Zautomatyzowane sięganie pojedynczych śruin szczura z 3-wymiarową rekonstrukcją trajektorii łap i palców

Metoda ta opiera się na ustalonych protokołach docierania do szczurów w celu zautomatyzowania szkolenia i testowania, zapewniając skuteczny sposób na stosunkowo szybkie pozyskiwanie dużych zestawów danych. Minimalizuje wysiłek eksperymentatora, umożliwiając jednocześnie trójwymiarową rekonstrukcję kinematyki kończyn przednich. Kinematyka może być wykorzystana do oceny efektów interwencji precyzyjnie zaplanowanych w czasie lub skorelowana z zapisami fizjologicznymi.

Po pewnych poprawkach technikę tę można również zastosować u myszy. Zacznij od włączenia świateł i umieść szczura w komorze wprawnego sięgania. Użyj kleszczy, aby przytrzymać śrut przez szczelinę sięgającą z przodu pudełka.

Pozwól szczurowi zjeść trzy granulki z kleszczy. Następnym razem, gdy szczur spróbuje zjeść wypluwkę z kleszczy, odciągnij granulkę i powtarzaj, aż szczur sięgnie po wypluwkę jedną łapą, maksymalnie z 11 sięgnięć, co wskazuje preferencję łapy. Następnie wyrównaj pręt doprowadzający pellet z bokiem sięgającym przeciwlegle do preferowanej łapy szczura.

Umieść granulat na pręcie podającym. Następnie użyj kleszczy, aby zwabić szczura granulką, ale skieruj szczura w stronę pręta dostawczego, tak aby jego łapa uderzyła w wypluwkę na pręcie. Po tym, jak szczur spróbuje 10 sięgnąć do pręta dostawczego bez przynęty, przejdź do następnej fazy.

Następnie ustaw pręt dostarczający pellet w oparciu o preferencje łapy szczura i ustaw go w pozycji drugiej. Ustaw pozycję wysokości pręta doprowadzającego pelety za pomocą pilota siłownika. Gdy pręt podający znajdzie się na odpowiedniej wysokości, przytrzymaj żądaną liczbę, aż lampka zacznie migać na czerwono, aby ustawić.

Następnie umieść szczura w komorze i zwabić szczura do tyłu granulką. Kiedy szczur przesunie się na tyle daleko do tyłu komory, że przerwałby wiązkę podczerwieni, gdyby wersja automatyczna była uruchomiona, przesuń pręt dostarczający granulki do pozycji trzeciej. Na koniec poczekaj, aż szczur sięgnie po wypluwkę, a następnie przesuń pręt do dostarczania pelletu z powrotem do pozycji drugiej.

Umieść nowy granulat na pręcie dostawczym, jeśli zostanie strącony. Powtarzaj te kroki stopniowo, nęcąc szczura coraz mniej, aż szczur zacznie do jednego, przesuń się do tyłu, aby poprosić o pellet bez przynęty, a po drugie, natychmiast przejdź do przodu po poproszeniu o pellet z tyłu. Gdy szczur zrobi to 10 razy, rozpocznij trening nad automatycznym zadaniem.

Aby skonfigurować zautomatyzowany system, włącz światła w komorze i napełnij zbiornik na pelety. Ustaw pręt doprowadzający granulat zgodnie z preferencjami łapy szczura. Sprawdź, czy pozycje siłownika są ustawione prawidłowo.

Następnie włącz komputer i otwórz umiejętny program do docierania. Wprowadź numer identyfikacyjny szczura w obszarze tematu i wybierz preferencję łapy z menu rozwijanego dłoni. Określ ścieżkę zapisu filmów.

Następnie ustaw czas sesji i maksymalną liczbę filmów. Ustaw również czas podnoszenia granulek i włącz karę za wczesny zasięg. Następnie, aby wykonać obrazy kalibracyjne, umieść pomocną dłoń w komorze sięgającej i wbij zacisk krokodylkowy przez szczelinę sięgającą.

Przytrzymaj kostkę przed szczeliną sięgającą za pomocą zacisku krokodylkowego. Następnie ustaw sześcian tak, aby czerwona strona pojawiła się w górnym lustrze, zielona strona w lewym lustrze, a niebieska strona w prawym lustrze. W programie behawioralnym upewnij się, że próg zwrotu z inwestycji jest ustawiony na bardzo dużą wartość.

Kliknij przycisk uruchamiania, a gdy przycisk inicjalizacji kamery zmieni kolor na zielony, naciśnij start, aby rozpocząć pobieranie wideo. Kliknij opcję Cal Mode (Tryb kalibracji), a następnie zrób zdjęcie, klikając opcję Take Cal Image (Zrób zdjęcie kalibracji). Przesuń lekko kostkę i zrób kolejny obraz.

Powtórz tę czynność, aby uzyskać łącznie trzy obrazy. Na koniec zatrzymaj program, klikając stop, a następnie kliknij przycisk znaku stop. Wyjmij pomocną dłoń i kostkę z pudełka.

Uważaj, aby nie uderzyć w nic w komorze behawioralnej po wykonaniu zdjęć kalibracyjnych tego dnia. Najpierw umieść szczura w komorze wprawnego sięgania. Kliknij białą strzałkę, aby uruchomić program.

Następnie ustaw pozycję ROI do wykrywania łapy, dostosowując przesunięcie x, przesunięcie y, szerokość ROI i wysokość ROI. Umieść ROI w lusterku bocznym, które pokazuje grzbiet łapy bezpośrednio przed szczeliną sięgającą i kliknij start, aby rozpocząć program. Gdy szczur nie zbliża się, dostosuj dolną wartość progową ROI, aż wartość wyzwalacza ROI na żywo będzie oscylować między zerem a jeden.

Następnie ustaw próg ROI tak, aby był znacznie większy niż wartość wyzwalająca ROI na żywo podczas szturchnięć nosem i niższy niż wartość wyzwalacza ROI na żywo, gdy szczur osiągnie. Dostosuj, aż filmy będą konsekwentnie uruchamiane, gdy szczur dotrze, ale nie wtedy, gdy wsadzi nos przez szczelinę. Monitoruj kilka pierwszych prób, aby upewnić się, że wszystko działa poprawnie.

Kiedy szczur dociera przed poproszeniem o granulkę, obserwuj, jak rośnie liczba wczesnych uderzeń. Kiedy szczur dotrze po prośbie o granulkę, obserwuj, jak liczba filmów rośnie, podczas gdy kopia filmu jest zapisywana jako plik kosza. Na koniec, po osiągnięciu czasu sesji lub maksymalnej liczby filmów, naciśnij przycisk znaku stop.

Wyniki wskazują, że po 20 dniach szczury nabywają umiejętności sięgania. W tym miejscu pokazane są trajektorie zasięgu z pojedynczej sesji. Stanowi to tylko początkowy postęp łapy dla ułatwienia prezentacji.

Ponadto, jeśli wyzwalacz wykrywania łapy nie jest dokładnie ustawiony, istnieje znaczna zmienność w klatce, w której łapa narusza szczelinę sięgania, co może prowadzić do zmienności w tym, kiedy interwencje są wyzwalane podczas ruchów sięgania. Poza ostrożnym obchodzeniem się ze zwierzętami, w niniejszym protokole nie zostaną podjęte żadne środki ostrożności. Najważniejsze jest prawidłowe ustawienie progu ROI, aby filmy lub inne interwencje były uruchamiane w odpowiednich momentach.

Metodę tę można połączyć z kilkoma innymi technikami, takimi jak optogenetyka, obrazowanie wapnia i modele genetyczne, które mogą odpowiadać na pytania od podstawowej kontroli motorycznej po patofizjologię zaburzeń ruchowych. Technika ta pozwala na korelację szczegółowej kinematyki zasięgu i uchwycenia z zapisami fizjologicznymi lub interwencjami, umożliwiając naukowcom nie tylko odpowiedź na pytanie, czy, ale także w jaki sposób ruchy zmieniają się wraz ze zmianami obwodów neuronalnych.