Name: Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj izolację, transfekcję i hodowlę pierwotnych ludzkich monocytów w badaniach immunologicznych HIV. Ta metoda umożliwia analizę funkcji monocytów i mechanizmów dysfunkcji odpornościowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować HIV Clinical/Tumor Biorepository Core za dostarczenie próbek od pacjentów oraz Cellular Immunology Metabolism Core za dostarczenie analizy cytometrii przepływowej. Ten projekt został sfinansowany przez NIH P20GM121288 i P30GM114732.

Wszystkie opisane poniżej metody zostały zatwierdzone przez Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Stanowego Luizjany w Nowym Orleanie. Cała krew została pobrana po uzyskaniu świadomej zgody.
UWAGA: Cała procedura jest wykonywana w sterylnych warunkach w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), dlatego należy zachować ostrożność przy obchodzeniu się z materiałami biologicznymi. W szczególności każdy etap jest wykonywany przy użyciu sterylnych technik pod kabiną bezpieczeństwa biologicznego. Po każdym etapie pipetowania krwi, produktów krwiopochodnych, komórek lub produktów komórkowych ważne jest, aby przed właściwą utylizacją wypłukać wszystkie tworzywa sztuczne (tj. pipety serologiczne, końcówki do pipet i tubki) 10% wybielaczem z pojemnika na odpady wewnątrz okapu.
1. Izolacja pierwotnych monocytów człowieka metodą negatywnej selekcji immunomagnetycznej
<ol>
	<li>Zbierz 40 ml świeżej, ludzkiej krwi pełnej (od pacjenta z HIV+ lub zdrowej grupy kontrolnej) w czterech probówkach próżniowych z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) o pojemności 10 ml (10 ml krwi na probówkę). Stosując sterylne techniki pod kabiną bezpieczeństwa biologicznego, przenieś wszystkie 40 ml krwi do jednej stożkowej probówki propylenowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Postępując zgodnie z protokołem producenta dla wybranego zestawu do izolacji monocytów ludzkich (tabela materiałów), dodaj 2 ml koktajlu do izolacji monocytów, dostarczonego w zestawie, do probówki z krwią. Kulki magnetyczne Vortex, również znajdujące się w zestawie, przez 30 s i dodaj 2 ml do probówki z krwią.
	<ol>
		<li>Jeśli dostępnych jest mniej niż 40 ml krwi, zmniejsz ilość dodanych odczynników. Aby wymieszać roztwór, pipetować w górę i w dół plastikową pipetą serologiczną o pojemności 25 ml i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podzielić mieszaninę krwi równomiernie na cztery probówki o pojemności 50 ml i dodać 30 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającego 1 mM EDTA do każdej probówki. Mieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą plastikowej pipety serologicznej o pojemności 25 ml.</li>
	<li>Umieść probówki w uchwytach magnetycznych na 10 minut, aby usunąć kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami. Użyj jednocześnie czterech uchwytów magnetycznych, po jednym dla każdej probówki, aby zapewnić stały czas inkubacji i izolacji dla każdej próbki krwi.</li>
	<li>Pobrać zawartość ze środka każdej probówki za pomocą pipety, gdy nadal znajduje się w uchwytach magnetycznych. Należy uważać, aby nie pobrać czerwonych krwinek (nie więcej niż 10% początkowej objętości 10 ml) i umieścić ich zawartość w jednej z czterech nowych probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 500 μl wirowanych kulek magnetycznych do każdej probówki o pojemności 50 ml. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 25 ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie umieść rurki w uchwytach magnetycznych na 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś zawartość ze środka każdej probówki, nadal w uchwytach magnetycznych, do jednej z czterech nowych probówek o pojemności 50 ml. Umieść każdą nową probówkę o pojemności 50 ml bezpośrednio w uchwytach magnetycznych na 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś zawartość ze środka każdej probówki do jednej z czterech nowych probówek o pojemności 50 ml. Wiruj wszystkie nowe probówki o pojemności 50 ml przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić wszystkie cztery granulki komórkowe w łącznej objętości 10 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Policz komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: 8-20 x 106 komórek uzyskuje się zwykle z 40 ml krwi pełnej.</li>
</ol>
2. Hodowla pierwotnych monocytów ludzkich
<ol>
	<li>Używając łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ciepłe pożywki RPMI 1640 bez surowicy uzupełnione 1% penicyliną-streptomycyną (wstrzykiwacz/paciorkowiec) i (kontynuując stosowanie sterylnych technik w komorze bezpieczeństwa biologicznego) ponownie zawiesić izolowane monocyty w tej pożywce w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml zawieszonych komórek do każdego dołka na płytce 6-dołkowej lub do naczynia o średnicy 35 mm (ostateczna liczba komórek powinna wynosić 1 x 106 komórek/płytkę) i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Odczekaj 0,5-1,0 godziny, aż komórki się przylgną.</li>
	<li>Używając łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ogrzej inaktywowaną termicznie (HI) płodową surowicę bydlęcą (FBS). Dodać 100 μl (10% stężenia końcowego) FBS do każdej płytki. Dodaj czynniki wzrostu do komórek, aby promować różnicowanie makrofagów.
	<ol>
		<li>Przygotuj makrofagi do fenotypu podobnego do M1, dodając 25 ng / ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) do pożywki. Przygotuj makrofagi dla fenotypu podobnego do M2, dodając 50 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) do media28. 
		UWAGA: Zarówno GM-CSF, jak i M-CSF umożliwiają różnicowanie monocytów do ogólnego fenotypu makrofagów (M0), jednocześnie przygotowując komórki odpowiednio do M1 lub M27,28,30.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transfekcja pierwotnych ludzkich monocytów w hodowli
<ol>
	<li>Transfekcyjne monocyty z mimikami lub inhibitorami miRNA lub siRNA przy użyciu zestawu zawierającego odczynnik do transfekcji na bazie polimeru (tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Postępując zgodnie z protokołem producenta dotyczącym zestawu do transfekcji (i kontynuując stosowanie sterylnych technik w komorze bezpieczeństwa biologicznego), najpierw rozcieńczyć wybrane mimiki/inhibitory miRNA lub siRNA w buforze do końcowego stężenia 1,83 μM. Przygotować 10 μl rozcieńczonego mimika/inhibitora na transfekcję 1 x 106 komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować odczynnik do transfekcji, dodając 1 μl dostarczonego polimeru do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie natychmiast dodając 90 μl dostarczonego buforu (w sumie 91 μl odczynnika na transfekcję). Wir przez 3-5 s.</li>
	<li>Odpipetować 90 μl roztworu do transfekcji do probówki zawierającej 10 μl rozcieńczonego mimiku/inhibitora miRNA lub siRNA. Wymieszać delikatnie pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>Dodać 100 μl kompleksu transfekcji do jednego dołka (lub naczynia) z 1 x 106 posianych monocytów. Inkubować komórki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie zastąpić pożywkę 3 ml kompletnej pożywki (RPMI 1640 uzupełnionej 1% penicyliny-streptomycyny i 10% inaktywowanego termicznie FBS) zawierającej GM-CSF lub M-CSF.</li>
</ol>
4. Różnicowanie i aktywacja M1/M2
<ol>
	<li>Monocyty natychmiast zaczynają różnicować się do szerokich makrofagów M0 po posianiu w hodowli. Trzeciego dnia po posiewie kontynuuj stosowanie sterylnych technik w komorze bezpieczeństwa biologicznego i zastąp pożywkę 3 ml świeżej pożywki RMPI 1640 (uzupełnionej 1% penicyliną-streptomycyną, 10% inaktywowanym termicznie FBS i 25 ng / mL GM-CSF w celu promowania polaryzacji podobnej do M1 lub 50 ng / mL M-CSF w celu promowania polaryzacji podobnej do M2). Hodować komórki w tych warunkach przez łącznie 6 dni od początkowego posiewu w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Aby przyspieszyć polaryzację przygotowanych komórek do fenotypu makrofagów M1, aktywuj komórki w 6 dniu inkubacji, zastępując pożywkę komórkową nową pożywką zawierającą 5% inaktywowanego termicznie FBS, 1% pen / strep, 100 ng / ml lipopolisacharydu pochodzącego z E. coli (LPS) i 20 ng / ml interferonu gamma (IFN-γ).</li>
	<li>Aby przyspieszyć polaryzację zaszczepionych komórek do fenotypu makrofagów M2, aktywuj komórki w 6 dniu inkubacji, zastępując pożywkę komórkową nową pożywką zawierającą 5% inaktywowanego termicznie FBS, 1% pen / paciorkowca, 10 ng / mL M-CSF i 20 ng / ml interleukiny 4 (IL-4).</li>
	<li>Po 24 godzinach zbierz komórki do analiz RNA, białka lub cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Gdy komórki są gotowe do pobrania, umyj komórki w naczyniu 2x PBS (w temperaturze RT do ekstrakcji RNA lub schłodzone na lodzie w celu ekstrakcji białka). Ponieważ zróżnicowane makrofagi są teraz mocno przyczepione do płytek, należy poddać je bezpośredniej lizie w płytkach, aby uzyskać materiał do analizy RNA i białek.</li>
		<li>W celu zebrania materiału do cytometrii przepływowej należy dodać PBS zawierający 2 mM EDTA do szalki, inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie zeskrobać komórki z naczynia i zebrać zawartość w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przed przystąpieniem do standardowych protokołów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Przepłukać komórki w PBS, aby usunąć pożywkę hodowlaną. Odwiruj 100 000 komórek (na każdy warunek cytometrii przepływowej) i ponownie zawieś osad w 100 μl PBS zawierającym 2 μl inhibitora wiązania HuFcR. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 50 μl buforu barwiącego i pożądane przeciwciała (w tym przypadku zastosowano CD80, CD83, CD163 i CD209) w zalecanych ilościach.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć 2x PBS i ponownie zawiesić wybarwione komórki w 150 μl PBS przed uruchomieniem próbki na cytofluorymetrze.</li>
</ol>

<ol><li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+International%22%5BJournal%5D)">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638(2016).</li>
<li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+the+Macrophage%3A+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li>
<li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li>
<li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Monocyte%2FMacrophages+during+HIV%2FSIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693(2017).</li>
<li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells%3A+Contribution+to+HIV+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+M1%2FM2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264(2013).</li>
<li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097(2017).</li>
<li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage+polarization+in+vitro%3A+maturation+and+activation+methods+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li>
<li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li>
<li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li>
<li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li>
<li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li>
<li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses%3A+possible+pathogenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li>
<li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li>
<li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li>
<li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15(2016).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection%3A+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852(2015).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175(2018).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing%3A+A+Pilot+Study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li>
<li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li>
<li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535(2014).</li>
<li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li>
<li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593(2015).</li>
<li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic%2C+functional%2C+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Prezentowany protokół demonstruje wykorzystanie komórek pierwotnych od osób zakażonych wirusem HIV jako modelu do badania monocytów i makrofagów. Pacjenci z HIV+ poddawani cART żyją z infekcją przez wiele lat i mogą mieć również inne koinfekcje związane z upośledzonym układem odpornościowym. Aby zbadać immunomodulację w obecności przewlekłego zakażenia wirusem HIV, komórki pobrano bezpośrednio od pacjentów. Ponieważ wykazano, że miRNA odgrywają główną rolę w rozwoju i różnicowaniu komórek, protokół koncentruje...

Zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 (HIV-1) powoduje ciężką dysfunkcję immunologiczną, która może prowadzić do infekcji oportunistycznych i zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS). Chociaż pacjenci zakażeni wirusem HIV poddawani cART charakteryzują się niskim mianem wirusa i prawidłową liczbą limfocytów T CD4 +, funkcjonowanie układu odpornościowego może być u tych osób zaburzone, prowadząc do dysfunkcyjnej odpowiedzi immunologicznej, która wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka1. Mechanizmy dysfunkcji immunologicznej u pacjentów zakażonych wirusem HIV przyjmujących cART pozostają w dużej mierze nieznane. Dlatego scharakteryzowanie komórek odpornościowych pochodzących od pacjenta oraz badanie ich biologii i funkcji jest kluczowym elementem obecnych badań nad HIV.
Monocyty i makrofagi są kluczowymi regulatorami odpowiedzi immunologicznej i odgrywają fundamentalne role w zakażeniu wirusem HIV2,3,4,5. Makrofagi, z natury niejednorodne i plastyczne, można ogólnie podzielić na klasycznie aktywowane (M1) lub alternatywnie aktywowane (M2). Chociaż ta ogólna klasyfikacja jest konieczna przy ustalaniu warunków eksperymentalnych, status polaryzacji makrofagów może być odwrócony przez różne cytokiny6,7,8,9. Chociaż w kilku badaniach analizowano wpływ zakażenia wirusem HIV na monocyty i komórki dendrytyczne, szczegóły molekularne odpowiedzi za pośrednictwem monocytów są w dużej mierze nieznane6,7,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19. Wśród czynników zaangażowanych w regulację i funkcjonowanie komórek odpornościowych, wykazano, że mikroRNA (miRNA), krótkie niekodujące RNA, które po transkrypcji regulują ekspresję genów, odgrywają ważną rolę w kontekście głównych szlaków komórkowych (tj. wzrostu, różnicowania, rozwoju i apoptozy)20. Cząsteczki te zostały opisane jako ważne regulatory czynników transkrypcyjnych niezbędnych do dyktowania funkcjonalnej polaryzacji makrofagów21. Potencjalna rola miRNA w monocytach od osób zakażonych wirusem HIV poddawanych cART została zbadana, ale postęp w tej dziedzinie wymaga znacznie więcej pracy22,23,24,25,26. W artykule omówiono zoptymalizowaną metodę transfekcji miRNA i siRNA do pierwotnych ludzkich monocytów od pacjentów zakażonych wirusem HIV i osób z grupy kontrolnej.
Ten protokół opiera się na dostępnych na rynku odczynnikach i zestawach, ponieważ ciągłość procedury technicznej pomaga wyeliminować niepotrzebne zmienne eksperymentalne podczas pracy z próbkami klinicznymi. Niemniej jednak metoda dostarcza ważnych wskazówek (tj. liczby posianych komórek lub krótkiej inkubacji z pożywką bez surowicy w celu promowania przylegania komórek do płytki). Ponadto warunki polaryzacji używane w tym protokole pochodzą z opublikowanego work27,28,29.

<table><tbody><tr><td>0,5 m EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Plastikowe probówki do pobierania krwi z K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>CD14 PerCP</td><td>Invitrogen</td><td>46-0149-42</td><td>Cytometria przepływowa - przeciwciało sprzężone</td></tr><tr><td>CD163 BV711</td><td>BD Horizon</td><td>563889</td><td>Cytometria przepływowa - przeciwciało sprzężone</td></tr><tr><td>CD209 BV421</td><td>BD Horizon</td><td>564127</td><td>Cytometria przepływowa - przeciwciało sprzężone</td></tr><tr><td>CD80 FITC</td><td>BD Horizon</td><td>557226</td><td>Cytometria przepływowa - przeciwciało sprzężone</td></tr><tr><td>CD83 APC</td><td>BD Horizon</td><td>551073</td><td>Cytometria przepływowa - przeciwciało sprzężone</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji monocytów ludzkich Easy Sep Direct</td><td>StemCell Technologies</td><td>19669</td><td></td></tr><tr>EIF4EBP1 <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>mAb</td><td>9644</td><td>Przeciwciało monoklonalne dla Western blot</td></tr><tr><td>EIF4EBP1 siRNA Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-29594</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica Bovin Zdefiniowana inaktywowana termicznie</td><td>hyklon</td><td>SH30070.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Cytometr przepływowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43618</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47724</td><td>Przeciwciało monoklonalne przeciwko</td></tr><tr><td>inhibitorowi wiązania Western blot HuFcR</td><td>eBiosciences</td><td>14-9161-73</td><td>Bufor blokujący cytometrię przepływową</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy Kaluza Beckman</td><td>Coulter</td><td>B16406</td><td>Oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Escherichia coli O55:B5</td><td>Sigma</td><td>L4524</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA mikroRNA Naśladuje has-miR-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>YM00472124</td><td></td></tr><tr><td>MISJA miRNA Kontrola negatywna</td><td>Sigma</td><td>HMC0002</td><td>Zaszyfrowane miRNA sprzężone z barwnikiem bliskiej podczerwieni</td></tr><tr><td>Nunc 35mm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki GM-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>215-GM-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IFN-&gamma;</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-4</td><td>R& D Systems</td><td>204-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki M-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>216-MC-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 z L-glutaminą</td><td>Corning</td><td>10040CVMP</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled Control siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Blue Zestaw odczynników do transfekcji</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Odczynnik do proliferacji komórek</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td>Test kolorymetryczny do oceny żywotności komórek</td></tr></tbody></table>

izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) pozostaje poważnym problemem zdrowotnym, pomimo wprowadzenia skojarzonej terapii antyretrowirusowej (cART) w połowie lat 90. Podczas gdy terapia antyretrowirusowa skutecznie obniża ogólnoustrojowe miano wirusa i przywraca prawidłową liczbę limfocytów T CD4+, nie odtwarza w pełni funkcjonalnego układu odpornościowego. Dysfunkcyjny układ odpornościowy u osób zakażonych wirusem HIV poddawanych cART może charakteryzować się aktywacją immunologiczną, wczesnym starzeniem się komórek odpornościowych lub utrzymującym się stanem zapalnym. Schorzenia te, wraz ze współistniejącymi czynnikami związanymi z zakażeniem wirusem HIV, komplikują chorobę, której nie można łatwo odtworzyć w modelach komórkowych i zwierzęcych. Aby zbadać zdarzenia molekularne leżące u podstaw dysfunkcji immunologicznej u tych pacjentów, przedstawiono system do hodowli i manipulowania ludzkimi pierwotnymi monocytami in vitro. W szczególności protokół pozwala na hodowlę i transfekcję pierwotnych monocytów CD14 + uzyskanych od osób zakażonych wirusem HIV poddawanych cART, a także z kontroli ujemnych pod względem HIV. Metoda polega na izolacji, hodowli i transfekcji monocytów i makrofagów pochodzących z monocytów. Chociaż stosowane są dostępne na rynku zestawy i odczynniki, protokół zapewnia ważne wskazówki i zoptymalizowane warunki dla skutecznego przylegania i transfekcji monocytów z mimikami i inhibitorami miRNA, a także z siRNA.

Zastosowano opisaną procedurę w celu wyizolowania pierwotnych ludzkich monocytów od osób zakażonych HIV oraz zdrowych dawców. Wszystkie przedstawione tutaj dane uzyskano od osób HIV+ przechodzących terapię cART z niską (&lt;20 kopii/mL) lub niewykrywalną wiremią oraz prawidłową liczbą limfocytów T CD4+. Bezpośrednio po izolacji komórki poddano barwieniu, a następnie wykonano cytometrię przepływową w celu potwierdzenia czystości populacji komórkowych. Wyniki wykazały,...

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

Zakażenie wirusem HIV powoduje dysfunkcję układu odpornościowego nawet u osób poddawanych terapii antyretrowirusowej, u których nie ma wykrywalnego wirusa. Metoda ta pozwala na badanie funkcji monocytów, które są kluczowymi regulatorami odpowiedzi immunologicznej. Zoptymalizowaliśmy tę technikę pod kątem izolacji, hodowli i transfekcji ludzkich pierwotnych monocytów.Używamy tej metody, aby zrozumieć molekularne mechanizmy dysfunkcji immunologicznej u osób zakażonych wirusem HIV, ale można ją zastosować do wszelkich innych badań immunologicznych z udziałem monocytów. Jeśli po raz pierwszy pracujesz z ludzką krwią, pamiętaj o przestrzeganiu odpowiednich protokołów bezpieczeństwa biologicznego i traktowaniu wszystkich próbek jako materiału potencjalnie zakaźnego. Po zebraniu 40 mililitrów świeżej ludzkiej krwi pełnej w czterech 10-mililitrowych probówkach próżniowych EDTA, użyj sterylnej techniki, aby przenieść całą krew do jednej 50-mililitrowej stożkowej probówki propylenowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Postępując zgodnie z instrukcjami producenta z wybranego zestawu do izolacji monocytów ludzkich, dodaj dwa mililitry koktajlu do izolacji monocytów z zestawu do probówki z

isolation-transfection-and-culture-of-primary-human-monocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie pokazujemy izolację monocytów z pełnej krwi ludzkiej za pomocą immunomagnetycznej separacji ujemnej. Wyizolowane monocyty można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja monocytów z krwi pełnej za pomocą negatywnej selekcji immunomagnetycznej

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do tworzenia ludzkich komórek mikrogleju (iMG) pochodzących z monocytów, które umożliwiają pośrednią ocenę stanu zapalnego mózgu. Przedstawia to model komórkowy, który może być korzystny dla badań koncentrujących się na potencjalnym zapaleniu mózgu i związanych z nim zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj izolację, transfekcję i hodowlę pierwotnych ludzkich monocytów w badaniach immunologicznych HIV. Ta metoda umożliwia analizę funkcji monocytów i mechanizmów dysfunkcji odpornościowej.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Przeglądaj więcej filmów