Name: Podwójne linijki DNA do badania mechanizmu translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę podwójnych linijek DNA do badania translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Technika umożliwia sondowanie obu stron mRNA w kompleksach rybosomalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. dziękuje za wsparcie ze strony Fundacji Welch (E-1721).

1. Przygotowanie kompleksów rybosomów
<ol>
	<li>Przygotuj 1,000 ml buforu TAM10, który składa się z 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-merkaptoetanol) i 0,05% Tween20.</li>
	<li>Przygotować pięć mieszanin wymienionych w tabeli 1. 
	UWAGA: Rybosom pochodził ze szczepu MRE600 klasy <sup="xref">11. EF-Tu: współczynnik wydłużenia niestabilny termicznie. EF-Ts: współczynnik wydłużenia termostabilny. GTP: trifosforan guanozyny. PEP: pirogronian fosfo(enolu).</li>
	<li>Inkubować pięć mieszanek oddzielnie w temperaturze 37 °C przez 25 minut przed utworzeniem kompleksów rybosomów. Przygotuj pięć kompleksów rybosomów zgodnie z tabelą 2. 
	UWAGA: Poczta: po translokacji; Wstęp: przed translokacją.</li>
	<li>Dodaj każdy z pięciu kompleksów rybosomów na 1,1 M poduszkę sacharozy osobno, w stosunku objętościowym 1:1. Oczyść każdy z nich za pomocą 450 000 × g przez 2 godziny w ultra-wirówce. Za pomocą pipety usunąć supernatant i przywrócić kompleksy rybosomów w temperaturze -80 °C po ponownym zawieszeniu osadu z buforem TAM10.</li>
</ol>
2. Przygotowanie szkiełek szklanych pokrytych biotyną
<ol>
	<li>Wstępne czyszczenie szkiełek
	<ol>
		<li>Umieść 12 szkiełek o wymiarach 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (dł. × szer. × T) w krótkim i szerokim szklanym naczyniu.</li>
		<li>Napełnij szklane naczynie acetonem i sonikuj przez 5 minut. Następnie umyj szkiełka ultraczystą wodą 5 razy i napełnij 3/4 naczynia wodą.</li>
		<li>Dodaj 10 M KOH, aby napełnić naczynie i sonikować szklane szkiełka przez 20 minut. Umyj szkiełka wodą 5 razy.</li>
		<li>Dodać etanol i sonikować przez 5 minut, wylać etanol, a następnie suszyć je oddzielnie w temperaturze 300 °C przez 3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powłoka aminozelanu
	<ol>
		<li>Umieść 12 oczyszczonych szkiełek z powrotem w szklanym naczyniu zawierającym metanol. Oczyść kolbę PEGylacyjną metanolem przez sonikację przez 5 minut, a następnie napełnij ją 25 ml metanolu, 1,25 ml wody, 0,125 ml HAc, 0,25 ml 3-aminopropylotrietoksysilanu (AMEO).</li>
		<li>Natychmiast zastąp metanol w szklanym naczyniu przygotowanym roztworem AMEO. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Kilkakrotnie spłucz szkiełka wodą, a następnie wysusz je przez przedmuchiwanie azotem. Umieść wysuszone szkiełka w czystych szklanych naczyniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PEGlacja
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór NaHCO3 (8,4 mg/ml) i bufor PEGylacyjny (37,5 mg PEG, 6 mg biotynylowanego PEG, 150 μl roztworu NaHCO3). Dobrze je wymieszaj, wirując z prędkością 6 000 obr./min przez 1 min.</li>
		<li>Umieść 25 μl roztworu PEG na każdym szkiełku. Przykryj go drugim szkiełkiem na górze. Upewnij się, że między dwoma szkiełkami nie ma pęcherzyków powietrza. Umieść szkiełka w pustym pudełku z końcówkami do pipet. Upewnij się, że pudełko jest wypoziomowane i umieść je w ciemnej szufladzie na około 3 godziny.</li>
		<li>Opłucz szkiełka wodą i ponownie wysusz. Wysuszone szkiełka należy przechowywać w temperaturze pokojowej w próżni do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki przed pomiarami magnetycznymi i siłowymi
<ol>
	<li>Obrobić plastyczną studzienkę na próbkę o wymiarach 4 × 3 × 2 mm3 (dł. × szer. × gł.). Przyklej kawałek szkła pokrytego biotyną (o długości około 5 mm, wycięty z szkiełek o długości 60 mm przygotowanych w sekcji 2) na dolnej powierzchni za pomocą żywicy epoksydowej.</li>
	<li>Dodać 20 μl 0,25 mg/ml wodnego roztworu streptawidyny do dołka na próbkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie dwukrotnie przepłukać próbkę buforem TAM10.</li>
	<li>Unieruchomić kompleksy rybosomów.
	<ol>
		<li>Bez antybiotyków: Za pomocą pipety usunąć bufor z dołka próbki, a następnie dodać 20 μl 0,1 μM kompleksu rybosomów (MF-Pre lub MF-Post) do dołka próbki. Kompleks rybosomów zwiąże się ze streptawidyną na powierzchni za pośrednictwem biotyny na końcu 5' na mRNA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie przepłukać raz buforem TAM10.</li>
		<li>W doświadczeniu z użyciem zarówno neomycyny, jak i kwasu fusydowego: inkubować kompleks MF-Pre z neomycyną w temperaturze 37 °C przez 10 minut; inkubować EF-G z kwasem fusydowym w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Stężenia są następujące: 0,1 μM kompleksu rybosomów, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/ml kinazy pirogronianowej, 0,2 mM neomycyny i 0,25 mM kwasu fusydowego.</li>
		<li>W podobny sposób przeprowadź inne eksperymenty z antybiotykami. Stężenia są następujące: 0,2 mM wiomycyny, 0,4 mM higromycyny B i 0,25 mM kwasu fusydowego.</li>
		<li>W celu badania przesunięcia ramki powtórzyć powyższe kroki dla kompleksów MFNF-Pre i MFNF-Post z udziałem śliskiego motywu U6A. Należy użyć odpowiednio antybiotyków: kwasu fusydowego i neomycyny oraz samego kwasu fusydowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć bufor z dołka próbki, a następnie dodać 20 μl 1 μM biotynylowanej nici sondującego DNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc. Przepłukać utworzony dupleks DNA-mRNA raz buforem TAM10.</li>
	<li>Usunąć bufor ze studzienki na próbkę. Następnie dodać 20 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną o stężeniu 0,5 mg/ml do dołka na próbkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie włożyć próbkę do uchwytu i umieścić ją w wirówce. Usunąć wolne cząstki magnetyczne z powierzchni przez odwirowanie przy 84 x g przez 5 minut.</li>
</ol>
4. Pomiary magnetyczności i siły
<ol>
	<li>Włączanie lasera
	<ol>
		<li>Włącz laser za pomocą klucza. Następnie naciśnij przycisk zasilania.</li>
		<li>Dostosuj czułość wzmacniacza lock-in 1 (LIA1) na 500 mV i odczekaj około 2 godzin, aby rozgrzać się i ustabilizować magnetometr atomowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie magnetometru atomowego
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie sterujące przyrządu i ustaw parametry pomiaru. Niektóre parametry mogą się nieznacznie różnić w każdym pomiarze. 
		UWAGA: Magnetometr atomowy składa się z lasera (opisanego powyżej), wzmacniacza blokującego SR830 (określanego jako LIA1), wzmacniacza blokującego SR530 (określanego jako LIA2), generatorów funkcyjnych DS345 (określanego jako FG1) i ATF20B (określanego jako FG2), silnika o wysokiej rozdzielczości i komputera. Wszystkie te elementy powinny być włączone na tym etapie protokołu.</li>
		<li>Ustaw tryb ruchu silnika na Hałas i domyślną pozycję na 0. Naciśnij Lock na panelu przednim, dostosuj czułość LIA1 z powrotem do 200 mV.</li>
		<li>Dostosuj prąd i napięcie lasera i znajdź odpowiedni szczyt rezonansu oraz poziom sygnału do szumu. Naciśnij przycisk Sweep na panelu przednim. Należy pamiętać, że stosunek amplitudy do szerokości powinien wynosić powyżej 0,5, a wartość fazy powinna być mniejsza niż 5 stopni. Jeśli nie, powtórz krok zamiatania.</li>
		<li>Podłącz wyjście LIA2 do sprzężenia zwrotnego lasera, aby zablokować jego częstotliwość. Ten wzmacniacz mierzy skręcalność optyczną pomocniczego ogniwa cezowego w celu utrzymania częstotliwości lasera w rezonansie12. Stan ten utrzymuje się do końca pomiaru.</li>
		<li>Wtykowy generator funkcyjny FG2 do wprowadzania fali prostokątnej (500 mVpp, 100 mHz) jako sygnału odniesienia. Fala prostokątna odpowiada 100 pT i służy do konwersji prądu wyjściowego wzmacniacza na sygnał magnetyczny. Odłącz generator funkcyjny.</li>
		<li>Ustaw tryb ruchu silnika na dwukierunkowy i domyślną pozycję na 260 mm. Sprawdź stan regulatora temperatury, aby zapewnić prawidłową temperaturę (~37 °C) czujnika atomowego.</li>
		<li>Sprawdź stabilność całego systemu, mierząc dwukrotnie sygnały z pustego uchwytu na próbkę. Oceń stabilność i poziom hałasu po odjęciu dwóch ścieżek. Typowy poziom hałasu i wahania powinny wynosić ±2 pT przy czasie integracji 30 ms.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Magnesowanie próbki
	<ol>
		<li>Delikatnie umieść próbkę na stacji magnetyzującej i pozostaw ją na 2 minuty. 
		UWAGA: Stacja magnesująca składa się z magnesu trwałego (~0,5 T) i plastikowej przekładki.</li>
		<li>Umieścić próbkę z powrotem w uchwycie na próbkę. Użyj siły odśrodkowej 335,4 × g, aby usunąć niespecyficznie związane cząstki magnetyczne</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary magnetyczne po przyłożeniu sił
	<ol>
		<li>Użyj pęsety, aby załadować próbkę na silnik. Kliknij Zablokuj na panelu przednim, aby uruchomić program. W międzyczasie użyj pęsety, aby załadować drugą próbkę do uchwytu i umieścić ją w wirówce. Należy pamiętać, że strona ze szkła powlekanego powinna być skierowana w stronę środka wirówki. 
		UWAGA: Stosowana jest technika spektroskopii namagnesowania resztkowego indukowanego siłą (FIRMS), która wykorzystuje magnetometr atomowy do pomiaru sygnału magnetycznego próbki po przyłożeniu siły mechanicznej do oddziaływań molekularnych w próbce. W tym przypadku interakcje molekularne zachodzą między cząsteczkami władcy DNA a mRNA w kompleksie rybosomów. Siła jest zwiększana stopniowo poprzez zwiększanie prędkości odśrodkowej. Po przyłożeniu każdej siły silnik przekazuje próbkę do czujnika atomowego, a następnie cofa się. W ten sposób uzyskuje się dwa profile pola magnetycznego, jeden podczas skanowania do przodu, a drugi podczas skanowania wstecznego13. Tego ostatniego używamy tylko do wyodrębnienia wysokości piku ze względu na lepszy stosunek sygnału do szumu. Wysokość piku w prądzie (nA) jest przekształcana na amplitudę sygnału magnetycznego (pT) na podstawie kalibracyjnej fali prostokątnej.</li>
		<li>Każdy pomiar trwa około 5 minut. Gdy silnik powróci do 0, kliknij Zapisz na panelu przednim. Ostrożnie użyj pęsety, aby pobrać próbki z silnika i wirówki. Zastosować prędkość początkową odpowiadającą 335,4 × g (2000 obr./min, obroty na minutę dla wirówki podanej w tabeli materiałów).</li>
		<li>Zamień dwie próbki i zastosuj większą siłę, zwiększając prędkość odśrodkową o 100 obr./min lub podobny rozmiar kroku. Przetwarzaj naprzemiennie, aby stopniowo zwiększać siłę; Pełne spektrum sił uzyskuje się po 10-12 punktach danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończenie eksperymentu
	<ol>
		<li>Po zakończeniu wszystkich zaplanowanych eksperymentów wyłącz urządzenie, postępując w odwrotnej kolejności, w jakiej zostało włączone.</li>
		<li>Wyjmij próbki z uchwytu i zanurz je w etanolu w celu oczyszczenia i wykorzystania w przyszłości. Wyczyść uchwyt próbki acetonem w przypadku zanieczyszczenia kulkami magnetycznymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Otwórz skrypt analizy języka Python i wprowadź wszystkie dane eksperymentalne. Kliknij przycisk Załaduj kwadrat, aby wprowadzić falę prostokątną jako odniesienie. Następnie kliknij Załaduj linię bazową, aby wprowadzić szczątkowy sygnał magnetyczny jako tło.</li>
		<li>Zdefiniuj całkowity spadek sygnału magnetycznego jako B0. Znormalizuj każdy sygnał magnetyczny, zmniejsz B do B0 i wyraź go w procentach. Wykreślić wartość procentową (B/B0) w funkcji siły odśrodkowej, aby uzyskać widmo FIRM. 
		UWAGA: Siłę odśrodkową F oblicza się na podstawie masy wyporu kulek magnetycznych m (4,6 × 10−15 kg), prędkości odśrodkowej w i promienia wirówki r (tutaj 7,5 cm) za pomocą równania F = mw2r. Typowa rozdzielczość siły wynosi 2-4 pN, a zakres siły wynosi 15-95 pN w tej pracy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structural+dynamics+in+translocation%3A+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).</li>
<li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li>
<li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li>
<li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li>
<li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li>
<li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15(2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li>
<li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li>
<li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+DNA+rulers+reveal+an+%22mRNA+looping%22+intermediate+state+during+ribosome+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li>
<li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+%22-1%22+and+%22-2%22+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li>
<li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li>
<li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li>
<li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range%2C+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li>
<li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry%2C+translocation+and+exit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005(2008).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li>
<li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li>
<li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li>
<li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłosili żadnego potencjalnego konfliktu interesów.

W naszym teście z podwójną linijką koraliki magnetyczne odgrywają dwie zasadnicze role. Po pierwsze, służą jako przetworniki siły, ponieważ siła odśrodkowa jest proporcjonalna do ich masy wyporu. Po drugie, koraliki są nośnikami sygnału wykrywanymi przez magnetometr atomowy, który jest obecnie najdokładniejszym czujnikiem magnetycznym. Łącząc manipulację mechaniczną i detekcję magnetyczną, technika FIRMS jest w stanie rozwiązać dużą liczbę oddziaływań molekularnych w oparciu o ich krytyczne siły dysocjacji, które są pods...

Przemieszczenie biomolekularne jest podstawowym parametrem w badaniu mechanizmu powiązanych funkcji biologicznych. Jednym szczególnym przykładem jest translokacja rybosomów1,2, podczas której rybosom porusza się normalnie o dokładnie trzy nukleotydy (nt) na informacyjnym RNA (mRNA) i o jedną, dwie lub inną liczbę nt, z wyjątkiem trzech w przypadku przesunięcia ramki. Dlatego wymagana jest rozdzielczość pojedynczego nt w systemie linijki molekularnej, aby rozróżnić różne rozmiary kroków. Większym wyzwaniem jest zbadanie ruchu rybosomów zarówno po stronie wejścia, jak i wyjścia. Innymi słowy, tylko dzięki systemowi podwójnej linijki będziemy w stanie ujawnić, czy mRNA jest płynnie przewlekane przez rybosom, czy też istnieją etapy pośrednie, w których obie strony mają różne rozmiary kroków, co prowadzi do załamanej lub zapętlonej konformacji mRNA wewnątrz rybosomu.
Opracowano kilka metod, aby sprostać pierwszemu wyzwaniu, jakim jest rozwiązanie różnych etapów po stronie wyjściowej rybosomu (koniec 3' mRNA). Test podwójnej lucyferazy rozwiązuje różne ramki odczytu, mierząc proporcje wynikowych różnych białek3,4. Ma zastosowanie tylko do końca 3' mRNA, a zatem jest niewystarczający do zapewnienia pełnego obrazu translokacji. Spektrometria mas może analizować różne fragmenty peptydów w wyniku odpowiednich przegrupowań kodu5. Ale nie może wskazać, ile nt rybosom porusza się na mRNA. Test odciskania palców u nóg jest inną powszechną metodą, która wykorzystuje odwrotną transkryptazę zaszczepioną na 3'-dystalnym końcu do transkrypcji mRNA w kierunku rybosomu6. Nie ma to jednak zastosowania do końca 5' mRNA, który wchodzi do rybosomu. Inne techniki, w tym podejścia oparte na pojedynczych cząsteczkach i metody fluorescencji7, są trudne do osiągnięcia rozdzielczości pojedynczego nt.
Opracowaliśmy test podwójnej linijki DNA, który może jednoznacznie określić zarówno pozycje wejścia, jak i wyjścia odkrytego mRNA w kompleksach rybosom-mRNA. DNA linijki to oligomery DNA, które tworzą dupleksy pewnej liczby par zasad (bp) z mRNA odkrytym przez rybosom, niezależnie od tego, który koniec mRNA. Liczby bp precyzyjnie ujawniają następnie pozycję rybosomu na mRNA podczas translokacji. Liczby bp dupleksów są określane przez ich krytyczne siły dysocjacji uzyskane ze spektroskopii magnetyzacji resztkowej indukowanej siłą (FIRMS)8. Przy niepewności siły 2-3 pN, siły krytyczne są wystarczające, aby zapewnić rozdzielczość pojedynczego nt. Poprzez zaimplementowanie cząsteczki łącznikowej na linijkach DNA, można zbadać sterycznie utrudnioną stronę mRNA przez rybosom. W ten sposób można dokładnie rozwiązać różne przemieszczenia rybosomalne. Udało nam się odkryć unikalną zapętloną konformację mRNA uwięzionego przez antybiotyki podczas translokacji9 i rozwiązaliśmy różne ramki odczytu, które współistniały na śliskiej sekwencji mRNA10. W artykule opisano szczegóły testu podwójnej linijki, który obejmuje przygotowanie kompleksów rybosomów, funkcjonalizację powierzchni szkiełek szkiełkowych, immobilizację kompleksów rybosomów i ich hybrydyzację z magnetycznie znakowanymi cząsteczkami linijki DNA, detekcję magnetyczną i analizę widma sił przez FIRMS.

<table><tbody><tr><td>Taśma styrenowa</td><td>Miasto Przemysłu</td><td>MS-861</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Powłoki</td><td></td> odparowane <td>60,0 &times; 4,0 &times; 0,3 mm3</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan</td><td>UCT specialities</td><td>21400088</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>154-82</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>152-84</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Klej epoksydowy</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>ThermoFisher</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fuzydowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0756-1G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan neomycyny</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>1458009</tr><tr><td>Siarczan wiomycyny</td><td>Millipore Sigma</td><td>1715000</td><td></td></tr><tr><td>Higromycyna</td><td>invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Octan magnezu</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9434-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potas chlorek</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO</td><td>774750</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-250ML</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Milipore Sigma</td><td>G8877-100MG</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Milipore Sigma</td><td>P7127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza pirogronianowa</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1506-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7903-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptawidyna</td><td>ThermoFisher</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>mRNA Oligo</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>133899727</td><td>5&prime;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UAA AAA AAA GGA AAU AAAA AAA AUG UUU AAAA AUG UUUU UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>157468630</td><td>3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>164845370</td><td>3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA</td><td>Oligo Integrated DNA Technologies</td><td>157468628</td><td>3?-AAA, ATC, CCG, CGT, TAG, AAC, UGG, GG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>163472705</td><td>3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Zintegrowane technologie DNA 138678130</td><td></td><td>3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>138678131</td><td>3?-T, AGA, TGA, CGA, CTT, CTC, GGG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Zintegrowane technologie DNA 138678132</td><td></td><td>3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA</td><td>Oligo Zintegrowane technologie DNA</td><td>138678133</td><td>3?-GTT, AGA, TGA, CGA, CTT, CTC, GGG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ultrawirówka</td><td>Hitachi</td><td>CS150FNX</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>VM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz blokujący</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz blokujący</td> Stanford <td>Research Systems</td><td>SR830</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6918-D</td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DS345</td><td></td></tr><tr><td>Detektory fotograficzne</td><td>Thorlabs</td><td>DET36A</td><td></td></tr></tbody></table>

podwójne linijki dna do badania mechanizmu translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Translokacja rybosomów odnosi się do ruchu rybosomów na mRNA przez dokładnie trzy nukleotydy (nt), co jest centralnym etapem syntezy białek. Aby zbadać jego mechanizm, należy spełnić dwa zasadnicze wymagania techniczne. Pierwszą z nich jest rozdzielczość pojedynczego nt, która może rozwiązać normalną translokację z przesunięcia ramki, podczas której rybosom porusza się o inne niż 3 nt. Drugim jest zdolność do sondowania zarówno strony wejściowej, jak i wyjściowej mRNA w celu wyjaśnienia całego obrazu translokacji. Przedstawiamy test podwójnej linijki DNA, który opiera się na krytycznych siłach dysocjacji dupleksów DNA-mRNA, uzyskanych za pomocą spektroskopii magnetyzacji resztkowej indukowanej siłą (FIRMS). Przy rozdzielczości siły 2-4 pN test podwójnej linijki jest wystarczający do rozróżnienia różnych etapów translokacji. Wdrażając długi łącznik na sondujących DNA, mogą dotrzeć do mRNA po przeciwnej stronie rybosomu, dzięki czemu można określić pozycję mRNA dla obu stron. Dlatego test podwójnej linijki jest wyjątkowo odpowiedni do badania translokacji rybosomów i ogólnie ruchu kwasów nukleinowych. Pokazujemy reprezentatywne wyniki, które wskazywały na zapętloną konformację mRNA i rozwiązały normalną translokację z przesunięcia ramki.

Rysunek 1 przedstawia schemat detekcji oraz fotografie głównych komponentów. Detekcja magnetyczna jest realizowana za pomocą magnetometru atomowego z wykorzystaniem schematu skanowania (Rycina 1A)13Próbkę umieszcza się na pręcie zamontowanym na silniku liniowym. Silnik transportuje próbkę do czujnika atomowego znajdującego się wewnątrz osłony magnetycznej, a następnie z powrotem do miejsca początkowego w celu jej wyjęcia....

Test podwójnej linijki DNA został opracowany w celu określenia pozycji mRNA podczas translokacji rybosomów, która opiera się na siłach dysocjacji utworzonych dupleksów DNA-mRNA. Dzięki rozdzielczości pojedynczego nukleotydu i zdolności dotarcia do obu końców mRNA, może dostarczyć mechanistycznych spostrzeżeń na temat translokacji rybosomów i sondować przemieszczenia innych kwasów nukleinowych.

Podwójne linijki DNA do badania mechanizmu translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Test podwójnej linijki DNA może dostarczyć mechanistycznego wglądu w translokację rybosomów i badać przemieszczenia innych kwasów nukleinowych. Nasz test podwójnej linijki DNA jest obecnie jedyną metodą, która może obiektywnie zbadać zarówno stronę wejściową, jak i wyjściową mRNA w kompleksach rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Podobne metody stosuje się również do pomiaru siły wiązania DNA i selektywności leków chemoterapeutycznych.Wizualna demonstracja metody jest dla nas dobrą okazją, aby intuicyjnie pokazać zalety naszej techniki i pomóc innym badaczom w dalszym rozwijaniu jej w kolejne zastosowania. Na początek dobrze przygotuj plastikową próbkę za pomocą paska styrenu, wiercąc w środku sześcian o wymiarach cztery milimetry na trzy milimetry na dwa milimetry. Następnie, za pomocą żywicy epoksydowej, przyklej kawałek szkła pokrytego biotyną o długości około pięciu milimetrów do dolnej powierzchni.Dodać 20 mikrolitrów 0,25 miligrama wodnego roztworu streptawidyny na mililitr do dołka próbki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie dwukrotnie przepłukać próbkę buforem TAM10. Aby unieruchomić kompleksy rybosomów bez antybiotyków, najpierw us

dual-dna-rulers-to-study-mechanism-ribosome-translocation-with-single

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Pęsety optyczne były używane do badania fałdowania RNA poprzez rozciąganie pojedynczych cząsteczek od ich końców 5' i 3'. Tutaj opisano typowe procedury syntezy cząsteczek RNA do pęsety, kalibracji instrumentu i metod manipulowania pojedynczymi cząsteczkami.

Nanomanipulacja pojedynczymi cząsteczkami RNA za pomocą pęsety optycznej

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Opisana tutaj jest metoda litografii nanosferycznej do równoległego wytwarzania falowodów w trybie zerowym, które są układami nanoapertur w pokrytym metalem szkiełku nakrywkowym do mikroskopii szklanej do obrazowania pojedynczych cząsteczek przy stężeniach fluoroforów od nano do mikromolowych. Metoda wykorzystuje samoorganizację kryształów koloidalnych w celu stworzenia szablonu falowodu.

Wytwarzanie falowodów w trybie zerowym do mikroskopii pojedynczych cząsteczek o wysokim stężeniu

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Ten protokół przedstawia kompletny eksperymentalny przepływ pracy do badania interakcji RNA-białko za pomocą pęsety optycznej. Przedstawiono kilka możliwych konfiguracji eksperymentalnych, w tym połączenie pęsety optycznej z mikroskopią konfokalną.

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Translacja rybosomów dekoduje trzy nukleotydy na kodon na peptydy. Ich ruch wzdłuż mRNA, wychwycony przez profilowanie rybosomów, wytwarza ślady wykazujące charakterystyczną okresowość trypletową. Protokół ten opisuje, w jaki sposób używać RiboCode do rozszyfrowania tej wyróżniającej się cechy na podstawie danych profilowania rybosomów w celu identyfikacji aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu na poziomie całego transkryptomu.

De novo Identyfikacja aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu z danymi profilowania rybosomów

Protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ z uwzględnieniem polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP-FISH) w celu rozróżnienia transkryptów rybosomalnego RNA pochodzących z locus rybosomalnego DNA chromosomu X lub Y u Drosophila melanogaster.

Wykrywanie rybosomalnego RNA specyficznego dla polimorfizmu pojedynczego nukleotydu FISH u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę podwójnych linijek DNA do badania translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Technika umożliwia sondowanie obu stron mRNA w kompleksach rybosomalnych.

Podwójne linijki DNA do badania mechanizmu translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu

Przeglądaj więcej filmów