Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego
January 28th, 2020
Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.
Wpływ mutacji na ekspresję genów jest często oceniany jakościowo za pomocą hybrydyzacji in situ i na ogół oceniany wizualnie, co jest subiektywne i stronnicze w stosunku do oczekiwań badacza. Ta metoda zapewnia bardziej spójny sposób porównywania eksperymentów in situ poprzez ilościowe określanie intensywności obrazu i usuwa to odchylenie. Można to również łatwo dostosować do innych systemów modelowych, które wykorzystują hybrydyzację in situ jako czytnik ekspresji genów.
Zacznij od obrazowania zarodków zarodków wybarwionych hybrydyzacją in situ lub ISH. Przygotuj roztwór glicerolu i wymieszaj go do homogenizacji. Przenieś zarodki do roztworu glicerolu za pomocą trzymililitrowej pipety Pasteura i pozostaw je na co najmniej pięć minut, aby osiadły.
Przygotuj i oznacz wystarczającą ilość probówek PCR, aby przenieść zarodki barwione ISH po obrazowaniu, a następnie użyj trzymililitrowej pipety Pasteura, aby dodać 100% glicerolu na dno szklanego szkiełka wgłębnego. Przenieś pojedynczy zarodek zabarwiony przez ISH na szklane szkiełko i ustaw go pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w kamerę cyfrową oraz oświetlenie dolne i górne. Używając pierwszego zarodka, dostosuj oświetlenie i czas ekspozycji na żądane powiększenie.
Namaluj tyle zarodków, ile jest to wymagane, i oznacz każdy obraz unikalnym numerem. Po obrazowaniu przenieś każdy zarodek do probówki PCR oznaczonej tym samym numerem i, jeśli to konieczne, odessaj nadmiar glicerolu z probówek PCR. Aby wyekstrahować DNA, dodaj 40 do 75 mikrolitrów alkalicznego buforu do lizy, takiego jak HoTSHOT, do każdej probówki.
Inkubować probówki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez około 30 minut, a następnie schłodzić je do czterech stopni Celsjusza. Dodać równą objętość buforu neutralizacyjnego i przystąpić do genotypowania dla mutacji będącej przedmiotem zainteresowania. Aby przeprowadzić analizę obrazu, wybierz i otwórz obraz w Fidżi i odwróć go, klikając Edytuj, a następnie Odwróć, a następnie przekonwertuj typ obrazu na 8-bitowy, klikając kartę Obraz, wybierając Typ i wybierając opcję 8-bitowy.
Wybierz narzędzie wielokąta i ręcznie narysuj obszar zainteresowania lub ROI na obrazie wokół obszaru, który zawiera sygnał ISH, który ma być mierzony. Naciśnij T, aby otworzyć Menedżera zwrotu z inwestycji i wybierz interesujący Cię region, a następnie kliknij przycisk Zmierz. Skopiuj średnią wartość z okna Wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
Aby zmierzyć intensywność tła, przenieś ROI do regionu zarodka, w którym nie ma barwienia, a następnie kliknij przycisk Dodaj w Menedżerze ROI. Wybierz region tła i kliknij przycisk Zmierz, a następnie zapisz średnią wartość intensywności w arkuszu kalkulacyjnym. Uzyskaj średnią intensywność pikseli sygnału hybrydyzacji NC2, odejmując średnią intensywność tła od intensywności barwionego obszaru.
Po określeniu średniej intensywności pikseli każdej próbki, przypisz genotyp do każdej próbki. Jeżeli nie można określić genotypu, należy wyłączyć próbkę z dalszej analizy. Posortuj średnie wartości intensywności próbki według genotypu i przystąp do testów statystycznych.
Użyteczność tej techniki została zademonstrowana na ISH dla dnmt3bb. 1 w zarodkach z heterozygotycznego krzyżowania runx1. Spadek dnmt3bb.
Ekspresję 1 wykryto u homozygotycznych mutantów Runx1, podczas gdy heterozygotyczne zarodki nie wykazały istotnych różnic w ekspresji DNMT3BB. 1. Próbując określić wpływ mutacji lmo4 na ekspresję runx1, analiza ta nie wykazała istotnych różnic w ekspresji między mutantami lmo4 typu dzikiego i homozygotycznego.
Jednak niewielki spadek ekspresji runx1 wykryto za pomocą qPCR z pojedynczego zarodka. W około 0,4% zarodków badanych metodą runx1 ISH miał wysokie tło, które skutkowało liczbą ujemną, gdy zostało odjęte od sygnału. W takich przypadkach zarodki zostały wykluczone z analizy.
Cztery różne regiony na zarodkach zostały przetestowane w celu optymalizacji korekt tła. Chociaż istniała stosunkowo stabilna różnica w intensywności ROI w którymkolwiek z obszarów tła, R3 zawsze wykazywał wyższą intensywność niż ROI i nie powinien być używany do korekcji tła. R1 i R4 okazały się najodpowiedniejszymi obszarami do korekcji tła.
Ważne jest, aby znaleźć najlepsze warunki do obrazowania i utrzymać je w niezmienionej formie przez cały czas trwania eksperymentu. Zalecamy również ilościowe określenie intensywności pikseli przed przypisaniem genotypu do każdej próbki.
Przegląd
W tym artykule przedstawiona jest metoda równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u ryb zebrowatych. Wykorzystując to pozbawione uprzedzeń podejście, badacze mogą osiągnąć większą dokładność w analizach fenotypowych.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Genetyka
- Biologia Rozwojowa
Tło
- Technologie edycji genów umożliwiają generowanie mutantów u ryb zebrowatych.
- Hybrydyzacja in situ jest powszechną metodą oceny ekspresji genów.
- Tradycyjne metody oznaczania mogą wprowadzać stronniczość i subiektywizm.
- Niniejsze badanie ma na celu dostarczenie bardziej spójnego i ilościowego podejścia.
Cel Badania
- Poprawa dokładności analiz fenotypowych u ryb zebrowatych.
- Dostarczenie ustandaryzowanej metody genotypowania zarodków.
- Obiektywne skwantyfikowanie sygnałów hybrydyzacji in situ.
Wykorzystane Metody
- Obrazowanie barwionych ISH zarodków za pomocą stereomikroskopu.
- Przygotowywanie roztworów glikolu do transferu zarodków.
- Wykorzystanie buforu alkalicznej lizy do ekstrakcji DNA.
- Zastosowanie oprogramowania Fiji do analizy obrazów i kwantyfikacji.
Główne Wyniki
- Wykazano zmniejszenie ekspresji dnmt3bb.1 u mutantów homozygotycznych runx1.
- Zidentyfikowano odpowiednie obszary korekcji tła do analizy obrazów.
- Nie zaobserwowano istotnych różnic w ekspresji między typem dzikim a mutantami homozygotycznymi lmo4.
- Dostarczono wiarygodną metodę przypisywania genotypów na podstawie intensywności pikseli.
Wnioski
- Metoda zwiększa wiarygodność analizy ekspresji genów.
- Może być dostosowana do użytku w innych modelach systemów.
- Utrzymywanie spójnych warunków obrazowania ma kluczowe znaczenie dla dokładnych wyników.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
