz gospodarza. Technika ta może być również stosowana do inokulacji cząsteczek, takich jak interferencja RNA (RNAi). Inokulacja między scutum a capitulum jest uważana za łatwiejszą do przeprowadzenia, ale często uszkadza narząd Genégo, pogarszając żywotność jaj12,13. Narząd...

Kleszcz bydlęcy, Rhipicephalus microplus, jest ektopasożytem hematophagu o ogromnym negatywnym wpływie na zwierzęta gospodarskie w obszarach tropikalnych. Kleszcz ten jest wektorem czynników chorobotwórczych, takich jak Babesia bovis, Babesia bigemina i Anaplasma marginale, które w połączeniu z bezpośrednim uszkodzeniem hemoodżywiania mogą zmniejszyć produkcję mleka i mięsa, spowodować anemię i ostatecznie śmierć. Straty spowodowane przez tego ektopasożyta oszacowano na 3,24 miliarda dolarów rocznie w Brazil1. Potrzebne są zrównoważone metody, a stosowanie czynników entomopatogenicznych jest uważane za obiecującą alternatywę dla ograniczenia stosowania chemicznych akarycydów2,3,4.
Grzyby entomopatogeniczne, takie jak Metarhizium spp., są naturalnymi wrogami stawonogów, w tym kleszczy, a niektóre izolaty mogą być używane jako biokontrolery. Patogeny te aktywnie infekują żywiciela przez naskórek i kolonizują jego ciało2,5,6. W miarę rozwoju infekcji w odpowiedziach komórkowych i humoralnych pośredniczy układ odpornościowy kleszcza. Analiza hemolimfy kleszczowej jest przedstawiana jako użyteczne narzędzie do oceny odpowiedzi immunologicznej po zmaganiach z patogenami7,8.
Odpowiedź immunologiczna stawonogów dzieli się na humoralną i komórkową. Odpowiedź humoralna obejmuje procesy hemaglutynacji i produkcję białek/peptydów przeciwdrobnoustrojowych, podczas gdy komórkowa odpowiedź immunologiczna odbywa się za pośrednictwem hemocytów. Komórki te są obecne w hemolimfie od wszystkich stawonogów i doniesiono, że rozwijają ekspresyjną rolę w badaniach dotyczących wrodzonej odpowiedzi immunologicznej9, ponieważ jest to bezpośrednio związane z procesami fagocytozy i enkapsulacji. W związku z tym badania nad hemocytami mogą pomóc w zbadaniu szlaku śmierci i zrozumieniu procesów takich jak autofagia, apoptoza i martwica. U niektórych bezkręgowców jako małży kolekcja hemocytów napotyka ograniczenia, takie jak rozerwanie komórek, niska uzyskana objętość hemolimfy i niska koncentracja odzyskanych komórek10. Bardzo często, w zależności od zastosowanej metodyki, uzyskuje się obniżoną koncentrację komórek, co ma bezpośredni wpływ na kwantyfikację i analizę komórek.
Liczba hemocytów krążących w hemolimfie jest zmienna u różnych stawonogów i może się zmieniać u tego samego gatunku ze względu na różne etapy fizjologiczne, takie jak płeć, wiek i stadium rozwoju stawonoga11. Hemocyty można również znaleźć przyległe do niektórych narządów i być uwalniane do krążenia zaraz po procesie infekcji11. Niemniej jednak większość badań wykazała, że wykorzystuje się owady, podczas gdy kleszcze pozostają mniej zbadane pod względem ich fizjologii i patologii. Pomimo tego, że inokulacja patogenów i zbieranie hemolimfy u kleszczy są mniej stosowanymi technikami, ustalenie standardowych metod pomaga w opracowaniu dokładniejszych badań.
Celem niniejszego badania było porównanie najczęściej stosowanych metod zbierania hemolimfy i inokulacji patogenów u kleszczy R. microplus, oceniając skuteczność w pozyskiwaniu hemocymfy i koncentracji hemocytów.

<table><tbody><tr><td>Alkaliczny roztwór podchlorynu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1727</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Synth</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczna guma</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Giemsa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48900-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kapilarna</td><td>CTechGlass</td><td>CT95-02</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa (igła)</td><td>BD</td><td>SKU:&nbsp; 324910</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014512</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana L-15 firmy Leibovitz&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R Szkiełka</td><td></td></tr><tr><td>mikroskopowe</td><td>Kasvi</td><td>K5-7105</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki</td><td>BRAND</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014593</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Komora Neubauera&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K5-0111</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr></tbody></table>

ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor metarhizium do kleszczy rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Kleszcze są obowiązkowymi hematofagicznymi ektopasożytami, a Rhipicephalus microplus ma duże znaczenie w medycynie weterynaryjnej, ponieważ powoduje anemię, utratę wagi, deprecjację skóry zwierząt, a także może działać jako wektor wielu patogenów. Ze względu na wygórowane koszty zwalczania tych pasożytów, szkody w środowisku spowodowane niewłaściwym stosowaniem chemicznych akarycydów oraz zwiększoną odporność na tradycyjne środki pasożytobójcze, alternatywne zwalczanie kleszczy, na przykład za pomocą grzybów entomopatogenicznych, zostało uznane za interesujące podejście. Niemniej jednak niewiele badań wykazało, w jaki sposób układ odpornościowy kleszcza działa w walce z tymi entomopatogenami. Dlatego protokół ten demonstruje dwie metody stosowane do inokulacji entomopatogenów u nabrzmiałych samic oraz dwie techniki stosowane do zbierania hemolimfy i hemocytów. Inokulacja patogenów w miejscu wprowadzenia nogi do ciała samicy kleszcza pozwala na ocenę parametrów biologicznych samic, w przeciwieństwie do inokulacji między scutum a capitulum, która często uszkadza narząd Gené. Kolekcjonowanie hemolimfy grzbietowej przyniosło większy odzysk objętości niż pobieranie przez nogi. Niektóre ograniczenia w zbieraniu i przetwarzaniu hemolimfy kleszczowej obejmują i) wysokie wskaźniki rozerwania hemocytów, ii) zanieczyszczenie hemolimfy z zakłóconym jelitem środkowym oraz iii) niski odzysk objętości hemolimfy. Kiedy hemolimfa jest zbierana przez cięcie nogi, hemolimfa potrzebuje czasu, aby zgromadzić się w otworze nogi, sprzyjając procesowi krzepnięcia. Ponadto w kolekcji przez nogę uzyskuje się mniej hemocytów w porównaniu z kolekcją grzbietową, mimo że pierwsza metoda jest uważana za łatwiejszą do wykonania. Zrozumienie odpowiedzi immunologicznej u kleszczy, w której pośredniczą czynniki entomopatogeniczne, pomaga odkryć ich patogenezę i opracować nowe cele do zwalczania kleszczy. Opisane tu procesy inokulacji wymagają bardzo niskich zasobów technologicznych i mogą być wykorzystywane nie tylko do wystawiania kleszczy na działanie mikroorganizmów chorobotwórczych. Podobnie, pobranie hemolimfy kleszczowej może stanowić pierwszy krok dla wielu badań fizjologicznych.

Niniejszy artykuł przedstawia metody inokulacji i pobierania hemolimfy stosowane u kleszczy. Po wykonaniu inokulacji pomiędzy podstawą odnóża a ciałem samicy kleszcza, w trakcie procesu może dojść do wydzielenia niewielkiej ilości płynu (hemolimfy); należy jednak zauważyć, że po zakończeniu inokulacji na końcówce igły oraz w miejscu wkłucia nie powinno znajdować się żadne ciecze ani tkanki, co zapewnia całkowite wprowadzenie zawiesiny grzybowej. Przy prawidłowym przeprowadzeniu procesu in...

Analiza hemolimfy kleszczowej stanowi ważne źródło informacji o tym, jak niektóre patogeny wywołują choroby i jak kleszcze reagują immunologicznie na tę infekcję. Niniejsze badanie pokazuje, jak zaszczepić propagule grzybów i zebrać hemolimfę od nabrzmiałych samic Rhipicephalus microplus.

Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Kleszcze są krwiotwórczymi ektopasożytami, Rhipicephalus microplus, popularnie znany jako kleszcz bydła, ma ogromny negatywny wpływ ekonomiczny na zwierzęta gospodarskie na obszarach tropikalnych. Ponadto rosnące obawy związane ze zdegradowanymi warunkami środowiskowymi i obawy o zdrowie publiczne spowodowane niewłaściwym stosowaniem chemicznych akarycydów i rosnącą odpornością populacji kleszczy na tradycyjne pasożyty, stymulują badania nad alternatywnymi metodami zwalczania, takimi jak stosowanie grzybów entomopatogenicznych. Te entomopatogeny aktywnie infekują żywicieli stawonogów przez ich naskórek i kolonizują ich ciało.Stawonogi mogą mieć różne reakcje na infekcję grzybiczą. Układ odpornościowy stawonogów dzieli się na odpowiedzi humoralne i komórkowe. Odpowiedź humoralna obejmuje proces hemaglutynacji i produkcję cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych, podczas gdy hemocyty pośredniczą w komórkowej odpowiedzi immunologicznej.Większość badań nad odpowiedzią immunologiczną stawonogów jest opisywana przy użyciu owadów, podczas gdy reakcje kleszczy pozostają mniej zbadane. Również inokulacja patogenów i zbieranie hemolimfy kleszczowej są słabo rozpowszechnionymi technikami niezbędnymi do lepszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej stawonogów. W związku z tym, ta technika adresowania wideo \ używana do filmowania inokulacji, zbierania i przetwarzania hemolimfy.Ponieważ zbieranie hemocytów kleszczy napotyka pewne ograniczenia, takie jak rozerwanie komórek, uzyskanie niskiej wartości hemolimfy i niskie stężenie odzyskanych komórek. Bezpośrednie zakażenie na konfigurację i analizę komórek. Po zebraniu kleszczy umyj nabrzmiałe samice.Użyj wody z kranu i zanurz je w 0,5% roztworze podchlorynu sodu na trzy minuty w szklanej zlewce o pojemności 500 mililitrów. Aby zapewnić higienę skórek, podziel samice na jednorodne grupy po 20 samic każda. Wykonano trzy powtórzenia każdej grupy.W procesie inokulacji wykorzystano blastospory Metarhizium robertsii. Dodać do cieczy o objętości pięciu mikrolitrów zawiesiny blastospory metarhizium na powierzchnię plastikowej folii parafinowej. Aby przyspieszyć proces zaszczepiania, do powierzchni plastikowej folii parafinowej można dodać wiele pęcherzyków, z których każdy odpowiada pięciu mikrolitrom.Użyj ultracienkiej strzykawki insulinowej o średnicy jednego milimetra i igły o średnicy 0,3 milimetra, aby nałożyć zawiesinę i zaszczepić ją w kleszczu. Należy pamiętać, aby przed użyciem strzykawki usunąć całe powietrze. Zaszczepić 5 mikrolitrów zawiesiny grzybów w samicy kleszcza między scutum a capitulum.Niewielka objętość hemolimfy może być obecna na obramowaniu po nacięciu igły. Uważaj, aby nie zaszczepić powietrza. Zaszczepić samice zawiesiną grzyba między udem nogi a ciałem samicy za pomocą jednomililitrowej ultracienkiej strzykawki insulinowej połączonej z igłą o średnicy 0,3 milimetra.Gdy inokulacja blastospor metarhizium jest wykonywana między udem nogi a ciałem samicy kleszcza, po wkłuciu igły na udzie może znajdować się niewielka objętość hemolimfy. Uważaj, aby nie zaszczepić powietrza. Użyj gumowej części zestawu do naparu ze skrzydełkami, rurki kapilarnej 0,3 milimetra i końcówki filtrującej, aby wykonać pobranie hemolimfy.Przeciąć żeński naskórek grzbietowy za pomocą igły o średnicy 0,3 milimetra. Po przerwaniu należy delikatnie uciskać anteryjną część ciała kleszcza. Obserwuj prawie przezroczystą ciecz zbierającą się z miejsca zakłócenia.Zbierz hemolimfę, zasysając płyn przez końcówkę filtra sprzężoną z gumową częścią skrzydełkowego zestawu infuzyjnego i rurką kapilarną o średnicy 0,3 milimetra. Nie należy mocno naciskać na ciało kleszcza podczas jego unieruchomienia, ponieważ może to zakłócić pracę jelita środkowego i zanieczyścić hemolimfę. Poczekaj, aż delikatne ciśnienie usunie płyn bez zanieczyszczenia.Unieruchomić kleszcza. Wytnij kawałek przedniej nogi. Można przeciąć jedną lub więcej nóg, a także tę samą nogę można przeciąć więcej niż jeden raz.Delikatnie uciskaj tylną część ciała kleszcza. Obserwuj, jak po przeciętej stronie pojawia się przezroczysty pęcherzyk cieczy i zbierz go za pomocą rurki kapilarnej. Nie należy mocno naciskać na ciało kleszcza podczas jego mobilizacji, ponieważ może to zakłócić pracę jelita środkowego i zanieczyścić hemolimfę.Poczekaj, aż delikatne ciśnienie usunie płyn bez zanieczyszczenia. Po pobraniu hemolimfy umieść ją w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra, uprzednio wypełnionej 30 mikrolitrami koktajlu proteazy i 82 mikrolitrami soli fizjologicznej. Trzymaj mikroprobówki na lodzie przez cały czas trwania kolekcji hemolimfy.Próbki wirówki i miękkie osady hemocytów zostaną utworzone po odwirowaniu hemolimfy. W celu ilościowego oznaczania hemolimfy należy określić ilościowo uzyskaną objętość hemolimfy, licząc całkowitą objętość wewnątrz mikroprobówki i dyskontując objętość koktajlu proteazy i buforu soli fizjologicznej. Ostrożnie usuń supernatant, bezkomórkową hemolimfę i delikatnie ponownie zawieś komórki.Określić ilościowo hemocyty, umieszczając 10 mikrolitrów ponownie zawieszonych hemocytów w komorze Neubauera. Do resublimacji komórek użyto pożywki hodowlanej. Przeciąć przednią nogę kleszcza, delikatnie docisnąć tylną część ciała kleszcza, obserwować, jak w miejscu cięcia pojawia się przezroczysty pęcherzyk cieczy.Nałóż krople hemolimfy bezpośrednio na czyste szkiełka mikroskopowe. Następnie użyj odpowiednich metod, aby wybarwić komórki. Inokulacja między nogą, udem a ciałem samicy kleszcza może również uszkodzić narządy wewnętrzne kleszcza, takie jak jelito środkowe i kanaliki malpighiana.Kiedy jelito środkowe kleszcza zostaje przerwane przez igłę w grzbietowym pobraniu hemolimfy, uzyskany płyn jest czerwony, a nie przezroczysty. Wskazuje to na nieprawidłową kolekcję hemolimfy. W takim przypadku hemolimfę należy wyrzucić, ponieważ jest zanieczyszczona.Zakażenie hemolimfą można również zaobserwować, gdy kleszcz jest naturalnie zakażony dużym obciążeniem patogenami lub w końcowych etapach procesu śmierci spowodowanego przez zaszczepione patogeny. Objętość hemolimfy uzyskana po pobraniu grzbietowym jest większa niż objętość uzyskana podczas pobrania przez nogę. Pomimo łatwości zanieczyszczenia jest wyższa w pierwszej metodzie zbierania.Stężenie hemocytów było również istotnie wyższe w kolekcji grzbietowej. Po prawidłowym pobraniu hemocytów można uzyskać dobry rozmaz i można rozróżnić różne hemocyty po barwieniu. Film ten dostarczył informacji na temat metod inokulacji patogenów, w szczególności grzybów entomopatogenicznych, kleszczom i pobierania ich hemolimfy.Przedstawione tutaj techniki wymagają bardzo niskich zasobów technologicznych w naszych klasycznych krokach do badań nad fizjologią kleszczy, patologią kleszcza i odpowiedzią immunologiczną kleszcza. Prawidłowe pobranie komórek stawonogów i bezkomórkowej hemolimfy ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych informacji dla kolejnych badań. Z tego powodu ważne jest również, aby zdawać sobie sprawę z najczęstszych błędów obserwowanych podczas wykonywania tych technik.Dodatkowo, propozycje tego badania powinny określić bardziej odpowiednie miejsce do pobrania hemolimfy poprzez deformację lub przecięcie nóg, biorąc pod uwagę różnicę w uzyskanej objętości i prawdopodobieństwo zanieczyszczenia.

disclosing-hemolymph-collection-inoculation-metarhizium-blastospores

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Obecny protokół opisuje izolację mikroRNA z gruczołów ślinowych kleszczy i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Jest to uniwersalna procedura, która łączy w sobie powszechnie używane odczynniki i materiały eksploatacyjne. Metoda pozwala również na użycie niewielkiej liczby kleszczy, co skutkuje wysokiej jakości mikroRNA, które można łatwo zsekwencjonować.

Izolacja mikroRNA z kultur gruczołów ślinowych ex vivo kleszczy i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Elektroporacja to szybka, szeroko stosowana metoda wprowadzania egzogennego DNA do rodzaju Rickettsia. Protokół ten zapewnia użyteczną metodę elektroporacji do transformacji obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych w rodzaju Rickettsia.

Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Ten artykuł przedstawia metodologię wystawiania ludzi na działanie larw Ixodes scapularis do badań klinicznych. Technika jest stosunkowo prosta, tolerowana przez ochotników biorących udział w badaniu i może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Takie badania z udziałem ludzi muszą być prowadzone zgodnie z protokołami badań klinicznych zatwierdzonymi przez właściwe organy regulacyjne.

Model eksperymentalnego narażenia ludzi na larwy kleszczy Ixodes scapularis

Przedstawiamy protokół polegający na zbieraniu śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita po sekcji pojedynczego karmionego kleszcza, aby badać specyficzną lokalizację patogenów przenoszonych przez kleszcze w tkankach i pogłębić zrozumienie kompetencji wektorów oraz interakcji patogen-mikrobiom.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

Metoda ta opisuje opracowanie systemu żywienia krwią kleszczy in vitro , wykorzystującego komorę drukowaną w 3D oraz laboratoryjnie wykonaną membranę silikonową. System umożliwia sztuczne karmienie kleszczy, umożliwiając łatwe pobieranie próbek na różnych etapach karmienia oraz wykorzystując niewielkie ilości krwi, stanowiąc nieocenione narzędzie do badania kleszczy ixoidied.

Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida

Poznaj metody inokulacji blastospor Metarhizium i zbierania hemolimfy u kleszczy Rhipicephalus microplus. Techniki te umożliwiają badanie odpowiedzi immunologicznej bezkręgowców na infekcje grzybicze.

Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców (Wideo) | JoVE Journal

Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

Przeglądaj więcej filmów