Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy
19 lutego 2020
Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.
Jest to więc unikalna spektrometria mas otoczenia, szczególnie przydatna do analizy próbek biologicznych, zarówno in vitro, jak i in vivo. Ponieważ nie wymaga to regularnej specjalnej obróbki wstępnej próbek, takiej jak sortowanie komórek, frakcjonowanie i zagęszczanie, może analizować próbkę z minimalną utratą składników biologicznych, zwłaszcza tych, które występują w bardzo małej ilości. Technika ta pozwala na analizę surowców tkankowych bezpośrednio w ciągu minuty za pomocą spektrometrii mas.
Szybkość jest nieograniczona w solidności systemu, co jest główną zaletą tej techniki. Wszystko, co musisz zrobić, to przygotować krzemionkę, 10 miligramów próbki tkanek i 10 mikrolitrów proliferacji. I włóż je do jednorazowego wkładu.
Jest ustawiony na maszynę PESI-MS, a wynik otrzymasz w ciągu kilku minut. Wybierając odpowiedni spektrometr masowy, możesz dodać adnotację do tożsamości molekularnej. Aby rozpocząć, wyjmij tkankę wątroby lub nerki z zamrażarki.
Na płytce korkowej przytnij próbkę tkanki na około dwa na dwa na dwa milimetry za pomocą skalpela lub noża. Alternatywnie, wybij próbkę za pomocą trepana i przytnij długość kolumny do dwóch milimetrów. Jeśli tkanka jest zanieczyszczona krwią, przemyj ją krótko lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem.
Umieść około 10 miligramów wyciętej lub wyciętej próbki w plastikowej mikroprobówce i dodaj 100 mikrolitrów 50% etanolu. Do homogenizacji próbki należy użyć mikrotłuczka. Następnie za pomocą pipetmana umieścić 10 mikrolitrów homogenatu w studzience wkładu spektrometru masowego.
Umieść wkład w komorze jonizacyjnej spektrometru masowego z jonizacją sondy bezpośredniej i zainstaluj sondę igłową ze stali nierdzewnej, która będzie używana do jonizacji próbki. Mocno zamknij pokrywę komory, aby automatycznie aktywować urządzenie zabezpieczające. Uruchom komputer pokładowy, klikając ikonę start, aby przeanalizować, za pomocą paneli ekranowych, przyłożyć napięcie 2,3 kilowolta do igły w celu wytworzenia elektrorozpylania i upewnić się, że częstotliwość igły wynosi trzy herce.
Poczekaj 30 sekund na zakończenie pomiaru. Po zmierzeniu każdej próbki należy wyrzucić wkład i igłę do utylizatora zagrożeń biologicznych. Aby przeanalizować widma masowe, otwórz oprogramowanie skojarzone ze spektrometrem mas.
Kliknij plik L-C-D w oknie przeglądarki plików danych oprogramowania. Wybierając, kliknij pojedynczy pik okna widma masowego, aby automatycznie zobrazować E-I-C. Sprawdź TIC i EC, a następnie kliknij ikonę średniego widma, aby wybrać zakres okna czasowego do generowania widma masowego.
Eksportuj dane tekstowe widma mas. Aby przeanalizować płyny ustrojowe, pobierz do 10 mikrolitrów próbki surowicy i dozuj ją do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 190 mikrolitrów 50% etanolu do probówki, a następnie wiruj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.
Aby wyeliminować wszystkie czerwone krwinki, odwiruj płyn w temperaturze 15 000 razy G przez jedną do pięciu minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść 10 mikrolitrów supernatantu do studzienki wkładu i przystąpić do pomiaru na spektrometrze masowym, jak poprzednio. Protokół ten przedstawia przygotowanie próbki do PESI-MS na próbce stałej, próbce ciekłej i żywym zwierzęciu.
Ludzki rak nerkowokomórkowy wykazuje charakterystyczne piki obojętnych lipidów. Stwierdzono stosunkowo silne piki w widmach przy stosunku masy do ładunku wynoszącym 900 z ludzkiej tkanki raka nerkowokomórkowego, które nie zostały zidentyfikowane w otaczającej tkance nienowotworowej. Piki te reprezentują głównie triacyloglicerol.
Przykład danych uzyskanych w prawidłowych tkankach wątroby, obrazował zmianę nowotworową u pacjenta z przewlekłym zapaleniem wątroby i marskością wątroby. Surowica ludzka od trzech osób była analizowana za pomocą PESI-MS, stwierdzono wyraźne różnice we wzorcach spektralnych między osobami. W przypadku zmian metabolicznych w 5-FdU wstrzykniętym dożylnie do naczynia ogonowego myszy, osiągnięto bardzo szybkie i czułe wykrycie 5-FdU z adduktem sodu w wątrobie in situ.
Ponieważ głębokość końcówki igły od miejsca tkanki odgrywa najważniejszą rolę w jonizacji, która odczytuje pomyślne pozyskanie danych, postępuj zgodnie z instrukcjami. Możesz zidentyfikować gatunki molekularne, zaglądając do komercyjnej bazy danych. Jest to sposób na zakwalifikowanie molekularnego mechanizmu choroby.
Wielu badaczy zainteresowało się zastosowaniem tej techniki do przewidywania pomyślności choroby i jej rokowania. Zwłaszcza przy użyciu biopsji krzywicy. Tylko upewnij się, że nie zostaniesz ukłuty igłą sondy.
Można tego po prostu uniknąć za pomocą specjalnego przyrządu do wyjmowania igły z maszyny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono unikalną metodę spektrometrii mas w warunkach otoczenia do analizy próbek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia analizę surowych materiałów tkankowych bez specjalnego przygotowania wstępnego, co minimalizuje utratę komponentów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Spektrometria mas
- Analiza biologiczna
- Chemia analityczna
Wstęp
- Spektrometria mas w warunkach otoczenia nadaje się do analiz zarówno in vitro, jak i in vivo.
- Metoda ta nie wymaga rozbudowanego przygotowania próbek.
- Umożliwia ona analizę próbek przy minimalnej utracie składników biologicznych.
- Szybkość analizy jest kluczową zaletą tej techniki.
Cel badania
- Przedstawienie metody analizy cząsteczek biologicznych w czasie rzeczywistym.
- Zdemonstrowanie efektywności analizy surowych materiałów tkankowych.
- Wskazanie zalet stosowania spektrometrii mas w warunkach otoczenia (ambient mass spectrometry).
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek krzemionki i tkanek.
- Zastosowanie jednorazowych kartridży do analizy próbek.
- Bezpośrednia analiza próbek biologicznych za pomocą spektrometrii mas.
- Szybkie przetwarzanie próbek w czasie poniżej jednej minuty.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia szybką analizę bez istotnej utraty składników.
- Jest ona skuteczna w analizie próbek zawierających bardzo małe ilości materiału biologicznego.
- Wykazuje odporność i niezawodność w analizie w czasie rzeczywistym.
- Ułatwia badanie cząsteczek biologicznych w ich stanie natywnym.
Wnioski
- Spektrometria mas w warunkach otoczenia jest cennym narzędziem w analizach biologicznych.
- Technika ta pozwala na lepsze zrozumienie procesów biologicznych.
- Oferuje ona szybką i wydajną metodę analizy w czasie rzeczywistym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spektrometria mas z jonizacją przez rozpylanie z sondy (PESI-MS) umożliwia analizę molekularną próbek biologicznych w czasie rzeczywistym przy minimalnym przygotowaniu, co wspiera szybką walidację celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Technika ta wymaga jedynie 10 mg tkanki lub 10 µL surowicy, co czyni ją odpowiednią dla preklinicznych próbek o małej objętości i ogranicza utratę komponentów biologicznych. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących, dostarczając bezpośrednich danych in situ na temat dynamiki metabolitów i leków w systemach żywych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie lipidów obojętnych i metabolitów bezpośrednio z tkanek stałych, takich jak rak jasnokomórkowy nerki.
- Wartość operacyjna: Wymaga minimalnego przygotowania próbki — jedynie homogenizacji tkanki w 50% etanolu — co zmniejsza złożoność i zmienność procesu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera kwalifikację mechanizmów molekularnych poprzez dopasowanie do komercyjnych baz danych, pomagając w ocenie wiarygodności celu terapeutycznego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią analizę ludzkiego surowicy krwi po prostym wytrącaniu etanolem i wirowaniu, co pozwala na przesiewowe badanie biomarkerów w płynach ustrojowych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje jednorazowe wkłady i sondy ze stali nierdzewnej, co zapewnia standaryzację i zmniejsza ryzyko kontaminacji krzyżowej.
- Skalowalność: Ułatwia szybką analizę próbek — wyniki uzyskiwane są w ciągu kilku minut — co wspiera gotowość do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia śledzenie dynamiki metabolitów lub leków w czasie rzeczywistym w konkretnych narządach żywych zwierząt, np. detekcję 5-FdU w wątrobie myszy.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Dostarcza danych molekularnych in situ bez niszczenia tkanki, zachowując kontekst fizjologiczny dla lepszego przełożenia wyników z fazy przedklinicznej na kliniczną.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wykrywa powiązane z chorobą wzorce spektralne (np. zmiany nowotworowe w wątrobie z marskością), co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Integracja potoku i przepływu pracy
PESI-MS wpisuje się w kontinuum procesu odkrywczego – od wczesnych badań biologicznych po identyfikację związków wiodących – oferując szybkie, ilościowe odczyty molekularne, które wspierają testowanie hipotez oraz przygotowanie testów analitycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez wykrywanie tkankowo specyficznych sygnatur molekularnych (np. triacyloglicerolu w raku) bez konieczności frakcjonowania.
- Przesiewanie: Umożliwia analizę płynów i tkanek w formie gotowej do badania dzięki standaryzowanemu wprowadzaniu próbek za pomocą wkładów.
- Analityka: Generuje dane widm masowych (piki m/z, EIC, TIC) do porównań ilościowych pomiędzy różnymi warunkami i osobnikami.
- Badania translacyjne: Łączy się z walidacją przedkliniczną poprzez monitorowanie metabolitów leków in vivo, takich jak dożylne 5-FdU w żyle ogonowej myszy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wykorzystuje sprzęt wielokrotnego użytku (sondę, komorę) wraz z jednorazowymi materiałami eksploatacyjnymi, co umożliwia standaryzację pomiędzy projektami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez dostarczanie bezpośrednich danych molekularnych z nienaruszonych systemów biologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu próbek (10 mg tkanki, 10 µL surowicy, 50% etanolu) oraz stałym ustawieniom napięcia i częstotliwości (2.3 kV, 3 Hz).
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go poprzez umożliwienie szybkiej detekcji metabolitów/leków w modelach chorobowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki detekcji specyficznych dla choroby pików (np. m/z 900 w raku), które nie występują w grupach kontrolnych.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi spektrometrii mas, w tym przygotowywanie rozpuszczalników (50% etanolu) oraz korzystanie z wirówki do przetwarzania surowicy.
- Wymagany jest spektrometr mas z jonizacją za pomocą sondy bezpośredniej (Direct Probe Ionization) z kompatybilnym systemem kartridży i igłową sondą ze stali nierdzewnej.
- Konieczna jest standaryzacja obchodzenia się z próbkami w ramach zespołów – w zakresie krojenia tkanek, homogenizacji i przenoszenia nadsączu – w celu zapewnienia spójności danych.
- Należy uwzględnić głębokość wprowadzenia końcówki igły jako krytyczną zmienną wpływającą na wydajność jonizacji i jakość danych w zastosowaniach in vivo.
- Metoda jest ograniczona do próbek kompatybilnych z jonizacją w warunkach otoczenia; efekty matrycowe mogą wymagać optymalizacji w przypadku złożonych płynów biologicznych.
