Name: Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj mikroskopię fluorescencyjną do badania lokalizacji białek i zmian morfologicznych w komórkach bakterii Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus. Ta metoda pozwala obserwować procesy biologiczne w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom naszego laboratorium za komentarze do tego artykułu. Praca ta została sfinansowana z grantu na rozpoczęcie działalności z University of South Florida (PE).

1. Ogólne warunki wzrostu
<ol>
	<li>Zaszczepić 2 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej uzupełnionej antybiotykami (w razie potrzeby) pojedynczą kolonią szczepu (szczepów), który ma być zobrazowany. Inkubować te kultury nasienne przez noc w temperaturze 22 °C w inkubatorze z wytrząsaniem. 
	UWAGA: Konkretne warunki wzrostu bakterii użyte w tym artykule są podane w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.</li>
	<li>Rozcieńczyć nocne kultury w stosunku 1:20 na świeżych podłożach w kolbie o pojemności 125 ml, uzupełnić antybiotykami (jeśli jest to wymagane).</li>
	<li>Hodować kulturę(-y) w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem do środkowej fazy logarytmicznej (OD600 = 0,5). 
	UWAGA: Induktor lub inhibitor można dodawać bezpośrednio do rosnących kultur w odpowiedniej fazie wzrostu.</li>
	<li>Pobrać komórki w pożądanych warunkach hodowli w celu przygotowania próbki mikroskopowej, jak opisano w następnym rozdziale.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotuj 1% agarozy, łącząc 0,25 g agarozy klasy biologii molekularnej o niskim EEO z 25 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami (jeśli to wymagane) do mikroskopii poklatkowej lub sterylnej wody. Podgrzej mieszaninę za pomocą kuchenki mikrofalowej przez około 30 sekund, wlej ją do sterylnej szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i pozwól jej zastygnąć.</li>
	<li>Weź 5–50 μl porcji hodowli komórkowej w zależności od potrzeb i wybarwić komórki. Na tym etapie wybarwić komórki odpowiednimi barwnikami (np. dodać barwnik fluorescencyjny FM4-64 (barwienie błonowe) do eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)).
	<ol>
		<li>Odmierzyć pipetą 5 μl porcji próbki hodowli lub próbki barwionej do zobrazowania na dnie naczynia hodowlanego ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (o średnicy mikrodołka 14 mm i niepowlekanym szkiełku nakrywkowym nr 1,5; patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Nie należy używać szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną, szczególnie do mikroskopii poklatkowej, ponieważ mogą one wywołać inny wzorzec wzrostu (zaobserwowaliśmy to również w przypadku poli-D-lizyny; dane nie pokazane) i/lub wpływać na dynamikę białka6.</li>
		<li>Aby zminimalizować użycie barwników, wybarwić 3–4 μl zawiesiny komórek (zebranej przy OD600 = 0,5; około 2,7 x 107 i 3,4 x 107 odpowiednio dla B. subtilis i S. aureus na 1 ml hodowli) bezpośrednio na naczyniu ze szklanym dnem.</li>
		<li>Umieścić wstępnie przyciętą płytkę agarozową (o średnicy 11 mm lub o dowolnym rozmiarze, tak aby zachodziła na powierzchnię szkiełka nakrywkowego; przeciąć za pomocą otwartego końca sterylnej probówki lub żyletki) na wierzchu próbki i delikatnie postukać, aby upewnić się, że płatka agarozy przylega płasko do szkiełka nakrywkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po obrazowaniu (patrz następna sekcja), jeżeli liczba komórek w polu widzenia nie jest pożądana, należy dostosować gęstość komórek próbki poprzez rozcieńczenie lub zagęszczenie przez odwirowanie i zmienić stosunek komórek w próbce za pomocą pożywki wzrostowej/buforu, jeśli to konieczne. 
	UWAGA: Aby zminimalizować autofluorescencję emanującą z pożywki hodowlanej, komórki można przemyć w buforze (na przykład w standardowym 1x buforze fosforanowym soli fizjologicznej) i ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości buforu przed obrazowaniem. Możliwe jest, że na tym etapie mniejsze komórki lub pęcherzyki mogą nie zostać zachowane po odwirowaniu i w związku z tym zostaną utracone.</li>
	<li>Dodaj wodę za pomocą pipety (~5 μl kropli) do przestrzeni wewnątrz naczynia hodowlanego (wokół szkiełka nakrywkowego), aby zapobiec wysychaniu podkładki agarozowej i pomóc utrzymać wilgotność w trakcie akwizycji obrazu, szczególnie w przypadku eksperymentów poklatkowych.</li>
	<li>Pozwól, aby szalki hodowlane zrównoważyły się z temperaturą wewnątrz komory inkubacyjnej, wbudowanej nieprzezroczystej komory dostarczonej przez producenta, mikroskopu przez 15–20 minut 
	UWAGA: Włącz element grzejny i ustaw komorę inkubacyjną na żądaną temperaturę na kilka godzin przed obrazowaniem. Zapewni to, że sprzęt ustabilizuje się do nowej temperatury. W przypadku przedłużonego obrazowania poklatkowego umieść zlewkę lub kolbę z wodą w komorze mikroskopu, z dala od obszaru roboczego, aby utrzymać wilgotność.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>W dniu eksperymentu włącz system mikroskopu. Uruchom oprogramowanie do obrazowania (patrz Spis materiałów), klikając odpowiednią ikonę na pulpicie. Zainicjuj mikroskop, klikając opcję Zainicjuj mikroskop (przycisk przedstawiony z mikroskopem) w oknie dialogowym uruchamiania oprogramowania. Upewnij się, że obiektyw jest całkowicie opuszczony za pomocą zgrubnej regulacji mikroskopu przed inicjalizacją. 
	UWAGA: Po inicjalizacji oprócz menu Start powinny pojawić się trzy dodatkowe okna dialogowe: resolve3D, zbieranie danych i monitor filtrów.</li>
	<li>Umieść kroplę oleju 1.517 (współczynnik załamania światła) na 100-krotnym obiektywie zanurzeniowym w oleju dostarczonym przez producenta (apertura numeryczna = 1.4, odległość robocza = 0.12 mm; patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Ważne jest, aby wybrać odpowiedni olejek immersyjny do temperatury, w której przeprowadzane jest obrazowanie.</li>
	<li>Załaduj naczynie ze szklanym dnem zawierające próbkę do metalowej obudowy (trumny) i delikatnie wsuń do stage clamp.</li>
	<li>Użyj pokrętła regulacji zgrubnej, aby podnieść obiektyw, aż olej zetknie się ze szklanym dnem naczynia. Użyj okularu i pokrętła precyzyjnej regulacji, aby ustawić ostrość próbki. Gdy komórki są już ostre, przekręć pokrętło z okularu w tryb aparatu, przesuwając przełącznik wyboru znajdujący się z przodu korpusu mikroskopu w lewo.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment za pomocą oprogramowania do obrazowania. W oknie resolve3D wybierz ikonę Projektowanie/uruchamianie eksperymentu przedstawioną przez kolbę. Powinno pojawić się nowe okno dialogowe zatytułowane projektowanie/uruchamianie eksperymentu.
	<ol>
		<li>Ustaw liczbę stosów Z i grubość próbki za pomocą zakładki projektowanie, a następnie podział na sekcje w oknie dialogowym projektowania/uruchamiania eksperymentu. 
		UWAGA: Do eksperymentów w sekcji wyników reprezentatywnych użyto 17 stosów Z w odstępie 200 nm dla obrazów nieruchomych i czterech stosów Z w odstępie 200 nm dla mikroskopii poklatkowej.</li>
		<li>Aby zmierzyć grubość komórek w próbce, należy ręcznie dostosować płaszczyznę Z stopniowo, używając strzałek w górę i w dół w oknie dialogowym resolve3D. Zaznacz miejsce, w którym komórki stają się nieostre, jako górną i dolną granicę pozyskiwania obrazu. Zaimportuj te informacje przed uruchomieniem eksperymentu.</li>
		<li>Aby zminimalizować fototoksyczność i fotowybielanie podczas obrazowania poklatkowego, zmniejsz liczbę stosów Z i wybierz środkową płaszczyznę komórek do akwizycji obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz odpowiedni zestaw filtrów dla eksperymentu, korzystając z karty projektowania, a następnie kanałów w oknie dialogowym projektowania/uruchamiania eksperymentu (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
	<ol>
		<li>Należy również wybrać odniesienie do zbioru informacji POL/DIC. Dostosuj procentową transmisję (natężenie światła) i czas trwania ekspozycji dla poszczególnych kanałów wybranych przed obrazowaniem, wybierając odpowiednie opcje w oknie dialogowym resolve3D. 
		UWAGA: W testowym polu widzenia, które nie jest brane pod uwagę w teście eksperymentalnym, ustawienia te mają na celu określenie, czy wybrane parametry uzyskują znaczące dane fluorescencji bez utraty słabego sygnału lub jego przesycenia. Następnie zaimportuj te parametry dla konfiguracji eksperymentalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz listę punktów, wybierając przycisk Lista punktów w oknie dialogowym resolve3D. Powinno pojawić się nowe okno dialogowe zatytułowane lista punktów. Zaznacz kilka pól widzenia, które mają być użyte w eksperymencie, znajdując odpowiednie pola widzenia za pomocą elementów sterujących stolika mikroskopu i wybierając opcję oznaczania punktu w oknie dialogowym listy punktów. 
	UWAGA: Punkt zamiany będzie musiał być wybierany za każdym razem, gdy mikroskop zostanie ponownie ustawiony na punkcie na liście punktów. Można to zrobić, ustawiając ostrość mikroskopu na odpowiednim punkcie na liście, a następnie wybierając przycisk zamiany punktu. Ważne jest, aby nie dotykać analogowego pokrętła regulacji zgrubnej/precyzyjnej podczas ponownego ustawiania ostrości; Używaj tylko oprogramowania do regulacji ostrości.</li>
	<li>Ustaw parametry timelapse, wybierając najpierw zakładkę projektu, a następnie timelapse w oknie dialogowym projektowania/uruchamiania eksperymentu. Zaznacz pole wyboru timelapse. Wprowadź odpowiednie parametry timelapse w zakresie zdjęć poklatkowych/czasu całkowitego.</li>
	<li>Ustaw punkty, które mają być obrazowane, z listy punktów, wybierając najpierw kartę projektu, a następnie punkty w oknie dialogowym projektowania/uruchamiania eksperymentu. Wybierz opcję listy punktów odwiedzin i wprowadź punkty, które mają zostać zobrazowane w polu tekstowym, oddzielając je przecinkami lub myślnikami, jeśli jest to pełna sekwencja.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu edytuj nazwy plików i lokalizacje plików za pomocą karty uruchamiania w oknie dialogowym projektowania/uruchamiania. Lokalizację pliku można zmienić wybierając przycisk ustawień, wybierając folder danych, a następnie wybierając odpowiedni folder lub tworząc nowy. Zmień nazwy plików, wprowadzając nową nazwę pliku w polu tekstowym nazwy pliku obrazu.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment, wybierając przycisk odtwarzania w oknie dialogowym rozpoczynania eksperymentu. 
	UWAGA: W przypadku trybu poklatkowego należy stale sprawdzać ostrość w każdym polu widzenia podczas eksperymentu przy użyciu ustawień DIC (aby uniknąć niepotrzebnego fotowybielania) oraz ponownie ustawić ostrość i zaktualizować informacje na liście punktów, ponieważ komórki mają tendencję do utraty ostrości w miarę upływu czasu.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Otwórz żądane pliki obrazów RAW (R3D) do wygenerowania figures. 
	UWAGA: Ostatnio zapisane pliki można zlokalizować za pomocą przycisku folderu danych w oknie dialogowym uruchamiania oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
	<li>Uruchom program dekonwolucyjny, aby usunąć nieostre światło fluorescencyjne 7,8, aby utworzyć plik obrazu D3D o zdekonwolucji. Wybierz kartę procesu w oknie dialogowym uruchamiania, a następnie wybierz pozycję deconvolve. Pojawi się nowe okno dialogowe zatytułowane dekonwolucja.
	<ol>
		<li>Ustaw parametry dekonwolucji, przeciągając odpowiedni numer obrazu (znajdujący się w lewym górnym rogu każdego pliku obrazu) do danych wejściowych w oknie dialogowym dekonwolucji. W oknie dialogowym Dekonwolucja wybierz przycisk Więcej opcji i usuń zaznaczenie pola wyboru Wycofanie obramowania kadrowania po przetworzeniu (w przeciwnym razie obrazy nie będą mogły zostać nałożone na odpowiedni plik DIC).</li>
		<li>Kliknij przycisk Zrób to w oknie dialogowym dekonwolucji, aby zdekonwolucjonizować plik obrazu raw. 
		UWAGA: Parametry dekonwolucji można dostosować zgodnie ze wskazówkami producenta oprogramowania w celu uzyskania pożądanych rezultatów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby wykonaj ręczne odejmowanie szumu tła i regulację jasności/kontrastu w dowolnym lub wszystkich kanałach długości fali (koloru). W tym celu należy wybrać przycisk regulacji kontrastu w pliku obrazu o zdekonwolucji.</li>
	<li>Zapisz obraz jako plik TIFF, wybierając najpierw opcję pliku w górnej części okna dialogowego D3D. Następnie wybierz opcję zapisz jako TIFF, zidentyfikuj i wybierz odpowiednie stosy Z (które są w centrum uwagi), zaznacz lub odznacz żądane zestawy filtrów.</li>
	<li>Kwantyfikacja danych jest wykonywana przy użyciu dowolnego oprogramowania dostarczonego przez producenta lub bezpłatnych programów, takich jak ImageJ5.
	<ol>
		<li>Aby określić ilościowo rozmiar komórki, kliknij kartę narzędzi na odpowiednim pliku obrazu D3D, a następnie wybierz opcję zmierzenia odległości. Zmierz odległości, wybierając punkt początkowy i końcowy w żądanym pliku obrazu, używając myszy do kliknięcia lewym przyciskiem myszy. 
		UWAGA: Najlepiej jest powiększyć obraz podczas kwantyfikacji rozmiaru komórki.</li>
		<li>Do kwantyfikacji sygnału fluorescencji należy użyć opcji inspektora danych na karcie narzędzi w odpowiednim pliku obrazu D3D. 
		UWAGA: Najlepiej jest powiększyć obraz i wybrać tylko odpowiednie filtry podczas kończenia kwantyfikacji sygnału fluorescencji.</li>
		<li>Aby określić ilościowo sygnał fluorescencji, narysuj pole z opcją kolumny/wiersza ustawioną na określony wymiar. Wybierz obszar z sygnałem, który ma zostać określony ilościowo i zapisz wartość. Zmierz sygnał tła, używając pola o tym samym rozmiarze, aby zaznaczyć obszar znajdujący się bezpośrednio poza komórkami. Odejmij wartość tła od wartości zarejestrowanej z sygnału fluorescencji uzyskanego w komórce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li>
<li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li>
<li>Hsu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+color+palette+of+fluorescent+d-amino+acids+for+in+situ+labeling+of+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls.</a> Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).</li>
<li>Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cytological+profiling+rapidly+identifies+the+cellular+pathways+targeted+by+antibacterial+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+poly%28L-lysine%29+substrates+on+attached+Escherichia+coli+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria.</a> Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li>
<li>Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workingperson%27s+guide+to+deconvolution+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy.</a> Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).</li>
<li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitsville%3A+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li>
<li>Du, S., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+Heart+of+Bacterial+Cytokinesis%3A+The+Z+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring.</a> Trends in microbiology. , (2019).</li>
<li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li>
<li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623(2019).</li>
<li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723%3A+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li>
<li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+TEM%3A+new+insights+from+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li>
<li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li>
<li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li>
<li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li>
<li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology%3A+from+localization+to+dynamics%2C+from+ensembles+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255(2015).</li>
<li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Biology%22%5BJournal%5D)">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroskopia pozostała podstawą badań nad organizmami drobnoustrojów. Biorąc pod uwagę rozmiar komórek w skali mikronowej, badania na poziomie pojedynczej komórki tradycyjnie opierały się na mikroskopii elektronowej (EM). Chociaż EM stał się w ostatnich latach dość potężną techniką, oprócz ograniczonego dostępu użytkowników ma swoje wewnętrzne ograniczenia16. Udoskonalenia w technikach mikroskopii fluorescencyjnej i opracowanie różnych sond fluorescencyjnych, takich jak FDAA3</sup...

Dziedzina biologii komórek bakteryjnych została znacznie rozszerzona dzięki najnowszym postępom w technikach mikroskopowych1,2. Cennym narzędziem pozostają między innymi mikroskopy, które są w stanie przeprowadzać eksperymenty z poklatkową mikroskopią fluorescencyjną. Badacze mogą monitorować różne zdarzenia fizjologiczne w czasie rzeczywistym za pomocą białek fluorescencyjnych, takich jak transkrypcyjne i translacyjne fuzje reporterowe oparte na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP), fluorescencyjne D-aminokwasy (FDAA) 3 lub używać innych barwników do znakowania ściany komórkowej, błony i DNA. Nic więc dziwnego, że mikroskopia fluorescencyjna pozostaje popularna wśród biologów komórek drobnoustrojów. Oprócz prostego pokazania fenotypów końcowych, dostarczenie informacji o tym, w jaki sposób obserwowane fenotypy powstają za pomocą mikroskopii poklatkowej, może dodać znaczącą wartość do wyników i potencjalnie dostarczyć wskazówek co do tego, jakie procesy komórkowe są celem potencjalnych kandydatów na leki4.
Protokoły do przeprowadzania obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą w pełni zmotoryzowanego, odwróconego, szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego (zobacz Tabelę materiałów) są podane w tym artykule. Protokoły te można dostosować do potrzeb innych mikroskopów fluorescencyjnych, które są w stanie przeprowadzać mikroskopię poklatkową. Mimo że omawiane tutaj oprogramowanie odpowiada konkretnemu oprogramowaniu dostarczonemu przez producenta, jak wskazano w Tabeli materiałów, oprogramowanie zwykle dostarczane przez innych producentów mikroskopów lub ogólnie dostępne ImageJ5 mają równoważne narzędzia do analizy danych mikroskopowych. W warunkach, w których timelapse nie jest sprzyjający, można przeprowadzić eksperymenty z przebiegiem czasu, jak opisano w tym artykule. Opisane tutaj protokoły stanowią szczegółowy przewodnik do badania zmian fenotypowych u dwóch różnych gatunków bakterii: B. subtilis i S. aureus. Patrz Tabela 1 dla zastosowanych szczepów.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>Klasa biologii molekularnej - Niska EEO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Mikroskopia</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Mikroskopia</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Mikroskopia</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1755-10</td><td>Nie zawiera</td></tr> <tr>dioksanu<td>Mikroskop</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Dostosowany odwrócony statyw mikroskopowy Olympus IX-71; Niestandardowa wieża oświetleniowa i moduł oświetlacza światła przechodzącego. Obiektywy: PLAPON 60X (N.D. 1,42, WD 0,15 mm); OLY 100X OLEJ (N.D. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski do obiektywu 100x; Aparat fotograficzny CoolSnap HQ2; Montaż SSI 7-kolorowy; Komora kontroli środowiska - nieprzezroczysta.</td></tr><tr><td>PC190723</td><td>MilliporeSigma</td><td>3445805MG</td><td>Inhibitor FtsZ</td></tr><tr><td>SoftWorx</td><td>GE</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania dostarczone przez producenta</td></tr></tbody></table>

mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Badania czynników wpływających na podział komórek i kształt komórek u bakterii są zwykle wykonywane w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości, ponieważ obserwacje wykonane na poziomie populacji mogą nie odzwierciedlać tego, co dzieje się na poziomie pojedynczej komórki. Mikroskopia poklatkowa żywych komórek pozwala badaczom monitorować zmiany w podziale komórek lub morfologii komórek, co dostarcza cennych informacji na temat subkomórkowej lokalizacji białek i czasu ekspresji genów, jak to się dzieje, aby potencjalnie pomóc w udzieleniu odpowiedzi na ważne pytania biologiczne. Tutaj opisujemy nasz protokół monitorowania zmian fenotypowych u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus za pomocą mikroskopu dekonwolucyjnego o wysokiej rozdzielczości. Celem tego raportu jest dostarczenie prostego i przejrzystego protokołu, który może zostać przyjęty przez innych badaczy zainteresowanych przeprowadzeniem eksperymentów z mikroskopią fluorescencyjną w celu zbadania różnych procesów biologicznych u bakterii, a także innych organizmów.

Fenotypy GpsB 
Wcześniej wykazaliśmy, że Sa-GpsB jest białkiem niezbędnym, ponieważ deplecja GpsB przy użyciu antysensownego RNA prowadzi do lizy komórek9. W niniejszym opracowaniu opisujemy, w jaki sposób pojawienie się różnych fenotypów podziału komórkowego oraz zmiany w lokalizacji białek mogą zostać zarejestrowane przy użyciu protokołu mikroskopii timelapse opisanego w tym artykule. W tym celu szczepy S. aureus RB143 [SH1000 zawierający pEPSA5 (pusty wektor)] oraz ...

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Protokół ten ułatwia bezpośrednią obserwację różnych zmian fenotypowych na poziomie pojedynczej komórki i umożliwia ciągłe monitorowanie lokalizacji białek i czasu ekspresji genów. Główną zaletą mikroskopii fluorescencyjnej jest to, że jest to prosta metoda monitorowania różnych procesów biologicznych, takich jak podział komórek i zmiany morfologii komórek w żywych komórkach. Należy zwrócić szczególną uwagę na protokół przygotowania próbki i zapoznać się z oprogramowaniem mikroskopu, aby móc zlokalizować ustawienia i opcje wymienione w tym protokole.Wizualna reprezentacja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozwala użytkownikom obserwować i uczyć się istotnych kroków techniki podczas tworzenia własnych eksperymentów. Zacznij od oznaczenia od pięciu do 50 mikrolitrów podwielokrotności hodowli komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania odpowiednim barwnikiem barwiącym błonę i dodanie pięciu mikrolitrów barwionych komórek bakteryjnych na szkiełku nakrywkowym na dnie 35-mililitrowego naczynia do hodowli ze szklanym dnem. Umieść płytę agarozową o średnicy 11 milimetrów na próbce i delikatnie postukaj, aby upewnić się, że płyta przylega płasko do szkiełka nakrywkowego.Następnie dodaj około pięciu mikrolitrów wody wokół szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec wyschnięciu podkładki agarozowej i pozwól szalce hodowlanej zrównoważyć się z temperaturą wewnątrz komory inkubacyjnej mikroskopu dekonwolucyjnego o wysokiej rozdzielczości przez 15 do 20 minut. Aby zobrazować próbkę, użyj pokrętła regulacji ostrości zgrubnej, aby upewnić się, że obiektyw jest całkowicie opuszczony przed inicjalizacją mikroskopu w oprogramowaniu mikroskopu. Umieść kroplę oleju o współczynniku załamania światła 1,517 w obiektywie 100-krotnego zanurzenia w oleju i przenieś szklane naczynie z dnem zawierające próbkę do metalowej obudowy.Delikatnie wsuń naczynie do stage clamp i użyj pokrętła regulacji zgrubnej, aby podnieść obiektyw, aż olej zetknie się ze szklanym dnem naczynia. Użyj okularu i pokrętła precyzyjnej regulacji, aby ustawić ostrość próbki i przełącz się w tryb aparatu. W oprogramowaniu do obrazowania w oknie Resolve 3D wybierz ikonę Design/Run Experiment (Projektuj/Uruchom eksperyment).Pojawi się nowe okno dialogowe zatytułowane Projektowanie/uruchamianie eksperymentu. Otwórz karty Projekt i Przekrój w oknie dialogowym, aby ustawić liczbę stosów Z i grubość próbki. Aby zmierzyć grubość komórek w próbce, należy stopniowo dostosować płaszczyznę Z za pomocą strzałek w górę i w dół w oknie dialogowym Rozwiąż 3D, wyznaczając górną i dolną granicę akwizycji obrazu jako górną i dolną granicę obszaru akwizycji obrazu.Po dostosowaniu procentu transmisji natężenia światła i czasu trwania ekspozycji dla poszczególnych wybranych kanałów w oknie dialogowym Rozwiąż 3D, kliknij przycisk Lista punktów, aby otworzyć Listę punktów. Na zakładkach Projekt i Upływ czasu zaznacz pole wyboru Upływ czasu i wprowadź parametry poklatkowe. Wybierz opcję Lista punktów odwiedzin i wprowadź punkty, które mają zostać zobrazowane w polu tekstowym, oddzielając punkty przecinkami lub łącznikami, aby uzyskać pełne sekwencje.Następnie edytuj nazwy plików i lokalizacje plików na karcie Uruchamianie, a następnie wybierz pozycję Odtwórz w oknie dialogowym Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć eksperyment. Na końcu analizy otwórz interesujące Cię pliki obrazów RAW w odpowiednim programie do dekonwolucji, a następnie wybierz kartę Proces i Dekonwolucja. W razie potrzeby należy ręcznie odejmować szum tła i regulować kontrast jasności w dowolnym lub wszystkich kanałach długości fal przed zapisaniem obrazu jako pliku TIFF.Aby określić ilościowo długość komórki, otwórz zdekonwolucyjne pliki obrazów w oprogramowaniu dostarczonym przez producenta lub w bezpłatnym oprogramowaniu do obrazowania, takim jak ImageJ, i otwórz kartę Narzędzie. Następnie wybierz opcję Zmierz odległości i kliknij lewym przyciskiem myszy punkt początkowy i końcowy w żądanym pliku obrazu, aby zmierzyć długość komórki. Aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny, wybierz opcję Inspektor danych.Narysuj pole z opcją Kolumna/wiersz ustawioną na określony wymiar, który Cię interesuje, a następnie wybierz obszar, w którym sygnał ma zostać określony ilościowo. Dodanie ksylozy w celu indukcji szczepu GGS 8 powoduje fenotyp sześciokomórkowy. Podczas gdy puste kontrole wektorowe wydają się podobne do komórek kontrolnych hodowanych przy braku induktora.Nadprodukcja gronkowca złocistego gpsB zaburza podział komórek w B.subtilis, mierzony za pomocą mikroskopii poklatkowej i kwantyfikacji długości komórki. Ponadto wzorce lokalizacji FtsZ lub jednego z białek związanych z tym białkiem mogą być wykorzystane jako reporter do badania i/lub identyfikacji nowych związków przeciwdrobnoustrojowych poprzez obrazowanie poklatkowe i kwantyfikację długości komórek. Upewnij się, że używasz oleju o odpowiednim współczynniku załamania światła, ponieważ współczynnik załamania światła może się zmieniać w zależności od temperatury użytej do obrazowania.Dekonwolucja może być przeprowadzona, jeśli użytkownik chce usunąć nieostry szum, a także można przeprowadzić analizę danych obejmującą kwantyfikację sygnału fluorescencyjnego oraz pomiary długości i szerokości komórki.

live-cell-fluorescence-microscopy-to-investigate-subcellular-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Biofilmy mikrobiologiczne są zazwyczaj tworzone przez odrębne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek. Analiza pojedynczych komórek w tych subpopulacjach wymaga zastosowania reporterów fluorescencyjnych. W niniejszym protokole opisujemy metodę wizualizacji i monitorowania kilku subpopulacji w biofilmach B. subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Źródło: Brzozowski, R. S. i in. Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu badania lokalizacji białek podkomórkowych oraz zmian morfologii komórek u bakterii. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek, aby wizualizować zmiany morfologiczne bakterii w czasie rzeczywistym. Opisuje etapy związane z obrazowaniem, akwizycją poklatkową oraz dekonwolucją w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie zmian morfologicznych u bakterii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

Film opisuje technikę obrazowania FLIM-FRET w celu określenia interakcji białko-białko w żywych bakteriach wyrażających białka cytoplazmatyczne znakowane białkami fluorescencyjnymi, donorem eGFP i akceptorem mCherry. Połączona technika pozwala również na ilościowe określenie oddziałujących białek.

Obrazowanie FLIM-FRET w celu scharakteryzowania interakcji białko-białko u żywych bakterii

Opisana jest metoda oparta na białku fluorescencyjnym żywych komórek do oświetlania wakuoli komórkowych (inkluzji) zawierających Chlamydię. Strategia ta umożliwia szybkie, zautomatyzowane określenie zakaźności Chlamydii w próbkach i może być wykorzystana do ilościowego badania dynamiki wzrostu inkluzji.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Poznaj mikroskopię fluorescencyjną do badania lokalizacji białek i zmian morfologicznych w komórkach bakterii Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus. Ta metoda pozwala obserwować procesy biologiczne w żywych komórkach.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Przeglądaj więcej filmów