Name: Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach nerwowych i tkankach mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji i DNA dot-blot. Protokół umożliwia badanie epigenetycznej regulacji ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

XL był częściowo wspierany przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFE0196600) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31771395, 31571518). Q.S. był wspierany przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFC1001703) oraz Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Prowincji Zhejiang (2017C03009). W.X. był wspierany przez Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang (LY18H020002) oraz Departament Technologii Naukowych Prowincja Zhejiang (2017C37057).

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Zhejiang.
1. Hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych i neuronów
<ol>
	<li>Wyizoluj dorosłe nerwowe komórki macierzyste z przodomózgowia dorosłego (8-10 tygodniowego) samca myszy C57/BL6, jak opisano wcześniej31,32.</li>
	<li>Hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych w pożywce DMEM/F-12 zawierającej 20 ng/ml FGF-2, 20 ng/ml EGF, 2% suplementu B27, 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego i 2 mM L-glutaminy w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Indukuj różnicowanie dorosłych nerwowych komórek macierzystych za pomocą 1 μM kwasu retinowego i 5 μM forskoliny przez 48 godzin, jak opisano wcześniej31, 32.</li>
	<li>Wyizoluj neurony z hipokampa myszy w dniu embrionalnym 17 (E17) i posiewz je za pomocą pożywki neurobazalnej zawierającej 0,25% L-glutaminy, 0,125% GlutaMax i 2% suplementu B27 w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C, jak opisano wcześniej33.</li>
</ol>
2. Perfuzja przezsercowa myszy
<ol>
	<li>Przygotować 10% hydrat chloralu, 4% paraformaldehydu (PFA) i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) na jeden dzień przed eksperymentem i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Znieczulić dorosłego samca lub samicę myszy C57 BL/6J 10% hydratem chloralu (50 mg/kg, i.p.) i upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone, sprawdzając reakcję organizmu. Przymocuj każdą kończynę taśmą klejącą do plastikowej deski (w pozycji zadrukowaną do góry).</li>
	<li>Przetnij skórę, a następnie mięsień nożyczkami chirurgicznymi. Otwórz klatkę piersiową nożyczkami chirurgicznymi. Odsłoń serce i odetnij niewielką część prawego przedsionka cienkimi nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Przelej mysz jednorazową sterylizowaną strzykawką o pojemności 10 ml z lewej komory z zimnym PBS (około 30 ml na dorosłą mysz).</li>
	<li>Przetapiaj mysz 4% PFA (około 30 ml w ciągu 10 minut na dorosłą mysz), aż stanie się sztywna.</li>
	<li>Otwórz czaszkę myszy za pomocą kleszczy kostnych. Wyjąć mózg i umieścić w 5 ml 4% PFA w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w celu późniejszego utrwalenia w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Oczyść obszar operacyjny po zakończeniu operacji.</li>
	<li>Co najmniej 24 godziny później przenieść próbki mózgu do 30% roztworu sacharozy w celu całkowitego odwodnienia w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Sekcja mózgu
<ol>
	<li>Umieścić próbki mózgu w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w małym pojemniku i schłodzić w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Próbki mózgu należy przeciąć o grubości 20-40 μm za pomocą mikrotomu kriostatu.</li>
	<li>Zebrać skrawki do PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Podnieś skrawki z docelowymi obszarami mózgu i umieść je na 24-dołkowej płytce z PBS. W przypadku hodowanych komórek na szkiełku nakrywkowym przejdź bezpośrednio do kroku 4.2.</li>
	<li>Myć PBS na shakerze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórz to jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Usunąć PBS i traktować podgrzanym 1 M HCl przez 30 minut w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Przygotuj 1 M HCl, dodając 1 ml kwasu solnego (36-38%) do 10 ml wody w kapturze chemicznym. Ogrzać 1 M HCl w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Płukać próbki PBS przez 5 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Blokuj próbki PBS zawierające 3% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100 przez 1 godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować skrawki ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. 
	nuta: Należy stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe: poliklonalne przeciwciała królika anty-5-hydroksymetylocytozynę (1:5,000), mysie przeciwciało monoklonalne anty-NeuN (1:500).</li>
	<li>Wyjąć próbki i kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Płukać próbki PBS przez 10 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi odpowiadającymi przeciwciałom pierwszorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce. Przykryj płytę aluminium. 
	nuta: Użyj następujących przeciwciał drugorzędowych: Alexa Fluor 488 kozia anty-królicza IgG (1:500), Alexa Fluor 568 kozia anty-mysia IgG (1:500). Przeciwbarwienie jąder za pomocą 4′-6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI).</li>
	<li>Umyć próbki PBS przez 10 minut na wytrząsarce. Powtórz to jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zamontuj sekcje mózgu na szkiełkach, dodaj odpowiednią ilość środka mocującego zapobiegającego blaknięciu (około 100-150 μL) i przykryj wysokiej jakości szkłem nakrywkowym. Uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą zwykłego lub konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
5. Izolacja genomowego DNA
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji dorosłą mysz C57 BL/6J (samca lub samicy) przez zwichnięcie szyjki macicy i usuń mózg.</li>
	<li>Wypreparuj tkanki hipokampa, kory i móżdżku na naczyniu chłodzonym lodem. Zmielić tkanki za pomocą młynka do tkanek w 1 ml buforu do lizy DNA i przenieść do czystej probówki do mikrowirówki. Dodać 250 μg proteinazy K na 600 μl buforu do lizy. W przypadku granulek komórkowych bezpośrednio dodaj bufor do lizy, proteinazę K i dokładnie wymieszaj. 
	nuta: Przygotuj bufor do lizy DNA: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl w 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Umyj i autoklaw młynek do tkanek przed eksperymentem.</li>
	<li>Drugiego dnia dodawać około 50 μg RNazy A na próbkę przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać równą objętość alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1) i całkowicie wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 20,817 x g przez 15 minut i usunąć supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 600 μl chloroformu do supernatantu w celu wytrącenia DNA i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 20,817 x g przez 15 minut i usunąć supernatant do innej nowej probówki.</li>
	<li>Dodać 500 μl izopropanolu do supernatantu i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 20,817 x g przez 15 minut i całkowicie usunąć supernatant.</li>
	<li>Przepłukać osad 1 ml 70% etanolu, odwirować przy 20,817 x g przez 1 minutę i całkowicie usunąć sklarowany osad. Powtórz raz.</li>
	<li>Całkowicie wysuszyć osad DNA.</li>
	<li>Rozpuść osad DNA w buforze Tris-HCl (pH 8,5) do odpowiedniego stężenia.</li>
</ol>
6. Plama punktowa DNA
<ol>
	<li>Przygotować roztwory: 2 M NaOH, bufor Tris-HCl (pH 8,5), 6x sól fizjologiczna z cytrynianu sodu (SSC).</li>
	<li>Sporządza się mieszaninę próbek zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Denaturować próbki DNA w temperaturze 100 °C przez 10 minut i schłodzić na lodzie.</li>
	<li>Przytnij odpowiedni rozmiar membrany nylonowej (np. Hybond-N+) i spłucz 6x SSC.</li>
	<li>Umieść membranę na aparacie dot-blot i podłącz do pompy próżniowej. Umieścić 6 μl mieszaniny na punkt na membranie.</li>
	<li>Hybrydyzować przez 30 minut w temperaturze 80 °C i zablokować błonę próbki mlekiem beztłuszczowym w soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) na 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: następujące przeciwciało pierwszorzędowe: poliklonalna królicza anty-5-hydroksymetylocytozyna (1:5 000).</li>
	<li>Drugiego dnia inkubować błony próbki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Myć TBS przez 10 minut. Powtórzyć to płukanie jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi (1:5 000) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć TBS przez 10 min. Powtórzyć to pranie jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Wizualizacja sygnałów chemiluminescencyjnych i ilościowe określenie intensywności sygnału.</li>
</ol>

<ol><li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li>
<li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li>
<li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li>
<li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+active+DNA+demethylation%3A+mechanism%2C+function+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li>
<li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li>
<li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li>
<li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Geneticset%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li>
<li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li>
<li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer%27s+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li>
<li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+DNA+methylation%3A+mechanisms%2C+genomics%2C+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905(2013).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903(2017).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li>
<li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).</li>
<li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

Nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe.

Modyfikacje epigenetyczne odgrywają istotną rolę podczas rozwoju, dojrzewania i funkcjonowania mózgu. Jako stabilny marker modyfikacji DNA, dynamiczny 5-hmC reaguje na adaptację behawioralną, aktywność neuronalną i jest dodatnio skorelowany z ekspresją genów; W związku z tym bierze udział w prawidłowym funkcjonowaniu mózgu i zaburzeniach neurologicznych4. Aby zbadać jego funkcję w komórkach i tkankach, konieczne jest wykrycie obecności 5-hmC i porównanie poziomu przed i po leczeniu. Tutaj zademons...

Wykazano, że modyfikacje epigenetyczne, w tym modyfikacja DNA, modyfikacja histonów i modyfikacja RNA, odgrywają kluczowe funkcje w różnych procesach biologicznych i chorobach1,2,3,4,5,6,7. Przez długi czas metylacja DNA (tj. 5-metylocytozyna (5-mC)) była postrzegana jako wysoce stabilny marker epigenetyczny i nie może być dalej modyfikowana w genomie. Niedawno stwierdzono, że 5-mC może być utleniany do 5-hydroksymetylocytozyny(5-hmC) przez białka z rodziny TET (translokacje Ten-jedenaście), w tym TET1, TET2 i TET38,9. Dalsze badania pokazują, że 5-hmC może służyć jako stabilny marker i odgrywać role biologiczne poprzez regulację ekspresji genów4,10,11,12.
Obecne dowody wskazują, że 5-hmC jest wysoce wzbogacony w tkanki/komórki neuronalne w porównaniu z innymi typami tkanek u ssaków i wykazuje dynamiczne cechy podczas rozwoju neuronów13,14. W układzie neuronalnym modyfikacje epigenetyczne za pośrednictwem 5-hmC odgrywają ważną rolę w regulacji nerwowych komórek macierzystych, aktywności neuronalnej, uczenia się i pamięci, a także biorą udział w wielu zaburzeniach neurologicznych, w tym zespole Retta, autyzmie, chorobie Alzheimera, chorobie Huntingtona itp.2,13,15,16,17,18,19,20.
Istnieje kilka podejść do wykrywania 5-hmC w komórkach i tkankach14,21,22,23,24. W tym miejscu opisujemy dwie metody wykrywania istnienia 5-hmC i ilościowego określania globalnego poziomu 5-hmC: barwienie immunofluorescencyjne i kropk-blot DNA. Te dwie metody są wygodne i czułe i zostały z powodzeniem wykorzystane w poprzednich badaniach25,26,27,28,29,30. Kluczowymi etapami tych dwóch metod jest denaturacja DNA. Do barwienia immunofluorescencyjnego 5-hmC wymagana jest wstępna obróbka próbek 1 M HCl. W przypadku 5-hmC dot-blot denaturację DNA przeprowadza się roztworem NaOH. Te dwie metody wraz z sekwencjonowaniem nowej generacji są bardzo przydatnymi narzędziami do badania funkcji 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozia anty-królicza IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 kozia anty-mysia IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>anty-5-hydroksymetylocytozyna</td><td>Aktywny motyw</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>anty-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom kriostatu</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów-podstawowy</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nylonowa (Hybond&trade;-N+ )</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>PAŹ</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: chloroform: alkohol izoamylowy (25: 24:1 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>retinowySigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

W genomie ssaków zidentyfikowano wiele modyfikacji DNA. Spośród nich intensywnie badano mechanizmy epigenetyczne za pośrednictwem 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny. 5-hydroksymetylocytozyna wykazuje cechy dynamiczne podczas embrionalnego i pourodzeniowego rozwoju mózgu, pełni funkcję regulacyjną w ekspresji genów i bierze udział w wielu zaburzeniach neurologicznych. Tutaj opisujemy szczegółowe metody, w tym barwienie immunofluorescencyjne i kropkową plamę DNA w celu wykrycia 5-hydroksymetylocytozyny w hodowanych komórkach i tkankach mózgowych myszy.

Aby ukazać rozmieszczenie 5-hmC w hipokampie dorosłych myszy, przeprowadziliśmy immunofluorescencję z przeciwciałami przeciwko komórkom neuronalnym (NeuN) oraz 5-hmC. W hipokampie 5-hmC wykazywało wyraźną kolokalizację z markerem komórek neuronalnych NeuN (Rycina 1A-H), co sugeruje wzbogacenie 5-hmC w neuronach.
Aby określić dynamikę 5-hmC podczas rozwoju neuronalnego, w pierwszej kolejności przeprowadzono analizę dot-blot z próbkami DNA wyizolowa...

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach i tkankach mózgu, wykorzystujący barwienie immunofluorescencyjne i metody dot-blot DNA.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach i tkankach mózgowych za pomocą immunofluorescencji, nowej metody i kropk-blot DNA. 5-hydroksymetylocytozyna, czyli 5hmC, łagodzi modyfikację epigenetyczną, pełni ważną funkcję w regulacji ekspresji genów i bierze udział w wielu zaburzeniach neurologicznych.W rzeczywistości nasze metody mogą być używane do wykrywania 5hmC w wielu komórkach i tkankach. Jest to wygodne i można je wykonać za pomocą zwykłego sprzętu w laboratorium. Zacznij od umieszczenia myszy ekranem do góry na plastikowej tablicy i przymocowania każdej kończyny taśmą klejącą.Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć skórę i mięśnie oraz otworzyć klatkę piersiową. Odsłoń serce i odetnij niewielką część prawego przedsionka cienkimi nożyczkami chirurgicznymi. Za pomocą 10-mililitrowej jednorazowej, wysterylizowanej strzykawki przelej mysz z lewej komory zimnym PBS.Następnie przepłucz mysz 4% PFA, aż stanie się sztywna. Następnie otwórz czaszkę kleszczami kostnymi i usuń mózg. Umieść mózg w 15-mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej pięcioma mililitrami 4% PFA i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po 24 godzinach przenieś mózg do 30% roztworu sacharozy i pozostaw go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do całkowitego odwodnienia. Przed cięciem należy zanurzyć mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia i schłodzić do minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Próbki mózgu należy przeciąć o grubości od 20 do 40 mikrometrów za pomocą mikrotomu kriostatu.Zbierz skrawki do PBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podnieś interesujące Cię sekcje mózgu i umieść je na 24-dołkowej płytce z PBS. Myj skrawki PBS na shakerze przez 10 minut.Usuń PBS i potraktuj podgrzanym jednomolowym kwasem solnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Kwas solny jest i należy go przygotować w ładowni chemicznej. Następnie przemyj próbki trzykrotnie PBS przez pięć minut i zablokuj je PBS zawierającym 3% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100.Pozostawić próbki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Dodać specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe do skrawków i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Następnego dnia wyjmij próbki i pozostaw je w temperaturze pokojowej na godzinę.Przemyć próbki trzykrotnie PBS i dodać przeciwciała drugorzędowe. Przykryj talerz aluminium i pozostaw w temperaturze pokojowej na godzinę, wstrząsając. Po inkubacji należy trzykrotnie przemyć próbki PBS i umieścić je na szkiełkach podstawowych.Dodaj od 100 do 150 mikrolitrów środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, przykryj wysokiej jakości szkłem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci. Zobrazuj skrawki mózgu za pomocą mikroskopu regularnego lub konfokalnego. Aby wyizolować genomowe DNA, zacznij od wycięcia hipokampa, kory i tkanek móżdżku na naczyniu chłodzonym lodem.Dodaj jeden mililitr buforu do lizy DNA i zmiel tkanki. Przenieść próbkę do czystej probówki do mikrowirówki i dodać 250 mikrogramów proteinazy-K na każde 600 mikrolitrów buforu do lizy. Następnie dodaj około 50 mikrogramów RNazy A na próbkę i inkubuj przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji dodać równą objętość alkoholu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego i dokładnie wymieszać. Odwirować mieszaninę zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i przenieść supernatant do nowej probówki. Dodać 600 mikrolitrów chloroformu do supernatantu, dokładnie wymieszać i odwirować zgodnie z instrukcjami manuskryptu.Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać 500 mikrolitrów izopropanolu. Dokładnie wymieszaj i ponownie odwiruj, aby wytrącić DNA. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant i przemyj osad DNA 70% etanolem zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Całkowicie wysuszyć osad DNA na powietrzu, a następnie rozpuścić go w buforze Tris-HCl. Przed rozpoczęciem należy przygotować wymagane roztwory i mieszaninę próbek zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie. Denaturuj próbkę DNA, podgrzewając ją do 100 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie umieść ją na lodzie.Wytnij odpowiedni rozmiar nylonowej membrany i przepłucz ją 6X SSC. Umieść membranę na aparacie dot-blot i podłącz pompę próżniową. Umieść sześciomikrolitrowe kropki na membranie i hybrydyzuj przez 30 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Następnie zablokuj membranę próbki mlekiem beztłuszczowym i solą fizjologiczną buforowaną tris (TBS) na jedną godzinę. Dodaj poliklonalne królicze przeciwciało anty-5-hydroksymetylocytozyny do błony i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia pozostaw membranę próbki w temperaturze pokojowej na godzinę, a następnie umyj membranę trzykrotnie TBS.Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi przez 30 minut, a następnie przemyć trzykrotnie TBS. Wizualizuj sygnały chemiluminescencji i określ ilościowo ich intensywność. Protokół ten można wykorzystać do wizualizacji 5-hydroksymetylocytozyny lub 5hmC w hipokampie dorosłych myszy.Immunofluorescencja z przeciwciałami przeciwko komórkom neuronalnym, 5hmC ujawnia, że w neuronach następuje wzbogacenie 5hmC. Dynamikę 5hmC podczas rozwoju neuronalnego można określić za pomocą testu kropkowego próbek DNA wyizolowanych z proliferujących i zróżnicowanych dorosłych nerwowych komórek macierzystych. Globalny poziom 5hmC znacznie wzrasta podczas różnicowania, a poziom 5hmC w neuronach jest wyższy niż w nerwowych komórkach macierzystych.Kluczowym etapem tej metody jest upewnienie się, że całkowita denaturacja próbek DNA.

the-detection-5-hydroxymethylcytosine-neural-stem-cells-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Opisano dwuetapowy proces znakowania z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (β-GT) w celu przeniesienia azydoglućkozy na 5-hmC, a następnie zastosowanie chemii klik w celu przeniesienia łącznika biotynowego dla łatwego i niezależnego od gęstości wzbogacenia. Ta wydajna i specyficzna metoda znakowania umożliwia wzbogacenie 5-hmC przy niezwykle niskim poziomie tła oraz wysokoprzepustowe mapowanie epigenomiczne za pomocą sekwencjonowania następnej generacji.

Selektywne wychwytywanie 5-hydroksymetylocytozyny z DNA genomowego

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Podawanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, ciężarnym myszom pozwala na analizę progresji cyklu komórkowego w komórkach nerwowych i progenitorowych w embrionalnym mózgu myszy. Metoda ta jest przydatna do określenia skutków stresu genotoksycznego, w tym promieniowania jonizującego, podczas rozwoju mózgu.

Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym

Tutaj opisujemy czułą immunochemiczną metodę mapowania przestrzennego rozkładu pochodnych utleniania 5mC opartą na użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidowego.

Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach nerwowych i tkankach mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji i DNA dot-blot. Protokół umożliwia badanie epigenetycznej regulacji ekspresji genów.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

Przeglądaj więcej filmów