Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych
31 sierpnia 2019
To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.
Zostanie zademonstrowane przygotowanie nanokapsułek liposomalnych techniką ekstruzji krok po kroku w uwięzieniu taryny o mocy 48 kilodaltonów globularnych w białku hydrofilowym oczyszczonym z Colocasia esculenta. Wszystkie procedury charakterystyki nanokapsułek obejmują skaningową mikroskopię elektronową, a także dynamiczne rozpraszanie światła. Procedury kapsułkowania mogą napotkać pewne wyzwania, od wyboru lipidów po osiągnięcie wysokiej wydajności enkapsulacji, utrzymującej bioaktywność uwięzionych cząsteczek.
Protokół, który zostanie opisany, może przezwyciężyć niektóre z tych trudności. Zważyć składniki liposomu za pomocą wagi analitycznej. Rozpuść składniki lipidowe w chloroformie za pomocą kolby miarowej, która pasuje do wyparki obrotowej, aby uniknąć strat materiału.
Mieszaj mieszaninę przy 150 obr./min przez 15 minut. Usunąć chloroform za pomocą wyparki obrotowej. Ustaw wylot kolby miarowej w pozycji standardowej, aby uzyskać najlepszą wydajność, w kontakcie z wodą z łaźni grzewczej.
Ustaw parametry zgodnie z opisanym protokołem. Po około 25 minutach wyjąć kolbę i odpowiednio wyrzucić odparowany rozpuszczalnik. Tworzy się cienka i nieprzezroczysta folia, którą można łatwo zwizualizować.
Uwodnić film lipidowy w roztworze siarczanu amonu zawierającym tarynę w ilości jednego miligrama na mililitr. Mieszaj mieszaninę przez 40 minut i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie sonikować zawiesinę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej 25 stopni Celsjusza.
Aby zmniejszyć rozmiar pęcherzyków i uniknąć agregacji, umieść membranę poliwęglanową między dwoma wstępnie zwilżonymi wspornikami filtra i umieść ją w uchwycie. Włóż jedną pustą strzykawkę do urządzenia, drugą napełnij jednym mililitrem zawiesiny liposomalnej i włóż ją po przeciwnej stronie. Wykonaj 12-cyklową ekstruzję przez membranę porową z poliwęglanu o grubości 2 mikrometrów.
Powoli przepychać próbkę z jednej strzykawki do drugiej. Na końcu, zawiesina liposomalna powinna stać się przezroczysta podczas procesu wycieczkowego, w wyniku zmniejszenia rozmiaru. Na tym etapie można stracić około 2 mililitry próbki.
Oddziel liposomy przez ultrawirowanie. Najpierw zważ próbkę do tytanowej rurki i zrównoważ probówki. Sprawdź minimalną objętość do napełnienia i, jeśli to konieczne, dostosuj objętość siarczanem amonu.
Dopasuj tytanowe rurki do wiadra wahadłowego. Otwórz drzwiczki wirówki i umieść w nich wirnik. Zamknij drzwiczki wirówki, naciśnij podciśnienie i poczekaj, aż próżnia osiągnie od 200 do mniej niż 20 mikronów.
Dostosuj parametry na wyświetlaczu ultrawirówki. Naciśnij przycisk Przywołaj, sprawdź warunki i rozpocznij bieg. Po 90 minutach zwolnij próżnię, klikając przycisk odkurzania i otwórz drzwiczki wirówki.
Wyjmij wirnik od wewnątrz. Utrzymuj próbkę ultrawirówki na lodzie, a następnie oddziel supernatant od osadu, obracając probówkę do góry nogami, do jednorazowej wirówki o pojemności 59 mil w celu oddzielenia supernatantu od osadu. Przechowywać supernatant zawierający niekapsułkowane białko w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zostanie to wykorzystane do określenia skuteczności enkapsulacji. Granulka jest prezentowana jako półprzezroczysta galaretka. Zawiesić pelet i podgrzać buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES.
Sprawdź protokół, aby uzyskać więcej informacji. Określ skuteczność enkapsulacji za pomocą protokołu Petersona, aby uniknąć interferencji lipidów w kwantyfikacji białek. Próbki należy analizować w trzech egzemplarzach.
W probówce do mikrofuge rozcieńczyć supernatant lipsomalny lub BSA w ilości jednego miligrama na mililitr wodą do końcowej objętości jednego mililitra. Dodaj DOC i inkubuj przez 10 minut. Dodaj 1 mililitr 72%TCA i dobrze wymieszaj.
Wirować przy 3 000 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant, odchylając probówkę w dół, kładąc ją na chłonnym papierze i pozostawiając do wyschnięcia. Zawieś granulat w jednym mililitrze wody.
Dokładnie wymieszaj, aby upewnić się, że granulka się rozpuściła. Następnie przenieś próbkę do probówek. Dodać jeden mililitr odczynnika A, wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Dodać 5 mililitrów odczynnika B, mieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Określ absorbancję przy 750 nanometrach i oblicz skuteczność enkapsulacji. Średnia wielkości i rozkład wielkości są określane przez dynamiczne rozpraszanie światła.
Przenieś liposomalne nanopęcherzyki do jednorazowej kuwety do sortowania. Zamontuj kuwetę wewnątrz urządzenia. Ustaw parametry sprzętu.
W celu określenia stabilności przechowuj liposomy w temperaturze czterech stopni Celsjusza i regularnie sprawdzaj rozkład wielkości i średnią wielkość. Charakterystyka liposomów za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego jest wykonywana zgodnie z Murta i Ramasamy w trzech egzemplarzach. Przymocuj szkiełka szklanej pokrywy na dnie szalki Petriego za pomocą taśmy.
Pokryj szkiełka nakrywkowe poli-L-lizyną. Umieść mokrą bibułę filtracyjną wewnątrz szalki Petriego, aby utrzymać wilgoć i inkubować przez godzinę. Spłucz wodą destylowaną.
Dodać kroplę próbki i pozostawić do wyschnięcia na godzinę w temperaturze pokojowej. Aby utrwalić próbki, przykryj je aldehydem glutarowym, przygotowanym w buforze fosforanowym. Umieść mokre bibuły filtracyjne wewnątrz szalki Petriego.
Ważne jest, aby uszczelnić szalkę Petriego. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 48 godzin. Przepłukać szkiełka przykrywkowe trzy razy przez pięć minut każdy, tym samym buforem fosforanowym.
Odwodnić próbki w następujący sposób, przemywając roztwór etanolu o rosnącym stężeniu od 35% do etanolu absolutnego. Próbki należy suszyć chemicznie heksametylodilazanem przez 10 minut. Heksametyldisilazan należy ostrożnie manipulować wewnątrz dygestorium.
Próbki należy pozostawić do wyschnięcia przez noc w eksykatorze lub w dygestorium w temperaturze pokojowej. Zamontuj wysuszone próbki na króćcu za pomocą taśmy klejącej przewodzącej węgiel. Rozprysnąć kikuty złotem.
Rejestruj obrazy SEM za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, SEM, w trybie niskiej próżni i niskim napięciu, 20 kilowoltów. Rysunek pierwszy przedstawia preparat nano liposomów. Fosfolipidy, domieszka, peg i chemia, główne składniki liposomów, zostały najpierw rozpuszczone w chloroformie w celu uzyskania filmu lipidowego.
Folia lipidowa została następnie ponownie uwodniona w buforze soli fizjologicznej, zawierającym hydrofilowe białko, tarynę, które miało zostać uwięzione, a inkubację należy przygotować przez noc. Następnie stosuje się sonikację i ekstruzję w celu wytworzenia małych pęcherzyków jednowarstwowych. Etap ultrawirowania oddziela preparat liposomalny od wolnych lipidów i niekapsułkowanego białka.
Podczas gdy supernatant jest używany do oznaczania skuteczności uwięzienia. Nanoliposomy wytworzone przy użyciu wyżej wymienionej metodologii wykazują rozkład wielkości w zakresie od 51 do 396 nanometrów, a średnia wielkość wynosi 155 nanometrów. Preparat jest jednorodny, ponieważ wskaźnik polidyspersyjności wynosi 168.
Wysoka skuteczność uwięzienia wynosząca 83% jest osiągana, jeśli liposomy są wytłaczane przez membranę o wielkości porów 2 mikrometrów. Cechy morfologiczne nanoliposomów oceniono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Liposomy należy ostatecznie potraktować podobnie jak żywe komórki, aby uzyskać obrazy lepszej jakości.
Procedury utrwalania i suszenia są ważne, aby zapewnić wizualizację mniejszych, nienaruszonych pęcherzyków, które utrzymują ponad 20 kilowoltów w warunkach próżni. Ryciny 2A i 2B przedstawiają okrągłe pęcherzyki liposomalne w zakresie 121 nanometrów, analizowane przy napięciu 20 kilowoltów. Natomiast na rysunkach 2C i 2D przedstawiono nieodpowiednio przygotowane próbki.
Próbki poddane niewłaściwej obróbce pozwalały jedynie na obserwację większych i/lub uszkodzonych pęcherzyków, które nie są odporne na warunki próżni i/lub napięcia. Opisany tutaj protokół pozwolił na wytworzenie powtarzalnych pęcherzyków o okrągłym kształcie, małej powierzchni i średniej wielkości około 150 nanometrów. Metoda może być stosowana do uwięzienia złożonych i dużych cząsteczek, jako białka tetramerycznego, wykazującego korektor hydrofilowy.
Wadliwe samouwięzienie jest wyższe niż 80%, a wskaźnik wycieku jest bardzo niski, niższy niż 1,5%, gdy nanokapsułki są przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Mamy nadzieję, że ten film pomoże Ci w enkapsulacji dużych cząsteczek, takich jak teri.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia przygotowanie nanokapsułek liposomalnych zawierających hydrofilowe białko tarin z wykorzystaniem metody cienkiej warstwy lipidowej. Celem enkapsulacji jest zwiększenie stabilności, kontrola uwalniania oraz rozwiązanie problemów związanych z osiągnięciem wysokiej wydajności enkapsulacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nanotechnologia
- Biotechnologia
- Nauki farmaceutyczne
Wstęp
- Nanokapsułki liposomalne są wykorzystywane do dostarczania leków.
- Enkapsulacja białek może poprawić ich stabilność oraz biodostępność.
- Wyzwania obejmują dobór lipidów oraz utrzymanie bioaktywności.
- Dynamiczne rozpraszanie światła oraz skaningowa mikroskopia elektronowa to kluczowe techniki charakterystyki.
Cel badania
- Opracowanie metody enkapsulacji tariny w nanokapsułkach liposomalnych.
- Poprawa stabilności i kontrolowanego uwalniania białek hydrofilowych.
- Przedstawienie protokołu rozwiązującego typowe problemy występujące podczas przygotowywania liposomów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie liposomów przy użyciu techniki ekstruzji.
- Charakterystyka z wykorzystaniem dynamicznego rozpraszania światła oraz skaningowej mikroskopii elektronowej.
- Wyznaczenie wydajności enkapsulacji zgodnie z protokołem Petersona.
- Ultraszybka wirowka do oddzielenia liposomów od nieenkapsulowanych białek.
Główne wyniki
- Osiągnięto skuteczną enkapsulację tarinu.
- Charakterystyka potwierdziła rozmiar i stabilność liposomów.
- Metoda wykazała wysoką wydajność enkapsulacji.
- Wyzwania związane z doborem lipidów zostały skutecznie rozwiązane.
Wnioski
- Metoda cienkiej warstwy lipidowej jest skuteczna w przygotowywaniu nanokapsułek liposomalnych.
- Enkapsulacja białek hydrofilowych może zwiększyć ich potencjał terapeutyczny.
- Niniejszy protokół może zostać dostosowany do innych cząsteczek hydrofobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Enkapsulacja białek hydrofilowych w nanoliposomach pozwala rozwiązać kluczowe problemy związane z dostarczaniem leków biologicznych, w tym stabilność, biodostępność i kontrolowane uwalnianie. Metoda ta wspiera wczesny etap walidacji celu, umożliwiając odtwarzalne formulowanie złożonych biomolekuł do analiz funkcjonalnych. Wysoka wydajność uwięzienia oraz niski stopień wycieku zwiększają pewność prognostyczną w procesach rozwoju przedklinicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutyków
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji białek w chronionym, biomimetycznym środowisku w celu wyjaśnienia mechanizmów działania celu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza standaryzowane nanopęcherzyki zapewniające spójne warunki analizy dla zespołów badawczych.
- Wartość prognostyczna: Zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną poprzez zachowanie bioaktywności białek podczas enkapsulacji i przechowywania.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje jednorodne pęcherzyki w nanoskali (śr. 155 nm, PDI 0,168), odpowiednie dla platform wysokoprzepustowego przesiewania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki etapom ekstruzji i ultrawirowania, które minimalizują zmienność między partiami.
- Gotowość do analizy: Umożliwia przygotowanie stabilnych układów oddziaływań ligand-receptor z wykorzystaniem zamkniętych wewnątrz białek globularnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście z etapu odkryć do badań przedklinicznych poprzez zachowanie integralności strukturalnej białek tetramerycznych.
- Minimalizacja ryzyka: Niski poziom nieszczelności (<1,5% w 4°C) umożliwia wiarygodne modelowanie farmakokinetyki i biodystrybucji.
- Pomost formulacyjny: Zapewnia skalowalną platformę nanonośników, którą można dostosować do innych hydrofilowych leków biologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, obejmujący etapy od walidacji celu, przez optymalizację związku wiodącego, aż po opracowanie formulacji przedklinicznej, w szczególności w przypadku białek hydrofilowych wymagających stabilizacji.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie funkcjonalne uwięzionych lektyn i białek globularnych w badaniach nad wyjaśnianiem szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Pozwala na otrzymanie monodyspersyjnych nanoliposomów odpowiednich do analiz wiążących lub fluorescencyjnych, które wymagają jednolitej wielkości cząstek.
- Analityka: Wykorzystuje dynamiczne rozpraszanie światła do ilościowego oznaczenia rozkładu wielkości oraz wydajności enkapsulacji zgodnie z protokołem Petersona w celu dokładnej kwantyfikacji.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność białek dzięki łagodnej ekstruzji i przechowywaniu w niskiej temperaturze, co wspiera modele przedkliniczne zgodne z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną standardową procedurę operacyjną (SOP) dla enkapsulacji liposomalnej, możliwą do zastosowania w wielu projektach i dla różnych białek docelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Wysoka wydajność kapsułkowania (83%) i niski poziom wycieku zwiększają wiarygodność danych w badaniach nad oddziakiwaniem z celem.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana hydratacja filmu lipidowego i ekstruzja umożliwiają skalowalną produkcję możliwą do adaptacji do standardów GMP.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza odsetek niepowodzeń dzięki wczesnemu ograniczaniu ryzyk związanych z wyzwaniami formulacyjnymi w procesie odkrywania leków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów białkowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o możliwość opracowania i wykonalność formulacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach obchodzenia się z lipidami, sonikacji, ekstruzji oraz ultrawirowania.
- Zależne od dostępu do rotacyjnego odparowacza, ekstrudera z membranami poliwęglanowymi, DLS, SEM oraz ultrawirowarki.
- Wymaga międzyspecjalistycznej standaryzacji proporcji lipidów, buforów nawadniających oraz cykli ekstruzji w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych modeli wymaga optymalizacji składu lipidów oraz stężenia ładowanego białka.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalne oddziaływania lipidowo-białkowe oraz konieczność przeprowadzenia analizy w trzech powtórzeniach w celu zapewnienia dokładności ilościowej.
