Mysi model wycięcia wyrostka robaczkowego przewlekłego raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego poprzez precyzyjną lokalizację łaty kątniczej
24 sierpnia 2019
Prezentowany protokół opisuje łatwe chirurgiczne usunięcie wyrostka robaczkowego (łaty kątniczej) u myszy, a następnie indukcję raka jelita grubego związanego z chorobą jelit grubego. Ten mysi model wyrostka robaczkowego umożliwia badanie biologicznej roli wyrostka robaczkowego w patogenezie chorób przewodu pokarmowego u ludzi.
Ogólny protokół opisuje łatwe do wykonania zabiegi chirurgiczne polegające na usunięciu wyrostka robaczkowego znanego jako plaster kątniczy u myszy. Mysi model wyrostka robaczkowego może być wykorzystany do badania biologicznych ról wyrostka robaczkowego w patogenezie choroby przewodu pokarmowego człowieka. Wyrostek robaczkowy człowieka jest narządem spornym.
Ostatnie badania sugerują, że wyrostek robaczkowy odgrywa ważną rolę w utrzymaniu zdrowia jelit. Aby zbadać biologiczną funkcję wyrostka robaczkowego, kluczowe znaczenie ma wygenerowanie modelu zwierzęcego związanego z wycięciem wyrostka robaczkowego związanego z chorobą. W tym protokole opiszemy prosty i bezpieczny etap chirurgiczny usuwania wyrostka robaczkowego, znany jako plaster kątniczy u myszy.
Aby zapewnić sukces tego modelu, należy wykonać trzy kluczowe kroki, jak zobaczysz w poniższym filmie. Najpierw zlokalizuj kątnicę myszy przed operacją. Po drugie, wykonaj małe nacięcie w jamie brzusznej.
Po trzecie, zdezynfekuj i zamknij kikut kątnicy. Pierwsza część, wycięcie wyrostka robaczkowego myszy. Przed zabiegiem należy przygotować sterylne narzędzia chirurgiczne i roztwory czyszczące.
Znieczulij i zabezpiecz mysz na platformie w pozycji leżącej, umieszczając cztery paski medycznej taśmy klejącej w poprzek kończyn, aby zapobiec ruchom posturalnym podczas operacji. Delikatnie dotknij całego brzucha myszy, aby poczuć guz. Przykryj serwetkę i zdezynfekuj ogolony obszar brzucha myszy tak szeroko, jak to możliwe, używając dwóch razy entojodu.
Wykonaj podłużne nacięcie w zakresie od 0,5 centymetra do jednego centymetra na linii środkowej brzucha. Zgodnie z wcześniej ustalonym położeniem kątnicy, poszukaj kątnicy i delikatnie wyeksterioryzuj ją na około jeden centymetr długości, aby zidentyfikować plamę kątnicy. Użyj wstępnie podgrzanej i sterylnej soli fizjologicznej, aby nawodnić jelito.
Aby zapobiec potencjalnym powikłaniom krwawienia pooperacyjnego i infekcji, należy podwiązać krezkowe naczynia krwionośne kątnicy za pomocą 8-0 szew. Uwodnić kątnicę solą fizjologiczną. Zaznacz obszar resekcji za pomocą szwu 4-0 z otwartą pętlą w pobliżu wierzchołka kątnicy na bliższej części okrężnicy.
Odetnij plaster kątnicy poniżej zaznaczonej resekcji za pomocą mikronożyczek i zetrzyj pozostałą zawartość kątnicy wacikami medycznymi. Zdezynfekuj kikut kątnicy entojodyną. Zamknij kikut szwem biegnącym za pomocą 8-0 szew.
Ostrożnie usuń pętlę z gwintem 4-0, wcześniej używaną do oznaczania resekcji na kikutu kątnicy. Wysterylizuj zszytą pozycję za pomocą entoilu. Ponownie nawodnić obszar cięcia solą fizjologiczną.
Zamknij warstwę mięśni szwem biegowym za pomocą 8-0 nić do szwów. Zamknij warstwy skóry za pomocą przerywanych szwów z nicią 4-0. Dwukrotnie zdezynfekuj cięcie chirurgiczne entojodem.
Następnie usuń jod za pomocą 75% alkoholu medycznego. Delikatnie odwróć mysz do tyłu. Podskórnie wstrzyknąć 0,1 miligrama na kilogram masy ciała buprenorfiny i 0,4 mililitra soli fizjologicznej.
I oprzyj mysz na poduszce grzewczej, aż odzyska przytomność. Umieść mysz z powrotem w sterylnej klatce i uważnie monitoruj mysz pod kątem oznak bólu przez trzy dni po operacji, aby zapewnić jej powrót do zdrowia. Część druga: Indukcja raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego za pomocą azoksymetanu, AOM i siarczanu sodu dekstranu, DSS, siedem dni po wycięciu wyrostka robaczkowego.
Rozmrozić jedną porcję AOM i rozcieńczyć ją do 1 miligrama na mililitr przy użyciu 0,9% soli fizjologicznej. Cały proces przygotowania odbywa się w dygestorium. Rozpuść cztery gramy proszku DSS w 200 mililitrach autoklawizowanego roztworu wodnego, aby przygotować 2% DSS.
W każdej klatce znajduje się pięć myszy. Wykonaj dootrzewnowe wstrzyknięcie OZUŚ w ilości 0,01 mililitra na gram na mysz w zależności od jej wagi. Zastąp wodę w autoklawie 2% DSS na pięć dni.
Myszy będą karmione wodą w autoklawie przez dodatkowe dwa cykle. Część trzecia: Wyniki. Wyniki przepływu i testu ELISA wskazują na pomyślne usunięcie łaty kątniczej.
Procedura ta może przyczynić się do znacznego zmniejszenia liczby komórek plazmatycznych swoistych dla IgA, oczywistej zmiany wydzielniczej IgA w jelicie grubym, w porównaniu do 3% DSS, który ma wysoką śmiertelność i znaczną zmianę masy ciała z powodu ciężkiego krwawego stolca, wypadania odbytu i ropnia brzucha. 2% DSS jest odpowiedni dla całego procesu ze względu na wysoki wskaźnik przeżycia do prawie 80% i rozsądną zmianę masy ciała zarówno w grupach pozorowanych, jak i po wycięciu wyrostka robaczkowego. Jak pokazano na tych obrazach, udało nam się wywołać guzy jelita grubego związane z zapaleniem jelita grubego.
Na obrazach barwienia H&E strzałka oznacza owrzodzenie błony śluzowej, grot strzałki oznacza gruczolakoraka, a biała strzałka oznacza naciek neutrofili między gruczołami. Różne stadia gruczolakoraka można zaobserwować zarówno w grupach pozorowanych, jak i wyciętych wyrostka robaczkowego. Ten ekonomiczny model wycięcia wyrostka robaczkowego u myszy może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na kilka ważnych pytań, takich jak: jaka jest rola wyrostka robaczkowego w regulacji bakterii jelitowych i jak uczestniczy w odpowiedzi immunologicznej w tkance limfatycznej związanej z jelitami.
Pamiętaj, że aby uniknąć uszkodzenia zrostu jelita, ważne jest wstępne położenie kątnicy i małe nacięcie skóry. Ponadto użyliśmy 2%DSS do wywołania zapalenia jelita grubego. Ale wyższe stężenie DSS może być stosowane w przypadku innych szczepów myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje prostą procedurę chirurgiczną usunięcia wyrostka robaczkowego u myszy, określaną jako metoda łaty kątniczego (caecal patch). Ten mysi model appendektomii ułatwia badanie biologicznej roli wyrostka robaczkowego w rozwoju chorób przewodu pokarmowego u ludzi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- gastrologia
- onkologia
Wstęp
- Funkcja ludzkiego wyrostka robaczkowego jest przedmiotem dyskusji wśród naukowców.
- Niedawne badania wskazują, że wyrostek robaczkowy może wpływać na zdrowie jelit.
- Zrozumienie roli wyrostka robaczkowego w chorobach jest kluczowe dla rozwoju badań nad układem pokarmowym.
- Stworzenie modelu appendektomii powiązanej z chorobą jest niezbędne dla tych badań.
Cel badania
- Zbadanie funkcji biologicznych wyrostka robaczkowego.
- Zbadanie związku między appendektomią a patogenezą chorób przewodu pokarmowego.
- Opracowanie modelu do badania raka jelita grubego związanego z nieswoistymi zapaleniami jelit.
Zastosowane metody
- Chirurgiczne usunięcie łatki kątnicy u myszy.
- Indukcja raka jelita grubego związanego z nieswoistymi zapaleniami jelit.
- Wykorzystanie modelu mysiego w badaniach biologicznych.
- Ocena roli wyrostka robaczkowego w rozwoju choroby.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie demonstruje bezpieczne techniki chirurgiczne.
- Ustanowienie modelu do badania roli wyrostka robaczkowego w chorobach.
- Wnioski dotyczące patogenezy chorób przewodu pokarmowego.
- Potencjalne implikacje dla zrozumienia stanu zdrowia przewodu pokarmowego u ludzi.
Wnioski
- Model appendektomii jest cennym narzędziem badawczym.
- Dalsze badania mogą wyjaśnić rolę wyrostka robaczkowego w zdrowiu i chorobach.
- Niniejsze badania mogą prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów raka jelita grubego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mysi model appendektomii umożliwia badanie mechanizmów udziału wyrostka robaczkowego w regulacji odporności jelit oraz homeostazie mikrobioty, zapewniając system istotny w kontekście chorobowym do badania patogenezy raka jelita grubego. Poprzez powiązanie appendektomii z rozwojem guzów towarzyszących colitis, model ten wspiera walidację celów terapeutycznych oraz weryfikację hipotez łączących tkankę limfatyczną z tumorigenezą. Ten model przedkliniczny ma wartość prognostyczną w ocenie interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na powiązane z jelitami szlaki immunologiczne w ramach projektów onkologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analizuje hipotezę terapeutyczną, według której wyrostek robaczkowy moduluje tkankę limfatyczną związaną z jelitami oraz odpowiedzi immunologiczne istotne dla rozwoju raka jelita grubego.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalnego modelu chirurgicznego do oceny zmian w liczbie plazmocytów IgA+ oraz wydzielniczej IgA jako biomarkerów funkcji immunologicznej jelit.
- Wartość prognostyczna: Umożliwia ocenę wpływu usunięcia wyrostka robaczkowego na inicjację i progresję nowotworu w kontekście raka związanego z zapaleniem jelit.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie standaryzowanego modelu choroby z mierzalnymi punktami końcowymi analizy histologicznej, w tym owrzodzeniem śluzówki, naciekiem neutrofili oraz stopniem zaawansowania gruczolakoraka.
- Wartość operacyjna: Wspiera przygotowanie testów poprzez spójną indukcję guzów związanych z zapaleniem jelita grubego przy użyciu DSS i AOM, co umożliwia screening związków w kontrolowanym zapalnym mikrośrodowisku.
- Wartość translacyjna: Wspomaga prace nad kwalifikacją biomarkerów poprzez korelację zmian immunologicznych (np. redukcji IgA) z histopatologicznym stopniem ciężkości choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje kontinuum od dysregulacji odpornościowej do tumorigenezy, umożliwiając badanie czynników zapalnych w raku jelita grubego.
- Wartość operacyjna: Wykazuje wysoką przeżywalność (~80%) i minimalny spadek masy ciała, co wspiera projekty badań podłużnych oraz schematy wielokrotnego dawkowania.
- Łagodzenie ryzyka: Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację zmiennej w postaci appendektomii w określonym tle genetycznym (C57BL/6) w celu oceny jej wpływu na penetrację choroby.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w przypadku czynników immunomodulujących lub modyfikujących mikrobiom.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących roli wyrostka robaczkowego w regulacji odporności jelit oraz homeostazie mikrobiologicznej z wykorzystaniem mierzalnych wskaźników immunologicznych i histopatologicznych.
- Przesiewanie: Zapewnienie ustandaryzowanego, indukowalnego modelu raka związanego z zapaleniem jelita grubego, odpowiedniego do oceny kandydatów na leki w warunkach istotnych patofizjologicznie.
- Analityka: Dostarczenie ilościowych i jakościowych odczytów, w tym cytometrii przepływowej dla komórek IgA+, testów ELISA dla wydzielniczej IgA oraz badań histologicznych w celu oceny stopnia złośliwości guza i stanu zapalnego.
- Badania translacyjne: Połączenie etapu odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie istotnej dla człowieka sekwencji choroby (od stanu zapalnego do nowotworu) w systemie podatnym na modyfikacje genetyczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Utworzenie wielokrotnego wykorzystania platformy do badania interakcji immunologiczno-onkologicznych w przewodzie pokarmowym w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu poprzez powiązanie określonej manipulacji anatomicznej (usunięcie łaty kątnicy) z mierzalnymi efektami immunologicznymi i neoplastycznymi.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowaną, skalowalną procedurę chirurgiczną z jasnymi kryteriami monitorowania pooperacyjnego, aby zapewnić powtarzalność modelu w różnych ośrodkach.
- Wartość strategiczna: Uzasadnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wglądu w mechanizmy immunologicznego promowania lub hamowania nowotworów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów immunomodulacyjnych z uwzględnieniem ryzyka poprzez walidację biologicznej aktywności istotnej dla choroby w warunkach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach chirurgicznych u myszy, w tym w ligacji naczyń i obchodzeniu się z jelitami, aby zapobiec powikłaniom pooperacyjnym.
- Niezbędne są sterylne instrumenty chirurgiczne, szwy (8-0 i 4-0), środki dezynfekcyjne (entoiodine, alkohol) oraz leki przeciwbólowe do stosowania po operacji (buprenorfina).
- Wymagane są standaryzowane protokoły opieki pooperacyjnej, w tym zapewnienie ciepła i monitorowanie bólu przez trzy dni w celu zapewnienia poprawności modelu.
- Wymagane jest precyzyjne stężenie DSS (2%) i dawkowanie AOM (0,01 mL/g), aby uzyskać powtarzalną tumorigenezę związaną z zapaleniem jelit bez nadmiernej śmiertelności.
- Stosowalność modelu może się różnić w zależności od szczepu myszy ze względu na różnice w wrażliwości na DSS, co wymaga optymalizacji specyficznej dla danego szczepu.
